专利名称：一种改善断奶仔猪肠道发育的针剂溶液的配制方法
一种改善断奶仔猪肠道发育的针剂溶液的配制方法技术领域
本发明属于GLP-2针剂溶液的配制技术领域，特别涉及一种改善断奶仔猪肠道发育的针剂溶液的配制及使用方法。
背景技术：
对于手术后行全肠外营养(TPN)的新生仔猪通过颈静脉滴注的方式给予胰高血糖素样肽 _2 (Glucagon-like peptide-2, GLP-2)的外源补充,剂量为 500 pmol *kg_1 *h_1, 连续滴注7d。GLP-2溶液的配制是将humanGLP-2 (hGLP-2)溶解于含O. 1%的人血清白蛋白的O. 9%NaCl灭菌溶液中(Cottrell等,2005);相似的，B urrin等(2005和2008)试验使用连续静脉注射的方式按O. 5 ml. kg' r1给TPN仔猪添加外源GLP-2。GLP-2溶液的配制是将hGLP-2 ^33溶解于含O. 5%人血清白蛋白的0.45g/L NaCl溶液中，使其终浓度分别为0.8，1. 6和3. 6 μ g/ml，因此，各处理组的添加剂量分别为2. 5，5.0，和10. O nmol. kg-1 (Burrin 等，2005)。
缺点是针对的动物对象需要限制其行动，还需要动手术安装静脉插管；一般试验条件难以满足其严格的要求；具有明显的应用限制。发明内容
对于GLP-2的溶解方法,根据前文我们可以看到，Burrin和Cottrell都采用了血清白蛋白作为承载体来溶解GLP-2这种多肽类物质，但是他们的添加方法与我们有所差别，他们采用静脉滴注的方式，当然这不会对仔猪造成应激反应；然而，本发明为了克服上文中提到的静脉滴注的缺陷，将采用注射的方式，若给予含血清白蛋白的GLP-2溶液，则会造成蛋白免疫应激反应，表现为不安、弹跳和口吐白沫等症状，严重者导致动物休克。
因此，本发明要解决的技术问题为外源(皮下注射)给予GLP-2以改善动物肠道发育的方式方法的实用性、有效性和安全性这三方面的问题。
关于该针剂口服、皮下注射和肌肉注射的方式的选择问题，一般口服药品进入全身的血液循环以前，先经过胃肠道中消化液、粘膜、肝药酶的破坏，有些药物会被破坏一大半以上，而GLP-2属于多肽类激素，其发挥作用的形式必须是33个氨基酸组成的全长序列蛋白，若采用口服方式，GLP-2i_33早已经被胃肠蛋白酶、肠肽酶降解，故口服的制剂不可取； 而究竟是皮下还是肌肉注射，我们知道，肌肉注射是从肌肉层慢慢进入血液，血管越丰富的部位药物吸收就越快，而皮下注射是从皮下组织达到血液，如临床上胰岛素针剂则只能采取皮下注射方式。由于全长的有生物活性的GLP-2i_33进入体内会被体内的二肽基肽酶IV (Dipeptidyl P印tidase-1V，DPP_IV)降解为没有活性的GLP_23_33形式从而钝化GLP-2的活性(Drucker等，1997)，且其半衰期很短，因此为了减缓GLP-2进入体内的速度，我们在仔猪上采用异源即hGLP-2通过皮下注射的方式给予外源GLP-2的补充以抵抗猪体内DPP-1V 的降解，连续注射7d，每天早晚各I次。
本发明给出的改善断奶仔猪肠道发育的针剂溶液的配制方法，其特征在于将hGLP-2冻干粉溶解于pH为7. 4的O. 01 mo I/L磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)中，待完全溶解后,经O. 22 μ m的滤膜过滤除菌。
除菌后可直接使用、一周内使用可冷藏保存，或者分装后于-20°C冷冻保存。
本发明的有益效果一是GLP-2的完全溶解；二是方便使用；三是没有应激，安全。 用PBS溶液实现GLP-2的溶解的制剂完全没有出现应激反应，通过取肠样进行形态学分析、 肠重及肠重指数的测定，试验期间仔猪的采食量、日增重和料肉比都得到了有效地改善，说明采用皮下注射含hGLP-2的PBS溶液是安全有效的。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本实施例给出的改善断奶仔猪肠道发育的针剂溶液的配制方法，其特征在于将 hGLP-2冻干粉溶解于pH为7. 4的O. 01 mo I/L磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液，由市售的pH为 7. 4,0. 01 M的PBS粉剂加超纯水配制而得)中，待完全溶解后，经O. 22 μ m的滤膜过滤除菌。 配制完成后可直接使用，短期内使用可冷藏保存，否则分装后于-20°C冷冻保存并且不能反复冻融。
pH为7. 4的O. 01 mol/L磷酸盐缓冲溶液也可自行配制，例举配制方法如下用超纯水按 1000 ml 的标准量配制准确称取 NaCl 8. O g、KCl O. 2 g、Na2HPO4 · 12H20 2. 90 g、 KH2PO4 0. 24 g，溶解于800 ml超纯水中，用I mol/L的HCl和NaOH调节pH值至7. 4，定容到 1000 ml ο
具体如下
GLP-2的溶解技术本试验采用hGLP-2冻干粉来源于人工合成(美国康肽生物公司)，若按单只断奶仔猪6. 8kg初始体重，每次皮下注射体积1. 5ml，连续7天，每天2 次，每天注射剂量为2nmol/kg初始体重计，则每次注射hGLP-2的摩尔数为(6. 8kgX2 nmol -kg^1) /2=6. 8 nmol ;每次满足注射量应溶解的hGLP-2的质量应该为[6. 8 nmol *相对分子质量(即质量分数g/mol)]，注意单位的统一和换算；含hGLP-2的PBS溶液终体积为[1. 5ml*注射总次数]。称取满足η头仔猪连续7天注射(每天早晚各I次，即14次)的 hGLP-2量[单次注射需要的质量*n*14]，溶解于相应 体积的PBS溶液中，待完全溶解后，经 0.22 um滤膜过滤除菌，切不可高温高压灭菌。
为了确认本发明配制方法配制的溶液注射方式的有效性，我们接下来开展了动物试验的验证工作。一方面，我们对采用含0. 1%牛清白蛋白的GLP-2 NaCl溶液的皮下注射方式进行了验证，结果证实了我们的猜测，试验动物都表现出强烈的免疫应激反应，若采用这种外源添加方式，势必是危险的；而我们用PBS溶液实现GLP-2的溶解的制剂则完全没有出现应激反应，通过取肠样进行形态学分析、肠重及肠重指数的测定(表1)，试验期间仔猪的采食量、日增重和料肉比都得到了有效地改善(表2)，说明采用皮下注射含hGLP-2的PBS 溶液是安全有效的，本发明给出的配制方法实用、安全、有效。
表I GLP-2对断奶仔猪各段肠重的影响(kg)
Table I The effect of GLP-2 on weight of each intestinal segment in weaned piglet
权利要求
1.一种改善断奶仔猪肠道发育的针剂溶液的配制方法，其特征在于将hGLP-2冻干粉溶解于PH为7. 4的0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，待完全溶解后，经0.22 iim的滤膜过滤除菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于除菌后直接使用、短期内冷藏保存或者分装后于-20°C冷冻保存。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的磷酸盐缓冲溶液由市售的PBS粉剂加超纯水配制而得。
全文摘要
本发明公开了属于GLP-2针剂溶液的配制技术领域，特别涉及一种改善断奶仔猪肠道发育的针剂溶液的配制方法。将hGLP-2溶解于pH为7.4的0.01 mol/L的PBS溶液中，待完全溶解后，经0.22μm的滤膜过滤除菌，短期内可冷藏保存。用PBS溶液实现hGLP-2的溶解的制剂行仔猪皮下注射完全没有出现应激反应，通过取肠样进行形态学分析、肠重及肠重指数的测定，试验2周期间仔猪的采食量、日增重和料肉比都得到了有效地改善，说明采用皮下注射含hGLP-2的PBS溶液是安全有效的。
文档编号A61P1/00GK102988282SQ20121053147
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者贾刚, 邓秋红, 蒋义, 余长松 申请人:四川农业大学