专利名称：：利用大孔树脂制备细梗香草总皂苷提取物的方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物提取物的制备方法，尤其涉及一种利用大孔树脂制备细梗香草总皂苷提取物的方法及用途。
背景技术：
：细梗香草，又名排草、香排草、香草、毛柄珍珠菜，系报春花科(Primulaceae)珍珠菜属植物，主要分布在我国西南华南地区。民间用于治疗感冒咳喘、风湿痛、抗肿瘤、月经不调、神经衰弱、补虚、驱蛔。关于细梗香草的活性成分研究，多为田景奎教授研究，国内外少见报道，通过对细梗香草全草化学成分进行了研究，从中共分离得到了16个化合物，包括13个皂苷和3个黄酮，13个皂苷均为新化合物。包括三种类型皂苷元，其中两种皂苷元3卩,16a,22a-三羟基-28—13-内酯-齐墩果烷和3卩,22a-二羟基-15a，16a-环氧-齐墩果-12-烯为首次报道，糖有三糖、四糖、五糖。对细梗香草总皂苷进行抗肿瘤活性研究，发现细梗香草总皂苷有非常强的抑制卵巢癌细胞A2780细胞的作用(IC500.1//g/mL)，有很好的开发前景。
发明内容本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种利用大孔树脂制备细梗香草总皂苷提取物的方法及用途。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种利用大孔树脂制备细梗香草总皂苷提取物的方法，该方法为取细梗香草药材粉碎或用细梗香草饮片，加入质量体积比为615倍量的水或含水乙醇，含水乙醇中乙醇的体积比为10%-95%，加热回流提取24次，每次l3h，过滤，合并提取液，浓縮至相对密度Ll1.3;过滤或离心后通过填充有大孔树脂的层析柱，提取液中的细梗香草总皂苷与大孔树脂的重量比为1:510，上柱流速14BV/h，树脂径高比为1:31:9;用水洗涤大孔树脂38BV，洗脱流速为234BV/h，水洗脱液弃去；用体积比为2095%含水乙醇洗脱大孔树脂，流速为24BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓縮至相对密度为1.11.25，减压或喷雾干燥，得细梗香草总皂苷提取物。进一步地，所述的大孔树脂为聚苯乙烯型大孔树脂。一种上述方法制备的细梗香草总皂苷提取物在用于制备治疗肿瘤的药物方面的用途。本发明的有益效果是本发明采用的大孔树脂对细梗香草总皂苷的吸附量大，被解吸完全，所得总皂苷的含量高，因此，可以显著提高细梗香草总皂苷的提取率，降低生产成本。细梗香草总皂苷提取物具有显著的抗肿瘤作用，可以用于制备治疗肿瘤的药物。具体实施例方式大孔吸附树脂是指由苯乙烯、a-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等为原料加入一定量致孔剂二乙烯苯聚合而成的球状颗粒，直径一般在0.3-1.25mm之间。本发明细梗香草总皂苷提取物的制备方法为取细梗香草药材粉碎或用细梗香草饮片，加入质量体积比为615倍量的水或含水乙醇，含水乙醇中乙醇的体积比为10%-95%，加热回流提取24次，每次l3h,过滤，合并提取液，浓縮至相对密度Ll1.3;过滤或离心后通过填充有大孔树脂的层析柱，提取液中的细梗香草总皂苷与大孔树脂的重量比为1:510，上柱流速l4BV/h，树脂径高比为1:31:9;用水洗涤大孔树脂38BV，洗脱流速为24BV/h，水洗脱液弃去；用体积比为2095%含水乙醇洗脱大孔树脂，流速为24BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓縮至相对密度为1.11.25，减压或喷雾干燥，得细梗香草总皂苷提取物。其中，离心的转速为400016000转/分钟；大孔树脂为聚苯乙烯型大孔树脂。上述方法得到的提取物中细梗香草总皂苷重量含量为20%70%、细梗香草苷B重量含量不低于10%。细梗香草总皂苷的抗肿瘤实验体外抗肿瘤细胞筛选实验.实验方法a细胞培养运用组织细胞培养技术培养各类肿瘤细胞，细胞接种于含10%新生牛血清RPMI-1600培养液中。培养环境为5%(:02，37'C及饱和湿度。细胞传代为23d。贴壁细胞以0.25%胰蛋白酶消化适当后l:3传代。悬浮细胞离心收集后传代。b.体外細胞生长抑制实验(MTT法)取对数生长期的人癌细胞(0.5-1.0)xl()S/mL，分装于96孔培养板中，0.2mL/孔。实验设阴性对照组、溶剂对照组、阳性药(Taxol)组和5-6个不同浓度细梗香草药物组。药物与细胞培养72h，在实验结束前4h每孔加入20ulMTF液(5ug/mL)。4h后吸弃培养液，待结晶溶解后置酶联检测仪，用570nm波长测各孔的吸光度值(A)，按下列公式求生长抑制率，并用POMS软件程序求出半数抑制浓度(IC50)，进行评价和比较。生长抑制輛T^^x腦试验中釆用的人食道癌细胞Eca-109,人胃癌细胞BGC-823，肠癌C38，白血病细胞Molt-4，肺癌细胞株A549，结肠腺癌细胞HCT-8，宫颈癌细胞HeLa，肝癌H22，卵巢癌A2780,乳腺癌MCF7，S哪肉瘤，人口腔上皮癌细胞KB等十二种瘤株进行了ICso测定。对鼠源性瘤株体内抑制作用选取腹腔传代7d，腹部膨隆明显的Swo肉瘤、肝癌H22和结肠癌细胞株colon26小鼠，在超净工作台中，腹部皮肤消毒，用一次性无菌采血器经腹壁刺入腹腔，抽取腹水，放入无菌烧杯中，以生理盐水稀释成1:3的癌细胞混悬液，镜下观察计数，并调整瘤细胞浓度至lxl07/mL。接种于18-22gICR小鼠右侧腋部皮下0.2mL/只。接瘤次日，将实验小鼠随机分为对照组(生理盐水20mL/kg);CTX组(30mg/kg);细梗香草皂苷组5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg三个给药剂量组，共5组，每组10只。每天灌胃给药l次，隔日称量体重l次,连续给药10d，每天观察ICR小鼠反应情况，包括进食、大小便性状、精神状态等。停药次日，将动物称重后脱臼处死，剥离出皮下肿块称重，比较各组间肿瘤重量的差异性。并计算出肿瘤抑制百分率。统计学处理方法采用组间t-检验。肿瘤抑制率:对照组平^t^l平均瘤重y对照组平均瘤重结果5实验表明除肺癌细胞株A549和乳腺癌MCF7外，细梗香草皂苷对其它IO种肿瘤细胞均有较好的抑制作用。见表l表1:细梗香草皂苷体外对12种瘤株的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>细梗香草皂苷对鼠源性瘤株抑制效果见表2、表3和表4。实验表明细梗香草皂苷对三种移植性鼠源性瘤株均有较好的抑制作用，特别对结肠癌细胞株colon26移植瘤抑制率超过50%。表2:细梗香草皂苷对小鼠S180移植瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>与模型对照组比较<0.05"PO.Ol表3:细梗香草皂苷对小鼠H^移植瘤的抑制作用组别例剂体重(g)瘤重抑瘤数里(g)率nmg/kg实验前实验后X土S%阴性对照组(生理盐20.57±0.水)10等体积96细梗香草24.84土1.7皂苷10208细梗香草20.18±1.皂苷101013细梗香草皂苷105环磷酰胺组(CTX)103020.4±0.8823.97土1.1与模型对照组比较4<0.05，"PO.01表4:细梗香草皂苷对小鼠结肠癌细胞株cokm26移植瘤的抑制作用^组别例卞/,数剂量体重(g)瘤重(g)抑瘤率nmg/kg实验前实验后X土S%阴性对照组(生理盐等体18.6±0.水)10积728.3±3.21.83±0.43细梗香草皂苷102018.7±0.425.9±1.80.80±0.3351.3**细梗香草皂苷101020.2±1.430.7±2.51.59±0.2629.5细梗香草皂苷10519.8±0.828.8±2.31.77±0.286.87环磷酰胺组20.5±1.30(CTX)10_J_27.2±3.20.89±0.2550.7**与模型对照组比较^P0.05"P<0.01实施例1取粉碎后的细梗香草药材2kg，加6倍量水，加热回流提取2次，每次lh，过滤，合并提取液，浓縮至相对密度l.l;过滤后通过DHM型大孔树脂，提取液按细梗香草总皂苷含量计与干树脂的重量比为1:5,上柱流速lBV/h，树脂径高比为1:3;用水洗涤树脂3BV，洗脱流速为2BV/h，水洗脱液弃去；用含20%含水乙醇洗脱8BV,流速为2BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓縮至相对密度为1.1，减压干燥，得细梗香草总皂苷提取物。测得细梗香草总皂苷含量为20%,细梗香草皂苷B含量为10.2%。实施例2将细梗香草饮片lkg，加15倍量95%乙醇，加热回流提取4次，每次3h，过滤，合并提取液，浓縮至相对密度1.3;离心后通过AB-8型大孔树脂的层析柱，提取液按细梗香草总皂苷含量计与干树脂的重量比为1:10,上柱流速4BV/h，树脂径高比为1:9;用水洗涤树脂8BV，洗脱流速为4BV/h，水洗脱液弃去；用含95%含水乙醇洗脱，流速为4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓縮至相对密度为1.25，减压或喷雾干燥，得细梗香草总皂苷提取物。测得细梗香草总皂苷含量为70%,细梗香草皂苷B含量为55%。实施例3取粉碎后的细梗香草药材5kg，加8倍量70%，加热回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并提取液，浓缩至相对密度1.2;离心(4000转/分钟)后通过AB-8型大孔树脂，药液按细梗香草总皂苷含量计与干树脂的重量比为1:5，上柱流速2BV/h，树脂径高比为1:5;用水洗涤树脂3BV，洗脱流速为4BV/h，水洗脱液弃去；用含70%水乙醇洗脱3BV，流速为2BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓縮至相对密度为1.1(50'C热测)，减压干燥，得细梗香草总皂苷提取物。测得细梗香草总皂苷含量为60%，细梗香草皂苷B含量为25%。实施例4细梗香草药材饮片5kg，加10倍量10%乙醇，加热回流提取3次，每次1.0h，过滤，合并提取液，浓縮至相对密度1.15;过滤后通过D2。,型大孔树脂，药液按细梗香草总皂苷含量计与干树脂的重量比为1:9,上柱流速3BV/h，树脂径高比为1:7;用水洗涤树脂5BV，洗脱流速为4BV/h，水洗脱液弃去；用含50%水乙醇洗脱IOBV，流速为4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓縮至相对密度为1.25(50'C热测)，喷雾干燥，得细梗香草总皂苷提取物。测得细梗香草总皂苷含量为55。％，细梗香草皂苷B含量为10.6%。实施例5细梗香草药材饮片5kg，加15倍量水，加热回流提取2次，每次lh,过滤，合并提取液，浓縮至相对密度1.25;离心(8000转/分钟)后通过HPD450大孔树脂，药液按细梗香草总皂苷含量计与干树脂的重量比为1:6，上柱流速4BV/h，树脂径高比为1:9;用水洗涤树脂2BV，洗脱流速为3BV/h，水洗脱液弃去；用含50X水乙醇洗脱5BV，流速为3BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓縮至相对密度为1.2(5(TC热测)，喷雾干燥，得细梗香草总皂苷提取物。测得细梗香草总皂苷含量为45%，细梗香草皂苷B含量为13.5%。权利要求1、一种利用大孔树脂制备细梗香草总皂苷提取物的方法，其特征在于，该方法为取细梗香草药材粉碎或用细梗香草饮片，加入质量体积比为6～15倍量的水或含水乙醇，含水乙醇中乙醇的体积比为10％-95％，加热回流提取2～4次，每次1～3h，过滤，合并提取液，浓缩至相对密度1.1～1.3。过滤或离心后通过填充有大孔树脂的层析柱，提取液中的细梗香草总皂苷与大孔树脂的重量比为1∶5～10，上柱流速1～4BV/h，树脂径高比为1∶3～1∶9。用水洗涤大孔树脂3～8BV，洗脱流速为2～4BV/h，水洗脱液弃去。用体积比为20～95％含水乙醇洗脱大孔树脂，流速为2～4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.1～1.25，减压或喷雾干燥，得细梗香草总皂苷提取物。2、根据权利要求1所述利用大孔树脂制备细梗香草总皂苷提取物的方法，其特征在于，所述的大孔树脂为聚苯乙烯型大孔树脂。3、一种权利要求1所述方法制备的细梗香草总皂苷提取物用于制备治疗肿瘤的药物方面的用途。全文摘要本发明公开了一种利用大孔树脂制备细梗香草总皂苷提取物的方法及用途，它是将细梗香草药材粉碎或直接用细梗香草饮片，加质量体积比为6～15倍量水或体积比为10％～95％乙醇，加热回流提取，过滤，合并提取液，浓缩；过滤或离心后通过填充有大孔树脂的层析柱，先用水洗涤树脂，水洗脱液弃去；再用含水乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩，减压或喷雾干燥，得细梗香草总皂苷。本发明采用的大孔树脂对细梗香草总皂苷的吸附量大，被解吸完全，所得总皂苷的含量高，因此，可以显著提高细梗香草总皂苷的提取率，降低生产成本。细梗香草总皂苷提取物具有显著的抗肿瘤作用，可以用于制备治疗肿瘤的药物。文档编号A61P35/00GK101507740SQ20091009678公开日2009年8月19日申请日期2009年3月19日优先权日2009年3月19日发明者付红伟,应弘梅,琳张,欣王,田富饶,田景奎,郑筱祥申请人:浙江大学