专利名称：冬凌草茎水提物、其制备方法、指纹图谱及作为自由基清除剂的应用的制作方法
冬凌草茎水提物、其制备方法、指纹图谱及作为自由基清除剂的应用发明领域
本发明涉及冬凌草茎用蒸馏水80°C提取制备水提物、涉及该水提物的HPLC-(-)ES1-Q-TOF-MS/MS指纹图谱、涉及该水提物的HPLC-(+) ES1-Q-TOF-MS/MS指纹图谱、进一步涉及该水提物作为自由基清除剂的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
辐射、农药、食物添加剂、酒精、吸烟、新陈代谢、缺氧以及激烈的运动都会使人体产生自由基。人体内的自由基主要有氧自由基、羟自由基和氮氧自由基。自由基可以引发多种疾病。例如自由基可损伤细胞膜导致细胞膜变性、可造成基因突变诱发癌症、可激活免疫系统引起红斑狼疮等自体免疫疾病、可增加毛细血管脆性导致静脉曲张和水肿、可激发各种炎症因子释放引起非菌性炎症、可损伤脑细胞引起老性痴呆、可氧化血液脂蛋白造成胆固醇向血管壁沉积引起动脉硬化和和中风、可引起关节膜及关节滑液降解导致关节炎以及可损伤胰脏细胞引起糖尿病等疾病。寻找自由基清除剂是药物研究的重要方向之一。
冬凌草(DLC),是唇形科香茶菜属植物碎米極Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara的全草。冬凌草为多年生草本植物，广泛分布于我国黄河长江流域，主产于河南济源太行山、王屋山区一带。因具有清热 解毒、清咽利喉和消肿止痛功能，民间常年将冬凌草叶当作茶叶煮水饮用。在过去的30多年里，冬凌草的化学成分及药理作用研究主要集中在叶的脂溶性部分，代表性成分为冬凌草甲素和冬凌草乙素。虽然曾经有人研究过冬凌草甲素的自由基清除活性，但是迄今没有任何与冬凌草茎的水提物化学成分及自由基清除作用相关的研究见诸文献。与叶相比，冬凌草茎在全草中所占的比例高很多。有效地应用冬凌草茎保护人体免受自由基损伤有重要意义。
通过长期的自由基清除剂研究积累，发明人锁定酚酸与二萜是具有自由基清除活性的结构类型。通过生源分析发明人预测到冬凌草茎中含丰富的酚酸与二萜。按照这些认识,发明人提出本发明，用 HPLC- (-) ES1-Q-TOF-MS/MS 和 HPLC- (+) ES1-Q-TOF-MS/MS 指纹图谱指纹图谱揭示冬凌草茎水提物的化学成分、用自由基清除模型揭示冬凌草茎水提物的自由基清除作用。发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种制备冬凌草茎水提物的方法。
本发明所要解决的第二个技术问题是建立HPLC-㈠ES1-Q-TOF-MS/MS和HPLC-(+)ES1-Q-TOF-MS/MS分析方法，获取冬凌草茎水提物的指纹图谱以便控制冬凌草茎水提物的质量。
本发明所要解决的第三个技术问题是用由基清除模型评价冬凌草茎水提物的由基清除作用，为预防由基清除引起的疾病提供冬凌草茎水提物作为自由基清除活性高无副作用的物质。
本发明涉及冬凌草茎水提物的制备工艺，该工艺包括冬凌草茎用热水提取、水提物过滤、滤液减压浓缩至干、得到的干粉用HPLC-㈠ES1-Q-TOF-MS/MS和HPLC- (+)ES1-Q-TOF-MS/MS分析得指纹图谱、得到的干粉用由基清除模型评价冬凌草茎水提物的由基清除作用。
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。


图1a冬凌草茎水提物在(_)ES1-Q-TOF-MS检测的离子流指纹图谱
图1b冬凌草茎水提物在(+) ES1-Q-TOF-MS检测的离子流指纹图谱
图2a，b冬凌草茎水提物清除DPPH自由基的作用
图3a，b冬凌草茎水提物清除羟自由基的作用具体实施方式
实施例1冬凌草茎水提物的制备
40g干冬凌草茎自来水洗净、凉干、切成大约Icm长的茎段、加1000_1800mL温度为70-900C的热蒸镏水渗滤，优选加1200mL温度为80°C的热蒸镏水渗滤。渗滤液流出的速度为10-30mL/分钟，优选20mL/分钟。流出液于40_60°C减压浓缩，优选于50°C减压浓缩，得到3g冬凌草茎水提物，为淡黄色固体。研成粉末，供后面的研究使用。
实施例2冬凌草茎水提物的HPLC-㈠ES1-Q-TOF-MS/MS指纹图谱和HPLC- (+)ES1-Q-TOF-MS/MS 指纹图谱
HPLC:ffaters 2795Separations Module ；
Detector:ffaters 2489Dual absorbance detector ；
Kromasil C18 (Dikma)反相柱(5_ μ m, 250_mm_X_4.6_mm)；
保护柱(5_μ m, 10_mm_X_4.6_mm)；
流动相:乙腈/水(含0.5%和0.05%冰醋酸)；
流动相流速:0.3ml/min ；
进样量:50yL;
洗脱方式:梯度洗脱(具体梯度见表I)。
表I冬凌草茎水提 物HPLC-分析流动相梯度表a
权利要求
1.冬凌草茎水提物的制备工艺，该工艺包括将干冬凌草茎用自来水洗净之后切碎，按I: 40 (g/mL)的比例用70-90°C的热水渗滤，渗滤液流出的速度为10-30mL/分钟，流出液于40-60°C减压浓缩，得到冬凌草茎水提物干粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其中干冬凌草茎与用于渗滤的热水的比例为I: 30(g/mL)ο
3.根据权利要求1所述的方法，其中用于渗滤的热水的温度为80°C。
4.根据权利要求1所述的方法，其中渗滤液流出的速度为20mL/分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其中流出液减压浓缩的温度为50°C。
6.权利要求1-6的任一方法制备得到的冬凌草茎水提物，其特征在于该冬凌草茎水提物减压浓缩得到的干粉为淡黄色固体。
7.冬凌草茎水提物的HPLC-PAD/(-)ES1-MS-MS指纹图谱。
8.冬凌草茎水提物的HPLC-PAD/(+)ES1-MS-MS指纹图谱。
9.冬凌草茎提物作为自 由基清除剂的应用。
全文摘要
本发明涉及冬凌草茎用蒸馏水80℃提取制备水提物、涉及该水提物的HPLC-(-)ESI-Q-TOF-MS/MS指纹图谱、涉及该水提物的HPLC-(+)ESI-Q-TOF-MS/MS指纹图谱、进一步涉及该水提物作为自由基清除剂的应用。
文档编号A61K135/00GK103142689SQ201110406570
公开日2013年6月12日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者彭师奇, 赵明, 姚兴河, 唐静成, 彭莉 申请人:彭莉