专利名称：一种疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防和治疗猪瘟、猪蓝耳病的疫苗组合物。
背景技术：
猪痕(classicalswine fever, CSF)是由猪痕病毒(classical swine fevervirus, CSFV)引起的一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。该病死亡率高达 80-90%，世界动物卫生组织(OIE)将其列为OIE疾病名录，我国也将其列为一类传染病。猪瘟的防制历来是全世界猪瘟存在国非常重视的课题，为此各国都投入了大量的人力、物力。 目前疫苗接种仍是控制猪瘟的重要手段。我国生产的猪瘟兔化弱毒疫苗有脾淋苗、乳兔组织苗、牛睾丸原代细胞苗及最近两年发展起来的猪睾丸传代细胞苗，疫苗免疫仍是我国防控猪瘟的基本手段。
猪繁殖与呼吸综合征(又称猪蓝耳)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。目前，该病是严重影响世界养猪业发展的重要疾病之一。疫苗接种是预防该病最有效的方法，国内外已有商品化的猪繁殖与呼吸综合征疫苗。既有灭活疫苗，也有用弱毒株制备的活疫苗。由于猪场的区域性及流行病学特征不同，有的猪场免疫经典蓝耳病的弱毒苗，有的免疫高致病性蓝耳病的弱毒苗，临床上给蓝耳病的免疫带来了很多困扰。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种正链RNA病毒，目前已发现两种基因型 欧洲型和美洲型，目前两种基因型在我国均有检出。PRRSV基因组大小约15kb，有多个开放阅读框，其中第一个开放阅读框(ORFla和ORFlb)含有PRRSV基因组的80%的序列，其编码有关RNA复制和转录的蛋白，包括RNA依赖性RNA聚合酶。(Straw et al，Diseases of Swine, 9th edition, chapter 24(2006))。ORFla 和 ORFlb 被翻译成一个多聚蛋白 (poly-protein)，该多聚蛋白被其中含有的蛋白酶活性区域切割成多个非结构蛋白，包括 Nspl_Nspl2(见，Vries et al, Seminarsin Virology,8 :33-47(1997) ；Allende et al, Journal of General Virology, 80 :307-315 (1999))。根据对国内高致病性蓝耳病毒株的遗传变异分析，高致病性毒株是目前优势流行毒株，且变异较快。高致病性猪蓝耳病为一类动物疫病，是目前严重危害中国养猪业的一类疫病，表现为对呼吸系统、繁殖系统、神经系统、免疫系统、消化系统均有强的致病力。病毒毒力极强，猪感染高致病性猪蓝耳病病毒可以产生高水平的病毒血症，高致病性猪蓝耳病对猪场造成的经济损失极大，有很多猪场因为该病遭到毁灭性打击，高致病性猪蓝耳病病毒已是我国现阶段蓝耳病流行的主导毒株这一事实已毋庸置疑。
PRRSV变异株各毒株0RF5基因氨基酸同源性为96% -100%,且NsP2基因都有30 个氨基酸的缺失，现有技术的毒株NVDC-JXA1-R，并作为预防高致病性蓝耳病疫情政府招标用疫苗株，在控制高致病性蓝耳病疫情中起到重要作用。随后又有两株高致病性蓝耳病变异株TJ M-F92株和HuN4-F112株活疫苗上市，上述毒种的效力和免疫效果上基本一致。
经典株蓝耳病毒株大多为美洲分离株，经典蓝耳病为二类动物疫病，表现为对仔猪呼吸系统和母猪繁殖系统有较强的致病力，病毒传播能力较强，经典蓝耳病病毒的复制能力要比高致病性蓝耳病病毒低10000倍以上，猪群一旦感染高致病性猪蓝耳病病毒，经典的蓝耳病病毒就很难在猪体内检测到。目前主要有猪繁殖与呼吸综合征活疫苗R98株、 猪蓝耳病ATCCVR-2332株、猪蓝耳病CH-1R株。
目前，PRRS活疫苗使用的弱毒株均为人工驯化毒株，均经过传代致弱而成为无毒力，且有良好的免疫原性的弱毒疫苗株，PRRSV变异株各毒株之间的同源性很高。通过对全国各地分离的PRRSV变异株进行完整的0RF5和部分Nsp2基因序列比较分析发现，来自不同猪场的PRRSV高度同源，新分离毒株的GP5基因相互之间也是高度同源，同源性达到 98. 5—100% (参见CN 101280292A说明书第9页2. 2. 7序列分析)。目前，普遍使用的 PRRSV活疫苗使用的变异株毒株有NVDC-JXAl-R株、TJM-F92株和HuM-Fl 12株，虽然不同毒株在毒力和生物学特征等方面存在差异，但其免疫原性相似，因为PRRS活疫苗变异毒株之间高度同源，具有免疫原性的蛋白均存在。因此，使用不同变异毒株的活疫苗，均可取得很好的免疫效果。
蓝耳病弱毒疫苗株除了变异株还有经典毒株，目前应用的疫苗毒株有猪繁殖与呼吸综合征R98株、ATCCVR-2332株、CH-1R株，经典毒株之间的同源性很高，其交叉保护性也很好，均能够很好地抵抗经典毒株强毒的攻击。各毒株制备的疫苗对经典蓝耳病强毒株均有良好的免疫保护性。
猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典毒株之间的同源性仅为69. 8-86. 2%，到目前为止也有经典毒株制备的疫苗可以保护高致病性蓝耳病毒的攻击的成功例子，但普遍认为，经典毒株对防控高致病性蓝耳病的效果远不如变异株的弱毒株疫苗的效果好。如果饲养管理水平较好，且饲养范围内未发生病蓝耳病流行的，经典株与变异株制备的疫苗也会有一定的交叉保护性。
这两种猪的传染病对养猪的危害非常严重，目前免疫接种仍是我国防制猪瘟、猪蓝耳病的重要措施。并且有文献表明猪蓝耳病疫苗与猪瘟疫苗同 时免疫会使疫苗的效力显著降低(湖北畜牧兽医，2009年第7期，猪蓝耳病免疫对猪瘟免疫效果影响的试验)，也有文献表明两种抗原同时免疫基本上无免疫抑制，其所指“基本上无免疫抑制”是指不会显著削弱对方的免疫效果(CN102727883A猪繁殖与呼吸综合征与猪瘟二联苗及其用途)。但在临床免疫程序中，这两种疫苗一般要间隔七天以上才能免疫另外一种疫苗，这也从侧面说明了在现有条件下，这两种疫苗同时免疫会发生干扰现象。但是由于两种疫苗的免疫时间比较接近，在临床应用上，多针次、多剂量、多种免疫程序难以合理安排，既繁琐、费时、费力、增加成本，且容易造成漏种，直接影响免疫效果。
杜喜忠等(“猪蓝耳病免疫对猪瘟免疫效果影响的试验”，《湖北畜牧兽医》，2009 年第7期，第21页，邮发代号38-352)公开了猪蓝耳病弱毒苗与猪瘟活疫苗同时免疫会对猪瘟免疫产生一定的影响，导致猪瘟活疫苗抗体滴度会降低1-2个滴度。发明内容
为解决现有技术的不足，本发明目的在于提供一种治疗和预防猪瘟、猪蓝耳病的疫苗组合物，，解决现有疫苗同时免疫时会产生干扰的问题，提供了该疫苗组合物中两类抗原的最佳配比。
本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括猪瘟病毒抗原和猪蓝耳病病毒抗原，其中，所述猪瘟病毒为猪瘟兔弱毒化株，所述猪蓝耳病抗原为高致病性猪蓝耳病病毒，所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例为100 1—100 10。
优选地，所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例为100 3—100 10。
优选地，所述猪蓝耳病抗原包括HuM-Fl 12株、附00及41_1 株、1'厕492株活的病毒。
本发明的另一目的在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括猪瘟病毒抗原和猪蓝耳病抗原，其中，所述猪瘟病毒为猪瘟兔弱毒化株，所述猪蓝耳病抗原为经典猪蓝耳病病毒，所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例为100 1-1000 I。
优选地，所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例为100 1-300 I。
优选地，所述猪蓝耳病抗原包括ATCCVR-2332株、CH-1R株、R98株活的病毒。
本发明的再一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括
培养增殖猪瘟病毒，制备所述猪瘟病毒抗原；
培养增殖猪蓝耳病病毒，制备所述猪蓝耳病病毒抗原；
按照所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例100 1-100 10进行配比， 制备所述疫苗组合物。
本发明的又一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括
培养增殖猪瘟病毒，制备所述猪瘟病毒抗原；
培养增殖猪蓝耳病病毒，制备所述猪蓝耳病病毒抗原；
按照所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例100 1-1000 I进行配比，制备所述疫苗组合物。
本发明的还一目的·在于提供所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪瘟和猪蓝耳病药物的应用。
本发明通过调整两种抗原之间的配比关系，找出了可以完全消除两种抗原之间干扰作用的最佳抗原配比，真正做到了消除两种抗原之间的免疫干扰作用，达到一针预防两种传染病的目的。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例1 6中以猪高致病性蓝耳病HuN4-F112毒株、JXAl-R毒株、 TJM-F92毒株为例说明猪瘟、蓝耳病全病毒抗原配比关系对免疫效果影响；实施例7 10 中以猪蓝耳病经典毒株CH-1R、R98株为例说明猪瘟、蓝耳病全病毒抗原配比关系对免疫效果影响。下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照本领域技术人员熟知的实验方法进行。
实施例1猪瘟病毒抗原液的制备
1.将长成良好单层的对猪瘟病毒(猪瘟兔化弱毒株由中国兽医药品监察所保藏， 保藏号AV1412)高敏感的ST细胞(购自ATCC)用含O. 125%胰酶和O. 03% EDTA的消化液， 进行消化分散，细胞计数后以合适的密度接种细胞培养瓶，加入1. 5-5% FBS的MEM细胞培养液，同时按照M. O.1. = O. 01-0. 6接毒剂量加入种毒，进一步优选接毒剂量为M. O.1.= O. 1-0. 6，进一步优选接毒剂量为M. O.1. = O. 2-0. 4，置于34_37°C温箱中进行培养，进一步优选培养温度为34-35 °C。
2.培养三天后进行第一次收毒，收毒后补加1. 5-3% FBS的细胞维持液，以后每隔 2天收毒一次，可连续收毒5次。收毒后将抗原混合置于-20°C储藏。
3.将5次收获的病毒液混合取样后进行TCID5tl和RID测定，抗原液病毒含量 106_ 5TCID5ciAil (免疫荧光法)，兔体感染剂量应不低于500，000RID/ml (兔体反应热法)，同时按照中国兽药典2010年版“猪瘟活疫苗”检验标准进行检测，符合规定。
实施例2猪蓝耳病高致病性变异株抗原的制备方法
1.制苗用细胞的传代与培养将Marc 145或MA104细胞系经EDTA-胰酶消化液分散传代，以细胞生长液继续培养，形成致密单层时，备用，用于继续传代或接种病毒。
2.细胞毒种的繁殖将蓝耳病HUN4-F112毒株(市售)病毒液，按M.O.1.= O. 001-0. 01的剂量接入已经生长成良好细胞单层的细胞瓶，进一步优选接毒剂量为 M. O.1. = O. 005-0. 01，吸附I小时后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当70-80% 细胞出现病变后收获，收获的毒液冻融1-2次后置-20°C以下保存，取少量做半成品检验， 抗原液病毒含量106_ 5TCID5cZml，按照国家标准检验均符合规定。
将蓝耳病JXAl-R毒株(市售)病毒液，按M. O.1. = O. 001-0. 01的剂量接入已经生长成良好细胞单层的细胞瓶，进一步优选接毒剂量为M. O.1. = O. 005-0. 01，吸附I小时后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当70-80%细胞出现病变后收获，收获的毒液冻融1-2次后置_20°C以下保存，取少量做半成品检验，抗原液病毒含量107_°TCID5(l/ml，按照国家标准检验均符合规定。
将蓝耳病TJM-F92毒株(市售)病毒液，按M. O.1. = O. 001-0. 01的剂量接入已经生长成良好细胞单层的细胞瓶，进一步优选接毒剂量为M. O.1. = O. 005-0. 01，吸附I小时后，加入细胞维持液于细胞系单层，继续培养，当70-80%细胞出现病变后收获，收获的毒液冻融1-2次后置_20°C以下保存，取少量做半成品检验，抗原液病毒含量106_5TCID5cZml， 按照国家标准检验均符合规定。
实施例3猪瘟、猪高致病性蓝耳病(HuM-Fl 12、JXA1-R、TJM-F92)抗原与猪瘟病毒抗原不同配比后制备成二联疫苗组合物
将实施列I制 备好的猪瘟病毒抗原(病毒含量106_5TCID5(l/ml)，实施例2制备好的三种猪蓝耳病病毒抗原分别按照表I的抗原含量进行配比，然后与等量的冻干保护剂混合，制成猪蓝耳病、猪瘟二联活疫苗疫苗组合物，具体情况见表I。
表I猪蓝耳病抗原、猪瘟抗原的不同配比及分组
权利要求
1.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括猪瘟病毒抗原和猪蓝耳病抗原，其中，所述猪瘟病毒为猪瘟兔弱毒化株，所述猪蓝耳病抗原为高致病性猪蓝耳病病毒，所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例为100 1—100 10。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例为 100 3—100 10。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪蓝耳病抗原包括HUN4-F112株、NVDC-JXA1-R 株、TJM-F92 株活的病毒。
4.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括猪瘟病毒抗原和猪蓝耳病抗原，其中，所述猪瘟病毒为猪瘟兔弱毒化株，所述猪蓝耳病抗原为经典猪蓝耳病病毒，所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例为100 1-1000 I。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例为 100 1-300 I。
6.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述猪蓝耳病抗原包括ATCCVR-2332株、CH-1R株、R98株活的病毒。
7.一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括 培养增殖猪瘟病毒，制备所述猪瘟病毒抗原； 培养增殖猪蓝耳病病毒，制备所述猪蓝耳病病毒抗原； 按照所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例100 1--100 10进行配比，制备所述疫苗组合物。
8.一种制备权利要求4所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括 培养增殖猪瘟病毒，制备所述猪瘟病毒抗原； 培养增殖猪蓝耳病病毒，制备所述猪蓝耳病病毒抗原； 按照所述猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例100 1-1000 I进行配比，制备所述疫苗组合物。
9.根据权利要求1 3所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪瘟和猪蓝耳病药物的应用。
10.根据权利要求4 6所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪瘟和猪蓝耳病药物的应用。
全文摘要
本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括猪瘟病毒抗原和猪蓝耳病抗原，其中，该猪瘟病毒为猪瘟兔弱毒化株，该猪蓝耳病抗原为高致病性猪蓝耳病病毒，该猪蓝耳病抗原与猪瘟病毒抗原含量比例为100∶1—100∶10，该疫苗组合物可以消除两种抗原之间的干扰作用，达到一针预防两种传染病的目的，大大减少了免疫次数及动物应激反应。
文档编号A61P31/14GK103041384SQ20121059033
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月29日 优先权日2012年12月29日
发明者张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司