专利名称：甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物及其制备方法
技术领域：
本发明属于天然药物有效成分提取领域。具体涉及到甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物及制备方法、质量控制方法及其在医药和保健食品领域的应用。
背景技术：
近几年来，人们营养过剩的问题日益严重，戒糖的呼声越来越高，食用蔗糖过量给人们带来的众多危害促使科学家不断寻找开发新型的糖源。甜叶菊叶片提取物中的甜菊苷及其它双萜糖苷相关物作为一类高甜度、低热值的天然甜味剂产品越来越受到广大消费者的青睐。它不仅符合现代饮食健康的要求，而且也为糖尿病、肥胖病、高血压、心脏病的患者提供了不诱发病情的甜味代替品，有着广阔的发展前途。近年来，甜菊苷在食品、饮料和医药卫生方面获得了广泛的应用，被誉为世界“第三糖源”。1985年6月我国卫生部审定批准甜菊苷可以在各种食品、饮料及药品中使用。
甜叶菊(Stevia Rebaudiana Bertoni.)属菊科甜菊属多年生草本植物，别名甜茶。甜叶菊原产于巴拉圭东北部与巴西接壤的阿曼拜山脉，当地居民把它作为甜药饮用已有一百多年的历史。甜叶菊性味甘、平，甜叶菊叶中富含甜叶菊苷类成分，除此之外，还含有甾醇类和黄酮类成分。目前，甜叶菊中甜菊苷类成分的制备方法国内外均有报道，但同时提取分离制备甜叶菊叶中甜菊苷类成分和黄酮类成分，而制得甜叶菊提取物中甜菊苷类成分和黄酮类成分含量达50％以上的方法，未见报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种甜叶菊叶中甜菊苷类和黄酮类提取物及其制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种甜叶菊叶中甜菊苷类和黄酮类提取物作为甜昧剂、药品辅料和矫味剂在食品、医药保健领域的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种甜叶菊叶中甜菊苷类和黄酮类提取物可单独作为制剂或与某些降压降脂药合用制成剂型，应用于医药保健领域。
本发明提出的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物，是从甜叶菊叶中提取的甜菊苷类和黄酮类活性成分的组合，其中主要化合物结构如下
本发明所述甜叶菊，来源于菊科甜菊属多年生草本植物甜叶菊SteviaRebaudiana Bertoni.的全部植株或任何部位，如根、根茎、茎、叶、花穗、果实等，其中优选的药材部位为其干燥叶。
本发明所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物，包含甜菊苷类和黄酮类的活性成分的组合物，这些组合物成分主要包括甜菊苷，莱鲍迪苷A；木犀草素，槲皮素，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，槲皮苷，槲皮素-3-O-β-D-阿拉伯糖苷，槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]及其衍生物等。
作为甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物，其中甜菊苷类和黄酮类成分百分含量的总和为5～100％(w/w)，其中优选的为50～100％(w/w)。
本发明所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物，除可应用于食品工业外，还可用于医药工业作矫味剂(矫正某些药物的异殊、怪味)和辅料(片剂、丸剂、胶囊等)。并且由于甜菊苷可耐酸碱，在pH4～10范围内，100℃下加热，其化学结构不发生变化、也不分解、不产生微生物所需要的葡萄糖，是属于非发酵性物质，也有利于食品保鲜和药品防霉。
本发明所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物可单独制成制剂或与其他降压、降脂药物合用，用于高血压、糖尿病的治疗。这些制剂具有与上述甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物相同或相近的药理活性和用途。
在本发明所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物所涵盖的各种活性成分之中，最主要的是甜菊苷、莱鲍迪苷A和黄酮类成分。
本发明还提出了所述甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物的制备工艺，它可以采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备(1)溶剂提取法；(2)溶剂萃取法；(3)大孔吸附树脂法；(4)超临界流体萃取法；(5)柱色谱法；(6)液-液逆流分配色谱法。其中优选的方法为大孔吸附树脂法。
在使用这些方法进行制备时，一般包括以下几个步骤(1)提取所用溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶剂。提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取、高压提取等。
优选的提取工艺为甜叶菊干燥叶片加30～90％乙醇，回流提取2～3次，每次提取1～2小时，溶剂用量为5～15倍量(L/kg)。
(2)过滤包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任意一种澄清剂或其组合醇沉剂，明胶，高岭土，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三醇，壳聚糖以及天然澄清剂成品如101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂等。
(3)浓缩包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等。
(4)干燥包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。
当采用溶剂萃取法进行制备时，一般先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性杂质，然后用合适极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物。
当采用大孔吸附树脂法进行制备时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性等任意一种类型，如D101、D4020、HPD400、AB-8、S-8、HZ-806等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、HPD400、D101等。所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等，其中优选的为0～100％的乙醇。
优选的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物树脂纯化工艺为选用AB-8、HPD400等中等极性或弱极性大孔吸附树脂作为纯化用树脂，甜叶菊乙醇提取物上样液浓度1∶4～1∶12(以生药量(g)∶分散毫升数)，吸附流速2～9BV/h，树脂柱径高比1∶5～1∶10，上样量为100～500mg/mL(以生药量计)，0～40％乙醇洗脱1～4倍树脂体积进行除杂，用40～90％乙醇洗脱3～6倍树脂体积，洗脱流速为2～9BV/h。
当采用超临界流体萃取法进行制备时，可以对甜叶菊原材料直接进行萃取，也可以对上述任一方法和步骤所获得的产物进行萃取。萃取时可以使用或不使用以下任一种类溶剂及溶剂混合物水、醇类、酮类及酯类溶剂。
当采用柱色谱法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤所获得的产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法或超临界流体萃取法初步纯化后的产物。所用的固定相可以是硅胶、聚酰胺、氧化铝、葡聚糖(Sephadex系列或Sephadex LH-20系列)、C-8、C-18、活性炭、纤维素等，所用的洗脱液因固定相的不同而不同，一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚等组成的混合溶剂。
当采用液-液逆流萃取法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤的产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法或超临界流体萃取法初步纯化后的产物。一般先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性杂质，然后用合适极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物。
该提取物可以单独或与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所制得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等。
本发明质量控制方法可包括以下含量测定方法中的一种或两种1.总黄酮精密称取槲皮苷对照品适量(约5mg)，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密吸取槲皮苷对照品溶液0.5、1、2、3、3.5ml于25ml量瓶中，加5％NaNO2溶液1ml，摇匀，放置6min；然后加10％Al(NO3)3溶液1ml，摇匀，放置6min；再加4％NaOH溶液10ml，最后用稀醇稀释定容至刻度，摇匀，放置15min，并随行做空白对照，于506nm波长处测定吸光度。以槲皮苷对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
精密称取干燥甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物样品各3份，每份20mg，置10mL量瓶中，加50％乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述样品溶液2mL，槲皮苷对照品溶液0.5mL、3.5mL于25ml量瓶中，加5％NaNO2溶液1ml，摇匀，放置6min；然后加10％Al(NO3)3溶液1ml，摇匀，放置6min；再加4％NaOH溶液10ml，最后用稀醇稀释定容至刻度，摇匀，放置15min，于506nm波长处测定吸光度，外标两点法计算含量。
2.甜菊苷、莱鲍迪苷A色谱条件色谱柱Phenomenex Luna NH2(250mm*4.6mm，5μm)；流动相乙腈-水(78∶22)；流速1ml/min；检测波长210hm；柱温35℃。
标准曲线绘制分别精密吸取甜菊苷对照品溶液(浓度为0.67μg/μL)、莱鲍迪苷A对照品溶液(浓度为0.72μg/μL)、0、2、4、6、8、10μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
含量测定精密称取3批甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物样品各3份，每份约20mg，置10mL量瓶中，加70％乙腈超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为甜菊苷、莱鲍迪苷A含量测定的供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液5μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。
3.木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]色谱条件色谱柱Hypersil ODS2(250mm*4.6mm，5μm)；流动相乙腈-0.2％磷酸水梯度洗脱，17％乙腈～25％乙腈(0～30min)，25％乙腈～35％乙腈(30min～40min)；流速1.0mL/min；检测波长254nm；柱温35℃。
标准曲线绘制分别精密吸取木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液(浓度为0.082μg/μL)、槲皮苷对照品溶液(浓度为0.0232μg/μl)和槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷](浓度为0.08μg/μL)0、2、4、6、8、10μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
含量测定精密称取3批提取物样品各3份，每份约20mg，置10mL量瓶中，加20％乙腈超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]测定的供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。
具体实施例方式
实施例1甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物制备工艺甜叶菊干燥叶片1kg，50％乙醇14L回流提取3次，每次提取1小时，减压回收溶剂，得提取物，加水分散溶解，使水溶液浓度为1∶8(生药量∶分散毫升数)，通过4L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1∶6，上样量为250mg/mL(以生药量计)，水洗脱3倍树脂体积进行除杂，50％乙醇洗脱5倍树脂体积，洗脱流速为2BV/h，收集50％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物。测定甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物中总黄酮含量为36％，其中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]三种成分的含量为4％。甜菊苷含量为34％，莱鲍迪苷含量为10％。
实施例2甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物制备工艺甜叶菊干燥叶片2kg，70％乙醇12L，回流提取3次，每次提取1.5小时，回收溶剂，提取物加水分散溶解，使水溶液浓度为1∶6(生药量∶分散毫升数)，通过6L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速4BV/h，树脂柱径高比为1∶7，上样量为400mg/mL(以生药量计)，水洗脱2倍树脂体积进行除杂，70％乙醇洗脱4倍树脂体积，洗脱流速为4BV/h，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物。测定甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物中总黄酮含量为32％，其中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]三种成分的含量为3％。甜菊苷含量为30％，莱鲍迪苷含量为7％。
实施例3甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物制备工艺甜叶菊干燥叶片10kg，70％乙醇12L回流提取2次，每次提取2小时，回收溶剂，提取物加水分散溶解，使水溶液浓度为1∶4(生药量∶分散毫升数)，通过7LAB-8大孔吸附树脂，吸附流速4BV/h，树脂柱径高比为1∶9，上样量为350mg/mL(以生药量计)，水洗脱4倍树脂体积进行除杂，90％乙醇洗脱4倍树脂体积，洗脱流速为4BV/h，收集90％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物。测定甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物中总黄酮含量为30％，其中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]三种成分的含量为3％。甜菊苷含量为40％，莱鲍迪苷含量为15％。
实施例4甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物制备工艺甜叶菊干燥叶片10kg，70％乙醇12L回流提取2次，每次提取2小时，回收溶剂，提取物加水分散溶解，使水溶液浓度为1∶10(生药量∶分散毫升数)，通过7L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速4BV/h，树脂柱径高比为1∶4，上样量为150mg/mL(以生药量计)，水洗脱2倍树脂体积进行除杂，70％乙醇洗脱4倍树脂体积，洗脱流速为2.0mL/min，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物。测定甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物中总黄酮含量为31％，其中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷及槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]三种成分的含量为3％。甜菊苷含量为30％，莱鲍迪苷含量为12％。
实施例5甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物片的制备甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物100g
淀粉100g上述组分混合均匀，加滑石粉适量，压制成1000片。
实施例6甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物复方制剂的制备甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物50g枳实总黄酮提取物50g银杏提取物 100g上述组分混合均匀，装入硬明胶胶囊中，共2000粒胶囊。
权利要求
1.一种甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物，其特征在于该提取物由甜叶菊中提取获得，并含有以下主要成分甜菊苷，莱鲍迪苷A，木犀草素，槲皮素，木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷，芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，槲皮苷，槲皮素-3-O-β-D-阿拉伯糖苷，槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]及其衍生物等。
2.如权利要求1所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物，其特征在于甜叶菊为菊科甜菊属多年生草本植物甜叶菊Stevia Rebaudiana Bertoni.的全部植株或任何部位，如根、根茎、茎、叶、花穗、果实等。
3.如权利要求1所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物，其特征在于上述甜菊苷类和黄酮类成分含量总和以重量计为5～100％。
4.如权利要求3所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物，其特征在于甜菊苷、莱鲍迪苷及总黄酮的含量占全部甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物含量以重量计为5～100％。
5.如权利要求1所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物，其特征在于上述甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物可应用于食品工业，还可用于医药工业作矫味剂(矫正某些药物的异殊、怪味)和辅料(片剂、丸剂、胶囊等)，以及用于食品保鲜和药品防霉等。
6.如权利要求1～5所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物，其特征在于采用溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界流体萃取法、柱色谱法、液-液逆流分配色谱法等任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备。
7.如权利要求6所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物制备方法，其特征在于，在使用这些方法进行制备时，包括以下一个或几个步骤提取所用溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶剂；提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取、高压提取等；过滤包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任一种澄清剂或其组合醇沉剂，明胶，高岭土，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三醇，壳聚糖以及天然澄清剂成品如101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂等；浓缩包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等；干燥包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。
8.如权利要求6所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物制备方法，其特征在于当使用大孔吸附树脂法时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性等任何一种类型，如D101、D4020、HPD400、AB-8、S-8、HZ-806等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、HPD400、D101等，所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等。
9.如权利要求8所述的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物制备方法提取物制备方法，其特征在于选用AB-8、HPD400等中等极性或弱极性大孔吸附树脂作为纯化用树脂，甜叶菊乙醇提取物以生药量(g)分散毫升数计的上样液浓度1∶2～1∶14，吸附流速2～9BV/h，树脂柱径高比1∶5～1∶10，以生药量计的上样量为100～300mg/mL，0～20％乙醇洗脱1～4倍树脂体积进行除杂，用40～90％乙醇洗脱3～6倍树脂体积，洗脱流速为2～9BV/h。
10.如权利要求1～5所述的提取物的应用，其特征在于，该提取物可以单独或与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所制得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等。
全文摘要
本发明公开了一种从甜叶菊中提取得到的甜菊苷类和黄酮类提取物及其制备方法。该提取物主要包括甜菊苷，莱鲍迪苷A，木犀草素，槲皮素，木犀草素－7－O－β－D葡萄糖苷，芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖苷，槲皮苷，槲皮素－3－O－β－D－阿拉伯糖苷，槲皮素－3－O－[4－O－反式－咖啡酰基－α－L－鼠李糖－(1→6)－β－D－半乳糖苷]及其衍生物等。该提取物可由溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界流体萃取法、柱色谱法、液－液逆流分配色谱法等任意一种方法，或这些方法的任意组合制备获得。所制得的甜叶菊甜菊苷类和黄酮类提取物中各种甜菊苷类和黄酮类成分百分含量的总和为5～100％(w/w)，其中甜菊苷、莱鲍迪苷A两种甜菊苷类和木犀草素－7－O－β－D－葡萄糖苷、槲皮苷、槲皮素－3－O－[4－O－反式－咖啡酰基－α－L－鼠李糖－(1→6)－β－D－半乳糖苷]三种黄酮类成分的含量之和为5～100％(w/w)。
文档编号A61P3/06GK101062078SQ20071011131
公开日2007年10月31日 申请日期2007年6月18日 优先权日2007年6月18日
发明者石任兵, 刘斌, 姜华 申请人:石任兵, 刘斌