专利名称：球形纤维素dna免疫吸附剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及医用吸附材料，特别是一种免疫吸附剂。将活性物质DNA以化学键联方式固定到载体材料球形纤维素上，成为DNA免疫吸附剂。可用于血液灌流治疗系统性红斑狼疮。
系统性红斑狼疮(简称SLE)是一种自身免疫性疑难病症，临床上尚无有效疗法，病因不详，患者往往因全身重要器官衰竭而死亡，死亡率较高。
使用DNA免疫吸附剂对患者进行血液灌流，是近十几年来发展起来的新型疗法。Jones，Frank R(EP 0 272 792 A1，1987)对这种方法作了详细说明。DNA免疫吸附剂的吸附作用是依靠DNA对致病物质--抗DNA抗体的特异识别作用，清除患者血液中的致病物质，缓解病情，改善患者的免疫功能，从而逐渐恢复健康。本法疗效显著，目前日益受到临床医学的重视。
美国的Terman DS等[Lancet，1979，2(8147)824-7]，首次使用活性炭为载体材料，采用火棉胶包膜固定DNA，得到的DNA免疫吸附剂用于血液灌流治疗一名重度SLE患者，使患者生命延长了31天。从此开辟了免疫吸附疗法治疗SLE的新纪元。杨彦等[中国生物医学工程学报，1985，4(2)88-95]采用日本碳化树脂为载体，用火棉胶包膜固定DNA。该吸附剂在中国成功地应用于临床治疗SLE，疗效显著。
碳化树脂通过火棉胶包膜固定化DNA，DNA镶嵌在火棉胶膜内，只有暴露在外的DNA片段起特异吸附作用，DNA的活性受到限制。所以越来越多的DNA免疫吸附剂采用化学键联方式固定化DNA，使DNA分子链自由伸展，更好的发挥识别和结合作用。如Nagasawa采用葡聚糖凝胶共价键联DNA，制备免疫吸附剂(Journal ofApplied Biochemistry，1985，7296-302)。
以球形纤维素为载体的DNA免疫吸附未见文献报道。天然高分子材料纤维素具有良好的生物相容性，已在生物医学材料领域获得了广泛应用。研究开发球形纤维素DNA免疫吸附剂，将具有良好的使用性能和应用前景。朱伯儒[离子交换与吸附，1996，12(6)522-525]研究了球形纤维素的制备方法。本发明通过调节分散介质的比重，改进了球形纤维素的制备工艺。
本发明的目的是提供一种球形纤维素DNA免疫吸附剂，采用新型载体材料球形纤维素，通过共价键固定化DNA，制备新型DNA免疫吸附剂，利用纤维素的良好生物相容性和化学键联DNA的高活性，使新型吸附剂具有更高的吸附性能和更好的临床治疗效果。
本发明首先从初始原料棉短绒开始，将棉短绒依次经过次氯酸钠漂白、氢氧化钠、二硫化碳处理，得到橙红色粘稠溶液，即纤维素黄原酸酯衍生物。以氯苯和四氯化碳为分散介质，采用悬浮法，80-95℃加热固化1-3小时，得到球形纤维素。球形纤维素在碱性条件下用环氧氯丙烷活化，再与DNA溶液发生键合反应，可得到球形纤维素DNA免疫吸附剂，DNA含量为0.5-3.0mg/ml树脂。
现将本发明详细描述如下1.球形纤维素的制备本发明是将棉短绒加入到8倍(重量比)1％NaOCl水溶液中，用HCl溶液调节pH＝7-8，滴加5％尿素，棉短绒被漂白，水洗、挤干。经漂白的棉短绒在19％NaOH溶液中室温浸泡2小时，挤干，放入广口瓶中，加盖，室温下放置老化三天。取小样，酸中和，水洗后烘干，计算实际干重。向老化后的碱棉花中加入计算量的二硫化碳[CS2毫升数＝碱棉花干重(克)/2]，密封，25℃振荡5小时，得到橙红色粘稠液体。根据碱棉干重，用6％NaOH溶液稀释得到浓度为6-12％的粘胶液(此粘胶液不宜久置)。
于三口瓶中，加入75-100％w/w氯代苯，0-25％w/w四氯化碳，0.2％w/w油酸钾，组成有机相分散介质，搅拌30分钟。称取有机相1/3重量的粘胶液，向其中加入0-10％w/w的CaCO3(60μm)粉末作为致孔剂，搅拌均匀，搅拌下自漏斗中加到分散介质中。缓慢升温至85～95℃，反应1-3小时。冷却，倒去有机相，水洗，用0.5N HCl饱和CaCl2溶液(内含20％NaCl)水解除去致孔剂CaCO3。水洗至中性，用标准筛收集0.45-0.9mm产品。
2.球形纤维素DNA免疫吸附剂的制备将球形纤维素、环氧氯丙烷和NaOH(0.4-3.0N)溶液混合，它们的体积比为1∶0.05-0.5∶0.32-8.0。30-50℃，反应2-4小时。水洗至中性，除去未反应环氧氯丙烷。环氧基含量达60-107％μmol/ml。
取环氧化球形纤维素，加入2倍体积DNA溶液(1.0-4.0mg/ml)，50-90℃，反应6-24小时。依次用10倍体积的0.1M醋酸盐缓冲溶液(pH＝4.0，含0.5M NaCl)，0.1M碳酸盐缓冲溶液(pH＝9.0)分别淋洗两次，再用20倍体积的0.1M硼酸盐缓冲溶液(pH＝7.3)和1M NaCl溶液分别淋洗，最后用水淋洗，至流出液在260nm处无紫外吸收。采用磷钼酸铵显色法测定DNA固定量。本发明得到的球形纤维素DNA免疫吸附剂的DNA含量为0.5-3.0mg/ml。
本发明是国家自然科学基金资助项目29674014。本发明制备的球形纤维素DNA免疫吸附剂，DNA固定量大大高于碳化树脂DNA免疫吸附剂(0.3-0.5mg/ml)。用SLE病人血浆进行静态吸附实验，对致病抗体的吸附性能明显优于碳化树脂DNA免疫吸附剂。
本发明突出的实质性特点和显著进步，可通过下述实施例予以证明，但它们不是对本发明作任何限制。
实施例1.
100g棉短绒，加入800g 1％NaOCl水溶液，用1 N HCl调节pH＝7-8，滴加50g 5％尿素水溶液，棉短绒很快被漂白，水洗，挤于。加入600g 19％NaOH溶液，室温下放置2小时，过滤，挤干。放入广口瓶中加盖，室温下放置老化三天。取小样10g，经HCl酸中合、水洗、烘干，称重1.45g，由此计算总干重为69.8g。向瓶中加入69.8/2＝34.9ml二硫化碳，密封，室温振荡5小时。得到橙红色粘稠液，浓度为13.3％。用6％NaOH稀释成6-12％不同浓度的粘胶液。
实施例2.
于1000ml三口瓶中，加入320g氯苯，40g四氯化碳，0.7g油酸钾，搅拌30分钟。称取实施例1制备的9％粘胶液120g，搅拌下自漏斗慢慢加入三口瓶中，调节搅拌速度，使液滴分散均匀，粘径合适。缓慢升高水浴温度，在1小时内升至90℃，在此温度下保温2.5小时。冷却，倾去有机相，水洗。筛选0.45-0.9mm树脂，约80ml。
实施例3.
分散介质为270g氯苯，90g四氯化碳，在120g粘胶液中加入9.0g 60μm CaCO3粉末作为致孔剂，其它条件和方法与实施例2相同。得到的纤维素树脂在0.5N HCl饱和CaCl2溶液(内含20％NaCl)中水解，除去致孔剂CaCO3，水洗至中性。收集0.45-0.9mm合格树脂，约90ml。在同样条件下，如果分散介质为360g氯苯，不用四氯化碳调节分散介质比重，则极易发生粘连、结块，造成收率低，树脂不规则，或者合成失败。
实施例4.
量取10ml实施例2合成的纤维素树脂，吸干表面水，加入2.5ml环氧氯丙烷，12.0ml 2.5N NaOH。40℃反应3小时。水洗至中性，除去未反应环氧氯丙烷。经测定环氯基团的含量为90.0μmol/ml。
实施例5.
量取10ml实施例2合成的纤维素树脂，加入5.0ml环氧氯丙烷，15ml 2.0N NaOH。其他同实施例4。环氧基团含量为67.4μmol/ml。
实施例6.
取实施例4所得的环氧化球形纤维素10ml，加入20ml 1.5mg/ml DNA溶液，在80℃反应24小时。依次用100ml 0.1M醋酸盐缓冲溶液(pH＝4.0，内含0.5M NaCl)，100ml0.1M碳酸盐缓冲溶液(pH＝9.0)分别淋洗两次，再用200ml 0.1M硼酸盐缓冲溶液(pH＝7.3)和200ml 1M NaCl溶液分别淋洗，最后用水淋洗，直到流出液OD260nm＝0.000。采用磷钼酸铵比色法测得DNA固定量为2.0mg/ml。
实施例7.
采用50℃，其它条件下实施例6相同。最终产品DNA固定量为0.5mg/ml。
权利要求
1.一种球形纤维素DNA免疫吸附剂，其特征在于它是使用球形纤维素作为载体材料，负载有效量的活性物质DNA构成，其中，DNA含量为0.5-3.0mg/ml树脂。
2.权利要求1所述球形纤维素DNA免疫吸附剂的制备方法，其特征在于它是经过下述步骤(1).球形纤维素的制备棉短绒首先用1％NaOCl水溶液漂白，再放入19％NaOH溶液中室温浸泡2小时，挤干，密封，室温下老化三天，取小样测定干重，然后与计量的二硫化碳，25℃下反应5小时，得到橙红色粘稠液体；以氯代苯为分散介质，用四氯化碳调节分散介质比重，油酸钾为分散剂，粘胶液中加入CaCO3粉末作为致孔剂，采用悬浮聚合方法，80～95℃反应1-3小时，水洗，用0.5NHCl饱和CaCl2溶液(内含20％NaCl)水解除去致孔剂CaCO3，水洗至中性，用标准筛收集0.45-0.9mm球形纤维素产品。(2)球形纤维素DNA固定化球形纤维素在碱性条件下，与环氧氯丙烷在30-50℃，反应2-4小时，得到环氧化球形纤维素；环氧化球形纤维素与DNA溶液在50-90℃下反应6-24小时，依次用醋酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液和1M NaCl溶液分别淋洗，最后用水淋洗，至流出液在260nm处无紫外吸收，采用磷钼酸铵显色法测定DNA固定量。
3.按照权利要求2所述的球形纤维素DNA免疫吸附剂的制备方法，其特征在于各个物料配比为(1).球形纤维素的制备75-100％w/w氯代苯、0-25％w/w四氯化碳和0.2％w/w油酸钾，组成有机相分散介质；称取有机相1/3重量的粘胶液，向其中加入0-10％w/w的CaCO3(60μm)粉末作为致孔剂，(2)球形纤维素DNA固定化球形纤维素、环氧氯丙烷和NaOH(0.4-3.0N)溶液的体积比为1∶0.05-0.5∶0.32-8.0；环氧化球形纤维素与2倍体积DNA溶液(1.0-4.0mg/ml)反应。
4.权利要求1所说的球形纤维素DNA免疫吸附剂的应用，其特征在于它用于临床血液灌流治疗系统性红斑狼疮，特异性吸附患者血液中的致病物质。
全文摘要
本发明涉及医用吸附材料,特别是一种球形纤维素DNA免疫吸附剂。本发明是以棉短绒为原料,依次经过次氯酸钠漂白、氢氧化钠、二硫化碳处理,得到橙红色粘稠溶液,即纤维素黄原酸酯衍生物;以氯苯和四氯化碳为分散介质,采用悬浮法,85～95℃加热固化1—3小时,得到球形纤维素。球形纤维素在碱性条件下用环氧氯丙烷活化,再与DNA溶液发生反应,可得到球形纤维素DNA免疫吸附剂,DNA含量为0.5—3.0mg/ml树脂;本发明制备的DNA免疫吸附剂在DNA固定量和吸附性能上优于碳化树脂DNA免疫吸附剂,用于治疗疑难病系统性红斑狼疮,属新一代产品。
文档编号A61K47/38GK1199643SQ9810235
公开日1998年11月25日 申请日期1998年6月8日 优先权日1998年6月8日
发明者俞耀庭, 孙德领, 陈长治 申请人:南开大学