专利名称：脱氢水飞蓟宾在制备抗肺癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域。具体而言，本发明涉及7位和20位 异戊烯基取代的脱氢水飞蓟宾双醚衍生物的制备及其用于制备抗肿 瘤药物的用途，该化合物具有体外显著抑制人肺癌细胞A549的活性， 其抑制活性超过阳性对照用药顺铂；同时该水飞蓟宾双醚对人口腔表 皮癌KB细胞也表现出强效抑制作用。以上药效学结果表明该脱氢水 飞蓟宾双醚或其可药用盐可以预期用于制备防治肿瘤性疾病特别是 口腔表皮癌及肺癌药物的用途。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病。根据世界卫生 组织报告，全世界50亿人口中，每年新发病例约900万例，因肿瘤 而死亡者达700万人，且每年还有增加的趋势。药物治疗在恶性肿瘤 的三大疗法中占有重要地位。近年来，随着分子肿瘤学、分子药理学 的不断发展，以及对肿瘤本质的阐明，大规模、快速筛选组合化学、 基因工程等先进技术的发明和应用加速了药物开发进程。在相当一段 时期，传统细胞毒性药物仍将是肿瘤药物治疗的主体，针对机制的多 环节作用的新型抗肿瘤药物成为目前国内外关注的热点。
水飞蓟是少数几个在临床上广泛应用的天然药物之一。Silymarin (水飞蓟素)和Silybin (水飞蓟宾)都是菊科植物水飞蓟&7>^m (L.)Gaertn中提取得到的物质。水飞蓟素已收入我国药典。 水飞蓟素为水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟丁等黄酮木质素类化合物组 成的混合物，其中水飞蓟宾含量最高。三十多年的临床实验证明该药 具有确切的疗效和低毒性(参阅Flora K.等人，^m. / GaWrae"&ro/, 1998， 93， 139-143; Sailer R.等人，Z>，， 2001, 61(14)， 2035-2063)。 虽然有报道水飞蓟素和水飞蓟宾在治疗癌症方面的应用[Ramasamy 等，C""cw丄etera， 2008， 352]，但其抗肿瘤作用的主要机理在于各种活性氧能氧化鸟嘌呤形成8-羟基鸟嘌呤，造成DNA损伤，进而 引起肿瘤，而水飞蓟宾作为一个有效的抗自由基物质显示出其预防和 治疗肿瘤的作用。
水飞蓟宾类化合物具有确切的疗效，故而以此天然药物为先导化 合物(Lead compound)进一步开发，寻找水飞蓟宾类新的衍生物， 使其能够具有更高或者更新的抗肿瘤药理活性，以期获取自主知识产 权的抗肿瘤新药，实属必要。然而，虽然说至今为止水飞蓟素和水飞 蓟宾类文献报道已经超过1500篇，但是以水飞蓟宾为母体化合物构 建出的衍生物及相关活性报道并不多见。我们前期报道了在水飞蓟宾 的B环和E换上进行了一系列衍生物的合成，发现在B环上引入甲 氧基，可显著提高其清除超氧阴离子自由基的活性[杨雷香，赵昱等， "Synthesis and Antioxidant Properties Evaluation of Novel Silybin Analogue", /owrwa/ q/"五"2y膨/"/z/6Wow awd MWc/wa/ C7zew/s/77， 2006: 21(4), 399-404.]。捷克同行在水飞蓟素和水飞蓟宾研究领域做出了不 少研究成果，他们于2006年发表的文章中叙述了在水飞蓟宾的几个 羟基上引入甲氧基可不同程度提高水飞蓟宾的抗肿瘤活性，但引入甲 氧基并不嫩提高化合物的细胞毒活性[D2ub汰，P.等， C7ze附.，2006, 14，3793]。法国研究者也报道了在水飞蓟宾A环上的C-6 及C-8位引入异戊烯基(prenyl)或香叶基(gemnyl)后，可以改变 水飞蓟宾的抗肿瘤活性[Maitrejean等，C/zew. 2000, 10, 157-160]。但是，所有文献均未曾报道直接在7、 20位羟基氧原子上 引入异戊烯基等含不饱和碳键基团后对水飞蓟宾和/或脱氢水飞蓟宾 的抗肿瘤活性影响。
常见的细胞毒类抗肿瘤药分为如下几类(1)拓扑异构酶抑制 剂如喜树碱类化合物及其半合成衍生物伊立替康和拓扑替康；高喜树 碱类化合物(homocamptothecin， HCPT)，氟替康(diflom otecan) 等。(2)胸苷酸合成酶抑制剂如雷替曲塞、AG337,多靶点抗叶酸 剂(MTA)培美曲塞(pemetrexed，商品名Alimta)等。(3)铂类
抗肿瘤药物如顺铂和第三代铂类抗肿瘤药物如奥沙利铂、萘达铂和赛 特钼(satrapiatin， JM-216)。均说明细胞毒类药物仍然具有较为广
泛的市场和确定的疗效。鉴于至今尚无相关文献报道增强了引入上述亲脂性基团后的脱氢水飞蓟宾双醚类是否能提高其抗肿瘤活性，本发 明采用体外细胞毒药效学模型对我们设计合成出的化合物进行了抗 肿瘤活性检验和药效学评价。
药理试验结果证实，我们制备得到的7位和20位异戊烯基取代 的脱氢水飞蓟宾双醚对于上述体外培养的两种人肿瘤细胞株(口腔上 皮癌细胞KB和人肺癌细胞A549)具有显著的生长抑制活性，且其 活性明显强于水飞蓟宾和脱氢水飞蓟宾，说明该7位和20位取代的 脱氢水飞蓟宾异戊烯基双醚或其可药用盐具有可期待作为防治相关 肿瘤性疾病药物之用途，由此完成本发明。

发明内容
本发明的目的是提供了具有式(I)所示结构的7位和20位异戊 烯基取代的脱氢水飞蓟宾双醚化合物2-{2，3-二氢-3-[4-(2-甲基-2-烯 丁基氧基)-3-甲氧基苯基]-2-羟甲基-l，4-苯并二氧六环-6+7-(2-甲基 -2-烯丁基氧基)-3，5,-二羟基-4//-1-苯并吡喃-4-酮，也即7,20~双(2— 甲基-2-丁烯基)-脱氢水飞蓟宾醚或其可药用盐用于制备抗肿瘤药物 的用途
其中，10， ll位同时为R构型或同时为S构型。
本发明还提供了一种用于防治肿瘤性疾病的药物或药物组合物， 其含有治疗有效量的作为活性成分的式(I)所示结构的7,20"双(2-甲基-2-丁烯基)-脱氢水飞蓟宾醚或其可药用盐和可药用辅料。
此外，本发明也提供了一种制备式(I)化合物的方法，其特征 是水飞蓟宾在碱催化下与过量的异戊烯基卤素反应制备而得；反应 温度为20°C至200°C，反应时间为10分钟至48小时；其中碱是无 机碱或有机碱，异戊烯基卤素是指异戊烯基溴；过量是指参与反应的 异戊烯基溴的摩尔数是参与同一反应的水飞蓟宾之摩尔数的三倍及三倍以上；水飞蓟宾是指非对映体的水飞蓟宾A或水飞蓟宾B或它 们的混合物。
本发明所述7,20-双(2-甲基-2-烯丁基)-脱氢水飞蓟宾醚具有 重要的生物活性，体外试验表明其对于体外培养人口腔上皮癌细胞 (KB)、人肺癌细胞(A549)之体外增值均具有强效的生长抑制活 性，可期待作为防治相关肿瘤性疾病药物的用途。
本发明的7，20-双(2-甲基-2-烯丁基)-脱氢水飞蓟宾醚或其可 药用盐还可以与已上市的细胞毒类抗肿瘤药物如喜树碱类化合物及 其半合成衍生物伊立替康和拓扑替康；高喜树碱类化合物(homocam ptothecin， HCPT)，氟替康(diflom otecan);胸苷酸合成酶抑制剂 如雷替曲塞、AG337，多靶点抗叶酸剂(MTA)培美曲塞(pemetrexed， 商品名Alimta)等；铂类抗肿瘤药物如顺铂和第三代铂类抗肿瘤药物 如奥沙利铂、萘达铂和赛特铂(satrapiatin， JM-216);以及其他机 制的抗肿瘤药物如紫杉醇(Paclitaxel)类、足叶乙苷(Etoposide)、 脱氧胞昔类吉西他滨(Gemcitabine)、长春新碱类如Vinorebine等联 合使用，制备得到具有肿瘤生长抑制作用的抗肿瘤组合物，可用于治 疗多种肿瘤疾病。
7，20-双(2-甲基-2-烯丁基)-脱氢水飞蓟宾或其可药用盐可以与 药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有抗肿瘤用途的药物组合 物。上述药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊、贴片、皮下植埋 剂等剂型，或其他采用公知理论和技术制备的控释、缓释剂型以及纳 米制剂。
本发明的有益之处在于提供了 7位和20位取代的脱氢水飞蓟 宾异戊烯基双醚在制备防治肿瘤疾病创新药物方面的新用途。对于开 发创新性抗肿瘤药物提供了物质基础，具有潜在的社会效益和经济效 益。本发明之式(I)化合物来源于天然药物，经半合成制备而得。 其来源易得、价廉；合成方法简便，成本低，污染小，利于节能减排 条件下的大规模生产。产业化前景明确。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明的实质，下面首先用实施例的形式说明化合物制备的过程，实施例给出了化合物的部分物理和化学及波谱学数 据。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的 限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求 保护的范围。
实施例1:化合物7,20-双(2—甲基-2-烯丁基)-脱氢水飞蓟宾醚的制 备
在干燥的反应瓶中，0.48克水飞蓟宾溶于6毫升DMF中，加入 0.552克碳酸钾，搅拌10分钟使溶解完全。缓慢滴加异戊烯基溴0.33 克，搅拌10分钟，再加热回流反应2小时。静置冷却，加入20毫升 蒸馏水，醋酸乙酯萃取3次(每次10毫升)，合并有机层，10毫升 蒸馏水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓縮。得棕黄色粗品，经200 300 目硅胶(20克)柱层析，氯仿:醋酸乙酯:醋酸=7:1:0.1洗脱，得到黄 色晶体220毫克。收率35.6%。
式(I)化合物Rf (氯仿:醋酸乙酯:醋酸=7:1:0.5) 0.49;核磁共 振氢谱& NMR (400 MHz，氘代氯仿)S: 1.75 (宽单峰，6H， 2xC//3)， 1.79 (宽单峰，3H, C7/3)， 1.81 (宽单峰，3H， C//3)， 3.60 (多重峰，1H， H画23a)， 3.75 (多重峰，1H, H-23b), 3.85 (单峰，3H， OC//3)， 4.15 (多重峰, 1H, H-IO), 4.55~4.63 (多重峰，4H， H-l' & H-l"), 5.02 (双峰，J = 8.0 Hz， 1H， H—11)， 5.44~5.53 (多重峰，2H， H-2' & H-2")， 6.35 (双峰，J = 1.6 Hz， m, H—6), 6.42 (宽单峰，1H， H-8)， 6.92-7.01 (多重峰，3H，芳香 环Ar—H—16， H—18 & H—22), 7.08 (双峰，J = 8.8 Hz， 1H， H—21), 7.75 (宽 单峰，1H， H—13), 7.79 (双峰,J = 8.0 Hz, 1H, H—15)， 12.69 (单峰，1H, 5-OH);电喷雾质谱ESI-MS:617(M+H)+。实施例2:式(I)化合物对口腔上皮癌细胞的细胞毒活性 2.1实验材料与样品
2丄1细胞口腔上皮癌细胞(KB)购自中科院上海细胞所。 2丄2实验试剂
2.1.2.1 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)购自Amresco公司；
212.2RPMI 1640培养基、小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有 限公司；
2丄2.3青霉素和链霉素由石家庄制药集团有限公司生产；
2丄2.4其它试剂如二甲亚砜等均为国产分析纯，购自杭州华东医药
试剂有限公司。
2丄3实验仪器
2.1.3.1酶标仪Synergy-HT型，BIO-TEK公司；
2丄3.2立式自动电热压力蒸汽灭菌器LDZX-40BI型，上海申安医
疗器材厂；
2丄3.3超纯水系统UPWS-I-60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；
2.1.3.4除菌过滤器Sterifil500型，Millipore公司；
2丄3.5气浴恒温振荡器THZ-C，江苏省金坛市医疗仪器厂；
2丄3.6C02细胞培养箱MMM，德国公司；
2丄3.7倒置显微镜XD-2型，重庆光电仪器有限公司。
2.2细胞培养口腔上皮癌细胞(KB)细胞用RPMI 1640培养基培 养，培养基中含10%的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升的 链霉素。细胞以每孔5乂103的浓度加入到96孔板中，在37r含50/^ C02潮湿空气的培养箱中培养24小时。
2.3细胞存活率(细胞毒性)的测定细胞存活率的测定用改良MTT 法。细胞经过24小时的孵育后，分别将新配的化合物I的二甲亚砜 溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物最终浓度分别为100微 克/毫升，33.3微克/毫升，11.1微克/毫升和3.7微克/毫升。72小时后， 加入10微升MTT (5微克/毫升)的磷酸盐缓冲液，再继续在37'C培养4小时后，离心5分钟除去未转化的MTT，每孔中加入200微升二甲亚砜，以溶解还原的MTT晶体甲臜(formazan)，所形成的formazan用酶标仪在570nm波长下比色，细胞存活率由样品相对于对照品的比值计算。其中测试化合物对KB细胞半抑制浓度IC5。由剂量效应曲线得到。
2.4实验结果式(I)化合物对KB细胞的IC5o为6.7土1.3nM(微摩尔/升)；水飞蓟宾对KB细胞的IC5。为103.5 ± 16.2 脱氢水飞蓟宾对KB细胞的IC5Q为29.2 ± 5.1 而阳性对照顺铂对KB细胞的IC5o为2.1士0.8 |oM。
2.5实验结论KB细胞是测试化合物对肿瘤细胞的细胞毒性的有效工具和评价指标。本实验表明7,20-双(2-甲基-2-烯丁基)-脱氢水飞蓟宾醚对KB细胞具有较强的细胞毒性，其活性优于水飞蓟宾和脱氢水飞蓟宾，显示其预想不到的效果，因而有可能发展成为新的具有抗口腔上皮癌及相关肿瘤作用的药物。
实施例3:式(I)化合物对人肺癌细胞的细胞毒活性3.1实验材料与样品
3丄1细胞人肺癌细胞(A549)购自中科院上海细胞所。3丄2实验试剂
3.1.2.1 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)國2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)购自Amresco公司；
312.2RPMI 1640培养基、小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；
3丄2.3青霉素和链霉素由石家庄制药集团有限公司生产；
3丄2.4其它试剂如二甲亚砜等均为国产分析纯，购自杭州华东医药
试剂有限公司。
3丄3实验仪器
3.1.3.1酶标仪Synergy-HT型，BIO-TEK公司；
3丄3.2立式自动电热压力蒸汽灭菌器LDZX-40BI型，上海申安医疗器材厂；
3.1.3.3超纯水系统UPWS小60D型，杭州永洁达净化科技有限公司；
3.1.3.4除菌过滤器Sterifi1500型，Millipore公司；
3丄3.5气浴恒温振荡器THZ-C，江苏省金坛市医疗仪器厂；
3丄3.6C02细胞培养箱MMM，德国公司；
3丄3.7倒置显微镜XD-2型，重庆光电仪器有限公司。
3.2细胞培养人肺癌细胞(A549)用RPMI 1640培养基培养，培养基中含10%的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升的链霉素。细胞以每孔5乂103的浓度加入到96孔板中，在37'C含5%032潮湿空气的培养箱中培养24小时。
3.3细胞存活率(细胞毒性)的测定细胞存活率的测定用改良MTT法，具体方法如实施例2。其中测试化合物对A549细胞半抑制浓度(IC50)由剂量效应曲线得到。
3.4实验结果化合物I对A549细胞的IC5o为11.6 ± 2.2 (iM (微摩尔/升)；水飞蓟宾对A549细胞的IC5o大于200 脱氢水飞蓟宾对A549细胞的IC5o为42.9 ± 7.3 ^M;而阳性对照顺铂对A549细胞的ICso为40.8 ± 8.6 pM。
3.5实验结论A549细胞是测试化合物对肺部肿瘤细胞毒性的有效工具和评价指标。本实验表明7，20-双(2-甲基-2-烯丁基)-脱氢水飞蓟宾醚对A549细胞具有较强的细胞毒性，其活性除优于水飞蓟宾和脱氢水飞蓟宾，甚至强于阳性对照药物顺铂，显示其预想不到的效果，因而有可能发展成为新的具有抗肺癌作用的药物。
权利要求
1.具有式(I)所示结构的7位和20位异戊烯基取代的脱氢水飞蓟宾双醚化合物或其可药用盐用于制备抗肿瘤药物的用途； id="icf0001" file="A2009100998090002C1.tif" wi="88" he="36" top= "43" left = "47" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>式(I)其中，10，11位同时为R构型或同时为S构型；式(I)化合物的名称为7，20-双(2-甲基-2-丁烯基)-脱氢水飞蓟宾醚。
2. 根据权利要求l所述的式(I)化合物的抗肿瘤药物用途，其特征 在于所述的肿瘤是指口腔表皮癌或肺癌。
3. 根据权利要求1所述的式(I)化合物在制备肺癌细胞生长抑制剂 中的应用。
4. 根据权利要求1所述的式(I)化合物在制备口腔上皮癌细胞生长 抑制剂中的应用。
5. —种用于防治肿瘤性疾病的药物或药物组合物，其含有治疗有效 量的作为活性成分的式(I)所示结构的7，20-双(2-甲基-2-丁烯基) -脱氢水飞蓟宾醚或其可药用盐和可药用辅料。
全文摘要
本发明涉及脱氢水飞蓟宾在制备抗肺癌药物中的应用，具体而言，本发明涉及7位和20位异戊烯基取代的脱氢水飞蓟宾双醚衍生物的抗肿瘤药物用途，该化合物具有体外显著抑制人肺癌细胞A549的活性；其半数抑制浓度为11.6±1.6微摩尔/升，超过阳性对照用药顺铂(半数抑制浓度为40.8±5.2微摩尔/升)三倍以上；该水飞蓟宾双醚同时还对人口腔表皮癌KB细胞显示出强效抑制作用，其半数抑制浓度为6.7±1.3微摩尔/升。药效学结果表明该脱氢水飞蓟宾双醚或其可药用盐可以预期用于制备防治肿瘤性疾病特别是肺癌药物的用途。
文档编号A61P35/00GK101590035SQ200910099809
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月22日 优先权日2009年6月22日
发明者冯玉冰, 巫秀美, 李校堃, 骅 白, 佳 瞿, 昱 赵, 黄可新, 龚景旭 申请人:温州医学院;李校堃