专利名称：一种具有防治卵巢功能早衰作用的组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，具体涉及一种具有防治卵巢功能早衰作用的组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
卵巢早衰是指是指女性40岁前由于卵巢内卵泡耗竭或医源性损伤导致卵巢功能衰竭，以低雌激素及高促性腺激素为特征，病因学研究发现此病与自身免疫、染色体异常、促性腺激素及受体异常、放射线等密切相关。现有技术中治疗卵巢早衰常用的激素类药物，不良反应较大，中医在治疗卵巢早衰方面具有独特的优势，认为该病以肾虚为主，肝郁、脾 虚、气血失调也是此病的重要病机。目前，尚没有资料显示二至丸和鸡腰子的中药组合临床上用于治疗卵巢功能早衰；因此，很有必要在现有技术的基础上研发出一种具有更好防治卵巢早衰功效，且不良反应低的中药组合物。

发明内容
发明目的本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，本发明另一个目的是提供具有防治卵巢功能早衰作用制剂的制备方法。技术方案为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为一种具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，它是由以下重量份数的原料制成女贞子2(Γ50份、墨旱莲3(Γ50份、鸡腰子10 60份。作为优选方案，以上所述的具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，它是由以下重量份数的原料制成女贞子3(Γ40份、墨旱莲3(Γ40份、鸡腰子20 40份。本发明提供的具有防治卵巢功能早衰作用制剂的制备方法，其包括以下步骤(I)按重量份数比例取墨旱莲，加6至12倍重量的水，煎煮I至3次，每次I至2小时，合并煎液，过滤，浓缩，浓缩液中加乙醇使乙醇的浓度达60%飞5%，静置24小时，过滤，取上清液，减压浓缩至稠膏，真空干燥，得墨旱莲提取物；(2)取步骤(I)制备得到的墨旱莲提取物，于女贞子、鸡腰子混合均匀，粉碎成细粉；(3)取步骤(2)制备得到的细粉与药学上可接受的载体制备成丸剂、颗粒剂、胶囊剂或片剂剂型的药物。本发明在制成片剂时把有效成分细粉添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。在制成胶囊剂时，把有效成分细粉添加载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。本发明在制成颗粒剂时，把有效成分细粉和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
作为优选方案，以上所述的具有防治卵巢功能早衰作用的组合物在制备防治卵巢功能早衰药物中的应用。有益效果本发明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的组合物和现有技术相比具有以下优点(I)本发明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，根据卵巢功能早衰的发病机制，在中医药理论的指导下，辨证论治通过大量实验筛选中药组方，实验结果表明，本发明提供的组合物，可以明显提高卵巢功能早衰小鼠的发育中卵泡数、成熟卵泡数和黄体数，提高血清E2水平，并且能抑制卵巢功能早衰小鼠的卵巢PI3K和akt的表达，显示出了比二至丸(女贞子和墨旱莲)更好的抗卵巢功能早衰的功效，并且实验过程中未发现不良反应，临床应用安全。
(2)本发明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，可以方便和药学载体制备成多种剂型，临床上服用方便，且实验结果表明本发明提供的组合物，疗效可靠，使用安全，长期服用无毒副作用。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例II、一种具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，它是由以下重量份数的原料制成女贞子50份、墨旱莲50份、鸡腰子40份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制剂的制备方法，其包括以下步骤(I)取墨旱莲50份，加12倍重量的水，煎煮3次，每次2小时，合并煎液，过滤，浓缩至相对密度I. 10左右，浓缩液中加乙醇使乙醇的浓度达60%，静置24小时，过滤，取上清液，减压浓缩至稠膏，真空干燥，得墨旱莲提取物；(2)取步骤(I)制备得到的墨旱莲提取物，加入女贞子50份、鸡腰子40份混合均匀，粉碎成细粉；(3)取步骤(2)制备得到的细粉加炼蜜适量，加水稀释，作为粘合剂，制丸，干燥，即得。实施例2I、一种具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，它是由以下重量份数的原料制成女贞子50份、墨旱莲50份、鸡腰子50份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制剂的制备方法，其包括以下步骤(I)取墨旱莲50份，加10倍重量的水，煎煮2次，每次3小时，合并煎液，过滤，浓缩至相对密度I. 10左右，浓缩液中加乙醇使乙醇的浓度达60%，静置24小时，过滤，取上清液，减压浓缩至稠膏，真空干燥，得墨旱莲提取物；(2)取步骤(I)制备得到的墨旱莲提取物，加入女贞子50份、鸡腰子50份混合均匀，粉碎成细粉；(3)取步骤(2)制备得到的细粉，加60%乙醇适量，作为粘合剂，制粒，干燥，整粒，压片，即得片剂。实施例3I、一种具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，它是由以下重量份数的原料制成女贞子20份、墨旱莲30份、鸡腰子10份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制剂的制备方法，其包括以下步骤(I)取墨旱莲30份，加10倍重量的水，煎煮2次，每次2小时，合并煎液，过滤，浓缩至相对密度I. 10左右，浓缩液中加乙醇使乙醇的浓度达60%，静置24小时，过滤，取上清液，减压浓缩至稠膏，真空干燥，得墨旱莲提取物；(2)取步骤(I)制备得到的墨旱莲提取物，加入女贞子20份、鸡腰子10份混合均匀，粉碎成细粉； (3)取步骤(2)制备得到的细粉，加60%乙醇适量，作为粘合剂，制粒，干燥，整粒，即得颗粒剂。实施例4I、一种具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，它是由以下重量份数的原料制成女贞子30份、墨旱莲30份、鸡腰子20份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制剂的制备方法，其包括以下步骤(I)取墨旱莲30份，加12倍重量的水，煎煮2次，每次I小时，合并煎液，过滤，浓缩至相对密度I. 10左右，浓缩液中加乙醇使乙醇的浓度达60%，静置24小时，过滤，取上清液，减压浓缩至稠膏，真空干燥，得墨旱莲提取物；(2)取步骤(I)制备得到的墨旱莲提取物，加入女贞子30份、鸡腰子20份混合均匀，粉碎成细粉；(3)取步骤(2)制备得到的细粉，加60%乙醇适量，作为粘合剂，制粒，干燥，整粒，装胶囊制成胶囊剂。实施例5药理学实验I实验材料I. I药物与试剂戊酸雌二醇片，拜耳医药保健广州分公司；E2检测试剂盒，美国R&D公司；PI3K，akt抗体购自Bioworld ;受试药物本发明实施例I制备所得的丸剂，二至丸(蒸女贞子50份、墨旱莲50份)由江苏省中医院制剂部提供。I. 2实验动物Balb/c小鼠，雌性，由苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供，动物许可证号SCXK(苏)2009-0001。I. 3仪器TP1020自动脱水机和RM2235型石蜡切片机均为德国LEICA公司产品；CS-VI型摊片烤片机湖北孝感宏业医用仪器有限公司；TiSSUe-TekTEL组织包埋中心，日本SAKURA公司产品；LEICADM1000光学显微镜，德国Leica公司产品；隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械一厂；微波炉，TCL有限公司；MiniSee图像采集系统。2、实验方法2. I各实验组对放射致卵巢早衰小鼠的影响取Balb/c雌性小鼠60只，6-8周龄，适应性饲养I周后，随机分为5组，即正常对照组、模型组、戊酸雌二醇组(O. 015mg/kg)、二至丸组(7. 8g/kg)和本发明实施例I制备得到的组合物(5.9g/kg)。除正常对照组外，其余各组小鼠均采用6tlCo Y射线照射造模，照射总量为O. 5Gy，总剂量为O. 5Gy，照射率60cGy/min，照射野20cmX 20cm，距离80cm，照射后在无特殊致病原(SPF)级条件下饲养。照射后第二天，各组小鼠分别灌胃给予相应药物，每日I次，共28日。正常对照组和模型组给予等体积蒸馏水(10ml/kg)。末次给药后lh，各组小鼠眼眶后静脉丛取血，离心，取血清测雌二醇水平。同时取部分卵巢固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片，染色，封片，在光学显微镜下阅片，计数卵巢中各种卵泡和黄体的数量；部分卵巢固定用于免疫组织化学检测卵巢PI3K表达。2. 2血清E2水平测定血清E2水平测定采用ELISA法，测定方法严格按照试剂盒说明书。2. 3卵巢PI3K和akt表达检测采用免疫组化方法测定模型小鼠卵巢PI3K和akt表达。小鼠取血后处死，取 出卵巢，尽量分离脂肪组织，用中性福尔马林固定24h后，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，常规切片4μπι，45τ水浴中捞片，80°C烤箱烤片，40min。采用快速免疫组化方法检测小鼠卵巢PI3K表达。石蜡切片脱蜡水化，微波中档抗原修复10分钟。自然冷却，用PBS液(O. 01mol/LPH7. 4)冲洗3次X2min。正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加抗体，37°C孵育I小时。PBS冲洗，2分钟X 3次。滴加即用型快速免疫组化MaxVisionTM 二抗，37°C或室温孵育10至15分钟。PBS冲洗，2分钟X 3次。滴加新鲜配制的显色剂(DAB)3至5分钟，显微镜下观察。自来水充分冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝。梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。免疫组化标记结果各种蛋白阳性细胞以胞浆胞膜呈棕黄色为主，阴性不着色。2. 4统计学处理结果采用又±S表示，样本统计分析采用独立样本t检验。3、实验结果3. I本发明提供的组合物对放射致卵巢早衰小鼠一般情况的影响所有采用照射造模后动物均精神萎靡、活动明显减少，脱毛，体重下降约2. (Γ4. Og，但各组小鼠均无死亡，灌胃本发明实施例I组合物I周后上述症状逐渐好转，体重逐渐增加，恢复正常生长状态。3. 2本发明提供的组合物和其它各实验组对放射致卵巢早衰小鼠卵巢组织病理的影响，具体实验如表I所示表I中药组合物对放射致卵巢早衰小鼠卵巢组织病理的影响(文士S, n=10)
,—卵泡总数发育中卵泡成熟卵泡黄体数
组别剂量(g/kg)
_(个) 数(个) 数(个) (个)
.丨 K 常对照组一25.6 士 4.6 15.2 士4.91.8士0.51.5 士 0.7
模型组一19.5士7 86.4±1.9##0.6 士 0.2#0.4士 0.2#
戊酸雌二醇组 0.015*10-324.4±3.812.8±3.3*1.8±0.4*1.1 士 0.5*
7.822.5士4.910.1+4. Γ'1.1±0.2'0.9士0.2a'
实施例 I 组合物组 5.923.8士6.213.1±2.ΓΑ1.7士0.3*Α1.1±0.4*A
与正常对照组相比，#P〈0. 05，##P〈0. 01 ;与模型组相比，*P<0. 05，；与二至丸组比较ΔΡ<0. 05。由表I的实验结果表明，模型组小鼠发育中卵泡数、成熟卵泡数和黄体数与正常组相比明显下降有统计学差异(Ρ〈0. 01);各给药组小鼠发育中卵泡数、成熟卵泡数和黄体数与模型组比较显著升高(ρ〈0. 05 ；Ρ<0. 01)。且实验结果表明本发明实施例I提供的组合物组与二至丸组比较具有更好的促进卵巢卵泡发育成熟的作用，表现显著增加小鼠发育中卵泡数、成熟卵泡数和黄体数(Ρ〈0. 05)，表明女贞子、墨旱莲和鸡腰子配伍后具有很好的协同增效的功效。3. 3各组对放射致卵巢早衰小鼠血清Ε2水平的影响，具体实验结果如表2所示表2中药组合物对放射致卵巢早衰小鼠血清Ε2水平的影响(文土S，η=10) _MM_剂量 Cg/kg)_E2 (pg/ml)
正常对照组一112.2±10.6
厂^模型组一78.9±6.3她
戊酸雌二醇组0.015x10-3107.3±13.5*
二至丸组7.890.5±8.5*
实施例I组合物组__104.6±9.Q**A与正常对照组相比，##，P〈0. 01 ;与模型组相比，*P〈0. 05,**P<0. 01 ;与二至丸组比较ΔΡ<0. 05。由表2的实验结果表明，与正常对照组相比，模型组小鼠血清Ε2水平显著降低，有统计学差异(ρ〈0. 01)。戊酸雌二醇组、二至丸组和本发明实施例I提供的组合物组小鼠血清Ε2水平增高，和模型组相比，有统计学差异(Ρ〈0. 05 ;Ρ〈0.01)。且实验结果表明，本发明提供的实施例I组合物组小鼠血清Ε2水平显著高于二至丸组(Ρ〈0. 05)，显示出更强的提高放射致卵巢早衰小鼠血清Ε2水平的作用，进一步显示出了很好的协同增效的作用。3. 4各组对放射致卵巢早衰小鼠卵巢ΡΙ3Κ和akt表达的影响，具体实验结果如表3所示表3中药组合物对放射致卵巢早衰小鼠卵巢PI3K和akt表达的影响(又士S n=10) _MM_(g/kg)_PI3K (%)_akt (%)
Iii 常对照组一2.2±1.51.9±0.8
「 模型组一11.9±4.3Μ17.3士7.9##
戊酸雌二醇组0.015x10-37.3 士 3.5*9.1 士2.9*
二至丸组 7.8 8.5±3.0* 10.7±3.8* 实施例 I 组合物组_Χ9_4.6士2.1**Α_6.0±2.7**A与正常对照组相比，##，Ρ〈0. 01 ;与模型组相比，*P〈0. 05,**P<0. 01 ;与二至丸组比较ΔΡ<0. 05。PI3K/akt信号通路在早期卵泡发育中起重要作用。表3结果表明，正常对照组小鼠卵巢PI3K和akt表达均较低，约为2%左右，6tlCo照射后小鼠卵巢PI3K和akt表达显著增高，分别达到11. 9%和17. 3%。二至丸及实施例I组合物组给药后均显著降低模型小鼠卵巢高表达的PI3K和akt，和模型组相比，有统计学意义(P〈0. 05，P〈0. 01),且实验结果表明本发明实施例I提供的组合物组与二至丸组比较具有较强的抑制6tlCo照射引起的小鼠卵巢PI3K/akt信号通路的激活，从而抑制卵泡的大量活化。由上述实验结果表明，本发明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，能明显提高卵巢功能早衰小鼠的发育中卵泡数、成熟卵泡数及黄体数，提高血清E2水平，并且能抑制卵巢功能早衰小鼠的卵巢PI3K和akt的表达，显示出了比二至丸(女贞子和墨旱莲)更好的抗卵巢功能早衰的功效，具有更好的临床疗效，且用药安全。以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实 质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，其特征在于，它是由以下重量份数的原料制成 女贞子2(Γ50份、墨旱莲3(Γ50份、鸡腰子1(Γ60份。
2.根据权利要求I所述的具有防治卵巢功能早衰作用的组合物，其特征在于，它是由以下重量份数的原料制成 女贞子3(Γ40份、墨旱莲3(Γ40份、鸡腰子2(Γ40份。
3.一种具有防治卵巢功能早衰作用制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)取权利要求I或2所述重量份数的墨旱莲，加6至12倍重量的水，煎煮I至3次，每次I至2小时，合并煎液，过滤，浓缩，浓缩液中加乙醇使乙醇的浓度达60%飞5%，静置24小时，过滤，取上清液，减压浓缩至稠膏，真空干燥，得墨旱莲提取物； (2)取步骤(I)制备得到的墨旱莲提取物与权利要求I或2所述重量份数的女贞子、鸡腰子混合均匀，粉碎成细粉； (3)取步骤(2)制备得到的细粉与药学上可接受的载体制备成丸剂、颗粒剂、胶囊剂或片剂剂型的药物。
4.权利要求I或2所述的具有防治卵巢功能早衰作用的组合物在制备防治卵巢功能早衰药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有防治卵巢功能早衰作用的组合物及其制备方法，它是由以下重量份数的原料制成女贞子20~50份、墨旱莲30~50份、鸡腰子10~60份。本发明根据卵巢功能早衰的发病机制，在中医药理论的指导下，辨证论治通过大量实验筛选中药组方，实验结果表明，本发明提供的组合物，可以明显提高卵巢功能早衰小鼠的发育中卵泡数、成熟卵泡数及黄体数，提高血清E2水平，并且能抑制卵巢功能早衰小鼠的卵巢PI3K和akt的表达，显示出了比二至丸更好的抗卵巢功能早衰的功效，并且实验过程中未发现不良反应，临床应用安全。
文档编号A61K36/638GK102961448SQ20121055145
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者刘志辉, 王琼, 李爽, 袁雪晶, 李俊生, 范玲, 马兴苗 申请人:江苏省中医院