专利名称：一种新型促肝细胞生长因子、制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型促肝细胞生长因子、制备方法及其用途。本发明还涉及表达该新型促肝细胞生长因子的基因工程菌。
背景技术：
重组蛋白可通过直接表达或以融合蛋白的形式进行表达。在第一种方法中，采用重组技术生产的人促肝细胞生长因子以不溶的包涵体形式表达，包涵体经过变性、复性后再进行纯化。
在第二种方法中，可溶表达的重组人促肝细胞生长因子是以融合蛋白的形式表达的。例如参考文献①.Francavilla Antonio T等；Mammalian augmenter of liver regeneratingand variant thereof； EP668291，1995。
②.杨晓明等；人肝增殖素.；中国专利96103203。
③.贺福初等；重组人肝细胞生成素的生产方法及其治疗严重肝病的用途；中国专利97101932。
④.Francavilla等；Mammalian augmenter of liver regeneration(ALR)humanand rat；美国专利5550037。
⑤.Hagiya等；Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liverregeneration(ALR)geneExpression of biologically active recombinant ALR anddemonstration of tissue disstribution。Proc.Natl.Acad.Sci.1994(91)8142-8146。
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⑧.孔祥平等；重组人源促肝细胞生长素及其生产方法和临床用途；中国专利99110801.9；2001。
张谊俊等从新生动物如乳猪等肝脏提取的促肝细胞生长因子对重症肝炎、肝硬化、慢性活动性肝炎等有很好的治疗效果。有些医院曾采用人胎肝治疗重症肝炎也取得满意效果，但受来源限制，不能满足临床需要。基因工程技术为人促肝细胞生长因子的临床应用带来了希望。国内重组人促肝细胞生长因子的研制在国际上也处于领先地位。国外对重组促肝细胞生长因子的研究重点之一是其巯基氧化酶活性的研究；T.Lisowsky等人采用含有6个组氨酸的融合蛋白的形式表达了人促肝细胞生长因子，此融合蛋白含有黄色色素，T.Lisowsky同时发现该黄色色素为FAD，是巯基氧化酶活性不可缺少的辅基。
目前国内外文献中报导的以非融合蛋白形式表达的重组人促肝细胞生长因子(recombinant human augmenter liver regeneration，rhALR)都是以大肠杆菌为宿主，表达产物以包涵体形式存在。本发明人分别构建了以包涵体和可溶形式表达目的蛋白的基因工程大肠杆菌。并发现，以可溶形式表达的基因重组hALR，经分离纯化后，含有黄色色素，在高浓度变性剂存在下，通过加热或调节pH，可去除黄色色素。经检测证实该色素源自FAD，因此，以可溶形式表达的基因重组人促肝细胞生长因子是一种新型含有FAD的促肝细胞生长因子(rFALR)。与不含FAD的以包涵体形式表达的促肝细胞生长因子(rhALR)相比，rFALR对CCl4损伤小鼠肝功能恢复的促进作用强于不含FAD的rhALR。由于目的蛋白以可溶形式表达，无需进行包涵体变性及蛋白复性，大大简化了蛋白纯化工艺，使收率得到提高，并降低了制造成本，为大规模生产打下良好基础。

发明内容
本发明的目的是提供一种新型的含有FAD的促肝细胞生长因子(rFALR)、其制备方法及用途，其产物以可溶形式表达，不形成包涵体，因此简化了制备工艺，同时提高了收率，大大降低了成本。并且具有更高的生物活性。有利于工业化生产。
根据本发明，提供了1、一种新型重组人促肝细胞生长因子(rFALR)，其特征在于含有如序列表中序列2所示的氨基酸序列和FAD辅基。
2、一种能表达以上项1的重组人促肝细胞生长因子的基因工程菌，其特征在于同时含有重组人促肝细胞生长因子和细菌素释放蛋白的表达载体。
3、构建能表达以上项1的重组人促肝细胞生长因子的基因工程菌的方法，包括含有目的基因的载体的构建和转化。
4、构建能表达以上项1的重组人促肝细胞生长因子的基因工程菌的方法，进一步包括引入可表达细菌素释放蛋白(bacteriocin release proteinBRP)的质粒。
5、以上项1的新型重组人促肝细胞生长因子在制备治疗肝病的药物中的用途。
6、以上项5的用途，其中所述肝病为重症肝炎、肝硬化或慢性活动性肝炎。
7、制备以上项1的新型重组人促肝细胞生长因子的方法，包括以下步骤A、构建能同时含有重组人促肝细胞生长因子和细菌素释放蛋白的表达载体的基因工程菌；B、培养该基因工程菌；C、纯化目标蛋白。
本发明采用PCR的方法从cDNA文库中获得人ALR基因，构建能表达ALR的工程菌。并通过引入可表达细菌素释放蛋白(bacteriocin releaseprotein BRP)的质粒pJL3，实现ALR在大肠杆菌的可溶性表达。获得一种新型的含有FAD的促肝细胞生长因子(rFALR)。细菌素是细菌中产生并释放的一种蛋白，大肠杆菌中细菌素的释放依赖于BRP基因的表达，将含BRP基因的pJL3质粒转入大肠杆菌后，在诱导条件下，BRP基因表达，可激活外膜上的磷脂酶A，增加大肠杆菌壁的通透性，从而使外源蛋白能够分泌到培养基中。
包涵体经过裂解、复性，再对复性液进行层析纯化，获得目的蛋白；rFALR以可溶形式表达，可直接进行层析纯化，获得目的蛋白(目的蛋白经分析，具有如序列表中序列2所示的氨基酸序列)。
将rFALR与变性剂混合，通过调节溶液pH或温度，使FAD与ALR解离。再用凝胶过滤的方法将蛋白与FAD分离后用全波长扫描、LC-MS等方法来研究色素性质。
本发明对目的蛋白进行了体内活性研究。采用CCl4损伤小鼠模型，研究rhALR及rFALR的降转氨酶活性、和刺激肝细胞内DNA合成的活性。因此可用于治疗各种肝病尤其对于重症肝炎、肝硬化、慢性活动性肝炎等肝损伤性疾病。


图1是全波长扫描图，其中1为FAD标准品，2、3和4为rFLAR在不同条件下分离的色素。
图2是酶活性结果图。
图3是菌1破壁后包涵体和上清液电泳分析图，其中1包涵体，2裂解上清液。
图4是菌1表达及纯化结果图，其中1为菌体，2为纯化后蛋白(非还原电泳)，3为分子量标准97000、66000、45000、30000、20100、14400。
图5是菌2表达及纯化结果电泳图，其中1为分子量标准(同图4)，2为纯化后蛋白(非还原电泳)；3为菌体。
图6是是菌1和2表达产物纯化后蛋白的电泳图，其中1、2分别为菌1、菌2表达产物纯化后的蛋白(还原电泳)，3为分子量标准(同图4)。
图7是rhALR扫描图(ALRscan)图8是FAD加入到rhALR的扫描图(F+ALRscan)图9是rFALR的扫描图(FALRscan)实施例方法一(菌1)1.工程菌的构建引物设计forwardprimer5’gacatatgcggacgcagcagaagcgggacac 3’reverseprimer 5’gtctcgagtgcggcctctagtcacaggagccatc 3’采用PCR的方法从人cDNA文库中获得ALR基因片段，PCR反应体系模板2μl10xPCR buffer(不含Mg) 5μlMgCl25μlTaq 0.5μlFP 1μlRP 1μldNTP1.5μlddH2O 34μl94℃5分钟。然后30个循环(94℃ 60秒，67℃ 60秒，72℃ 60秒)，然后72℃ 10分钟，PCR产物大小约为400bp。
PCR产物与T-VECTOR(PROMEGA)用T4连接酶连接，然后转化DH5α，挑取白斑，用QIAGEN的MINI质粒提取柱提取质粒并用酶切验证，找出正确片段插入T-VECTOR的质粒后，将质粒用NDEI/XHOI酶切，琼脂糖电泳并回收。同时用NDEI/XHOI酶切质粒pET22B，胶纯化后回收。
将PCR片段连接到pET-22B，转化非表达宿主菌中(DH5α)验证，测序，具有如序列表中序列1所示的核苷酸序列，然后转化表达宿主菌(BL21-GOLD(DE3))，获得菌1。
2.发酵将菌1接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃培养3小时，用IPTG诱导，继续培养3小时后，离心收集菌体。电泳检测表达结果如图3。
3.目的蛋白纯化将上述菌体按1∶10(W/V)悬于50mmol/L Tris HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0缓冲液中，超声破碎，然后于10,000g离心15min，分别收集包涵体沉淀，进行电泳检测，结果如图4。结果显示在包涵体和上清液中都含有大量目的蛋白，只是上清液中杂蛋白较多。
将上清液中的目的蛋白调pH至4.5----6.0，离心，收集沉淀。并将沉淀重新悬浮于pH6.0的缓冲液中。
将上述含有目的蛋白的溶液上阳离子交换层析柱CM Sepharose FastFlow(Amershan Bioscience)纯化，平衡液为20mmol/L NaAc pH6.0，上样后，用平衡液洗去未结合蛋白，再用NaCl连续梯度洗脱，获得目的蛋白(rFALR)。
包涵体用2mol/L尿素溶液洗涤后，将包涵体过夜溶解于8mol/L尿素、50mmol/L Tris HCl、pH8.0溶液中，再于15,000g离心，回收上清液。
裂解液用DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)柱纯化，平衡液为8mol/L尿素、20mmol/L Tris HCl pH 8.0；上样后用平衡液洗去未结合的蛋白，再用NaCl连续梯度洗脱，收集洗脱峰。
将目的峰按1∶10稀释于含有0.1mmol/L GSSG、1mmol/L GSH、20mmol/L Tris HCl pH8.0缓冲液中，于4℃过夜。
将上述复性液调pH至5.5，于15,000g离心去除沉淀，用CMSepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)柱纯化，平衡液为20mmol/LNaAc pH5.5，上样后用平衡液洗去未结合的蛋白，再用NaCl连续梯度洗脱，收集洗脱峰。
将目的峰浓缩后用Superdex 75(Amersham Biosciences)柱进行精制，平衡液为20mmol/L NaAc pH5.5。收集目的蛋白(rhALR)。
方法二(菌2)1.工程菌构建在方法一所构建的工程菌基础上，再引入可表达细菌素释放蛋白(bacteriocin release protein BRP)的质粒pJL3，在外源条件诱导下，通过BRP基因表达，激活外膜上的磷脂酶A，增加大肠杆菌壁的通透性，从而使外源蛋白能够分泌到培养基中。实现外源蛋白的可溶性表达。pET22B和pJL3分别为氨苄青霉素抗性和氯霉素抗性；均为IPTG诱导。
2.发酵将菌2接种于含有氨苄青霉素和氯霉素的的LB培养基中，于37℃培养3小时，用IPTG诱导，继续培养3小时后，离心收集菌体。电泳检测表达，结果如图5、图6。
3.目的蛋白纯化收集菌体并悬浮于50mmol/L pH8.0的Tris HCl缓冲液中，超声或匀浆破碎，于10000rpm离心收集上清液将上清液pH调至4.5----6.0，离心，收集沉淀。并将沉淀重新悬浮于pH6.0的缓冲液中。
将上述含有目的蛋白的溶液上阳离子交换层析柱CM Sepharose FastFlow(Amershan Bioscience)纯化，平衡液为20mmol/L NaAc pH6.0，上样后，用平衡液洗去未结合蛋白，再用NaCl连续梯度洗脱，获得目的蛋白。
上述目的蛋白经超滤浓缩后，再经过凝胶过滤层析柱Superdex 75(Amersham Biosciences)，收集目的峰，浓缩，可获得高纯度的新型促肝细胞生长因子(rFALR)。
分析1.FAD的确认可溶性表达产物为黄色，用全波长扫描确定新型促肝细胞生长因子含有FAD的特征峰形，结果如图1。
在8mol/L尿素存在下，于65℃加热15min(或将pH调至4.0)，再经Superdex 75(Amersham Biosciences)柱分离，可将蛋白和色素分离。分离后的色素经全波长扫描、RP-HPLC和LC-MS分析，结果与FAD标准品一致(图1)，该蛋白具有如序列表中序列2所示的氨基酸序列。
以上结果说明新型促肝细胞生长因子含有FAD。
另外，将rhALR与FAD混合，扫描，再将混合物经过凝胶过滤进行分离，浓缩目的蛋白后再扫描。结果表明，rhALR不与FAD结合。另在rhALR复性过程中加入FAD，rhALR也不与FAD结合。
将FALR经过上述同样方法处理，扫描结果表明，FAD与FALR结合。以上结果参见图7、8、9。
以上事实充分说明，FALR不同于rhALR，FALR与FAD可形成稳定的复合物。而这种结合是通过表达实现的。
2.体内活性检测方法一降转氨酶活性研究
42只昆明种雄性小鼠随机分为6组，分别为生理盐水组、损伤模型组、rFALR组和rhALR组。每天给药一次，第三天给药1小时后，除生理盐水组以外，其余各组小鼠，分别腹腔注射0.2％的CCl4油溶液(0.2ml/只)，禁食18小时后再给药1次，2小时后眼眶取血，分离血清。用南京建成生物工程公司生产的试剂盒测定谷丙转氨酶。
如表1和图2所示的结果表明，rFALR降低肝损伤小鼠转氨酶的效果优于rhALR。
表1 降转氨酶活性

△vs生理盐水组**vs CCl4模型组方法二刺激肝细胞DNA合成16只昆明种雌性小鼠，皮下注射CCl4原液(0.1ml/只)，6小时后随机分为4组，每组4只。腹腔注射给药，对照组为生理盐水。17小时后，腹腔注射相同剂量的[3H]-TdR(生理盐水配制-50uCi/ml-0.3ml/只)进行标记，标记2h后断颈处死小鼠，剖腹取出全部肝组织(重约1g)。提取肝细胞DNA，并进行[3H]-TdR检测。
结果表明，rFALR具有明显的促进DNA合成作用，效果优于rhALR。
表2促进DNA合成活性([3H]-TdR掺入法)

3.巯基氧化酶活性研究按照Ellman法，将待测物(rFALR和rhALR)与还原后的溶菌酶在1-2mol/L尿素溶液中混合(pH7.5)，定时取一定量的反应物，加入DTNB至终浓度为10uM，于412nm处测定光吸收。
结果表明，仅rFALR有巯基氧化酶活性。
发明效果1、现有技术第一种方法中的基因重组人促肝细胞生长因子表达产物为包涵体，包涵体经裂解、复性、纯化后，所得产物为二聚体。本发明所述的基因重组新型促肝细胞生长因子表达产物以可溶形式存在，为含有FAD的二聚体；并且由于无需经过包涵体的裂解、复性，大大简化了生产工艺，提高了收率。
2、现有技术第二种方法中的可溶表达的重组人促肝细胞生长因子是以融合蛋白的形式表达的，与天然产物相比，其N端含6个组氨酸或谷胱甘肽S转移酶等，需对融合蛋白进行相应的酶切才能获得与天然蛋白氨基酸组成一致的蛋白。而我们采用的单质粒工程菌可同时表达rhALR和rFALR，双质粒工程菌的表达产物均为可溶性的新型人促肝细胞生长因子(rFALR)，双质粒工程菌的构建提高了目的蛋白的收率。其氨基酸组成与天然产物完全一致。
3、体内活性研究结果显示，rFALR对CCl4导致的小鼠肝损伤后肝功能的恢复能力明显优于rhALR，同时具有明显的促进DNA合成作用。即与现有技术第一种方法中的目的产物相比，本发明的目的产物具有更高的体内生物学活性。同时巯基氧化酶活性也明显高于现有技术第一种方法中的目的产物。
序列表11.txtSEQUENCE LISTING<110>华北制药集团有限责任公司<120>一种新型促肝细胞生长因子、制备方法及其用途<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>378<212>DNA<213>大肠杆菌(E.coli)<220>
<221>CDS<222>(1)..(375)<223>
<400>1atg cgg acg cag cag aag cgg gac acc aag ttt agg gag gac tgc ccg48Met Arg Thr Gln Gln Lys Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro1 5 10 15ccg gat cgc gag gaa ctg ggc cgc cac agc tgg gct gtc ctc cac acc96Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr20 25 30ctg gcc gcc tac tac ccc gac ctg ccc acc cca gaa cag cag caa gac144Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp35 40 45atg gcc cag ttc ata cat tta ttt tct aag ttt tac ccc tgt gag gag192Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu50 55 60tgt gct gaa gac cta aga aaa agg ctg tgc agg aac cac cca gac acc240Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys Arg Asn His Pro Asp Thr65 70 75 80cgc acc cgg gca tgc ttc aca cag tgg ctg tgc cac ctg cac aat gaa288Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys His Leu His Asn Glu85 90 95gtg aac cgc aag ctg ggc aag cct gac ttc gac tgc tca aaa gtg gat336Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys Ser Lys Val Asp100 105 110gag cgc tgg cgc gac ggc tgg aag gat ggc tcc tgt gac tag378Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp115 120 125<210>2<211>125<212>PRT<213>大肠杆菌(E.coli)<400>2Met Arg Thr Gln Gln Lys Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro1 5 10 15Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr20 25 30Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp35 40 45
序列表11.txtMet Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu50 55 60Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys Arg Asn His Pro Asp Thr65 70 75 80Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys His Leu His Asn Glu85 90 95Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys Ser Lys Val Asp100 105 110Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp
权利要求
1.一种新型重组人促肝细胞生长因子，其特征在于含有如序列表中序列2所示的氨基酸序列和FAD辅基。
2.一种能表达权利要求1的重组人促肝细胞生长因子的基因工程菌，其特征在于同时含有重组人促肝细胞生长因子和细菌素释放蛋白的表达载体。
3.构建能表达权利要求1的重组人促肝细胞生长因子的基因工程菌的方法，包括含目的基因的载体的构建，然后转化表达宿主菌(例如大肠杆菌、酵母菌等)。
4.构建能表达权利要求1的重组人促肝细胞生长因子的基因工程菌的方法，进一步包括引入可表达细菌素释放蛋白(bacteriocin release proteinBRP)的质粒。
5.权利要求1的新型重组人促肝细胞生长因子在制备治疗肝病的药物中的用途。
6.权利要求5的用途，其中所述肝病为重症肝炎、肝硬化或慢性活动性肝炎。
7.制备权利要求1的新型重组人促肝细胞生长因子的方法，包括以下步骤A、构建能同时含有重组人促肝细胞生长因子和细菌素释放蛋白的表达载体的基因工程菌；B、培养该基因工程菌；和C、纯化目标蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种新型含有如序列表中序列2所示的氨基酸序列和FAD辅基的新型重组人促肝细胞生长因子，同时含有重组人促肝细胞生长因子和细菌素释放蛋白的表达载体的基因工程菌，以及该工程菌的构建方法。
文档编号A61P31/00GK1566154SQ0314859
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月7日 优先权日2003年7月7日
发明者董爱华, 郝爱鱼, 郑学丽, 王明珠, 贾茜, 杨志, 白玉, 赵智祥, 黄晓兰, 吴洪涛, 王彦芳, 宋欣, 任乐民, 孔德清, 周兴军 申请人:华北制药集团有限责任公司