专利名称：一种含金属硫蛋白的细胞保护剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含金属硫蛋白的细胞保护剂，属于生物制药领域。具体地说涉及金属硫蛋白的新用途，即一种以金属硫蛋白为主要成份的试剂，用于血液灌流治疗时对人体血液细胞的保护，以及由细胞严重损伤或减少引起疾病的细胞疗法中对相应所培养、扩增细胞，或于相应组织、器官所移植、增生细胞的保护。这些由细胞严重损伤或减少引起的疾病包括但不限于帕金森病、急性脊髓损伤、多发性硬化症、老年痴呆症、关节炎、骨质疏松、心衰竭、突发性血小板减少症、心脏术后急性肾损伤、化疗药物引起的血细胞减少症、肺纤维化、糖尿病、肝硬化、卵巢早衰、白血病、股骨坏死症、肝炎、再生障碍性贫血、骨折、瘫 痪、大脑损伤修复、急性心肌梗塞、软骨损伤等。
背景技术：
细胞的损伤或减少是多种疾病尤其是神经退行性疾病的关键致病机理。如神经细胞信号传导介导的细胞毒性物质6-羟基多巴胺(6-0HDA)引起神经细胞对该毒物的氧化应激反应，导致位于中脑部位"黑质"中的多巴细胞发生病理性改变，结果引起相应多巴细胞损伤、死亡以及数量减少，多巴胺的合成量降低、对乙酰胆碱的抑制功能降低、乙酰胆碱的兴奋作用相对增强，从而发生帕金森病症状；又如抗肿瘤药物顺钼等在杀死肿瘤细胞的同时，对正常细胞特别是骨髓造血细胞也有杀伤作用，造成血细胞减少症白细胞减少会使机体抵御外来感染能力降低，红细胞减少会造成贫血，血小板减少则可导致机体了出血等。长期以来，西方医学倡导“对抗疗法”治疗疾病细菌感染消灭细菌，病毒感染消灭病毒，血管堵塞消除堵塞，器官损坏切除器官等。其实很多疾病的康复高度依据人自身的免疫系统和再生机制。人体自身具有一定的自我修复功能。如感冒后吃感冒药物仅仅消除了头晕、发热、咳嗽等症状，主要还是靠人体内免疫细胞去消灭感冒病毒。创伤后伤口经过抗菌、消炎等处理不再感染，可是以后的伤口愈合，则需要人体自身干细胞迁移到此处，通过自身再生细胞修复受伤组织。人体内这两种非常重要的细胞一免疫细胞和干细胞在疾病治疗中发挥了关键性作用免疫细胞像是抵御身体内外致病原的侵袭，干细胞则起到对病灶的紧急救援与损伤修复。许多药物治疗主要是借助对人体自身免疫细胞和干细胞这两大细胞体系的调动。但是，在同样多的情况下，不管是否使用外界药物，人体自身干细胞或免疫细胞的数量、质量、功能是有限的；或者说其数量、质量、功能不足以治疗很多组织、器官损伤疾病。这就需要利用细胞体外培养、扩增等专门的技术处理甚至基因修饰，以得到足够数量、质量、功能的免疫细胞，以及分化或未分化的干细胞。医生可以用培养好的结构与功能正常的免疫细胞、未分化干细胞、或已衍生分化干细胞当作“药物”输送给患者，以修复细胞受损或减少的组织与器官；经过专门处理的以上细胞到达受损组织脏器的一种途径是通过人体静脉注射、血液循环，以治疗神经退行性疾病、心脑血管疾病、肺纤维化、肝硬化、糖尿病等细胞严重受损或减少的疾病。细胞疗法方兴未艾。例如，人们新近开发的生物免疫细胞疗法，主要根据细胞与分子免疫学原理，通过细胞因子，诱发人体自身树突状抗原提呈细胞(DC)产生杀伤细胞(CIK)，杀灭乙肝病毒，阻止肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌进程。目前的抗病毒药物治疗，其作用是抑制病毒复制，消除或减轻肝脏的炎症、坏死来阻延疾病的进展，但对于有些患者而言，单纯采用药物并没有阻止其病情的发展，问题主要出在自身的免疫系统，也就是自身免疫细胞不清除病毒，医学上称为“免疫耐受”，导致乙肝的久治不愈。只有打破免疫耐受，恢复人体免疫细胞的功能，激活和不断增强自身免疫功能杀伤病毒的能力，才能从根源上得到有效治疗。而具有免疫杀伤作用的特异性细胞T淋巴细胞(CTL)，可对HBV进行精确性、特异性、靶向性、主动性攻击，杀灭体内HBV病毒。细胞因子诱导的树突状抗原提呈细胞-杀伤细胞技术可望将患者自身血液中的单个核细胞通过专门的细胞采集设备提取出来，在体外经过培养，使其增殖、分化成具有特异性杀伤活性的细胞，恢复其对乙肝病毒的杀伤功能，再回输到患者自身体内，可以起到免疫重建、增强自体免疫功能的作用。另一项成功的细胞疗法已经被美国FDA批准用于临床治疗人们用一种细胞治疗修复损伤的膝关节，其技术是取自体受累关节的正常软骨细胞，在实验室扩增培养3-4周，再植入损伤膝关节。
可是，细胞疗法仍存在很多技术难题需要攻克，主要是衍生分化或未分化干细胞、免疫细胞等体外扩增效率低。例如，诱导性多能干细胞(iPS)的成功率低至万分之一，十万个细胞中成功4-5个，且耗时很长。有关研究人员使用转录因子将iPS的诱导效率提高很多，但所用的转录因子含致癌基因，用于治疗将存在极大的安全隐患。移去该致癌基因转录因子后，效率又回到原来的万分之一水平。骨髓源性神经干细胞(bone marrow stromalcells-derived neural stem cells,BMSCs-d-NSCs)因其取材相对容易、致瘤风险低、避免伦理争议、可自体移植，更贴近未来临床应用。但因其为非神经组织来源，须经体外诱导、分化及调控阶段，复杂的体外条件下细胞容易发生细胞损伤导致衰退和死亡，导致细胞存活率很低。很显然，开发一种普遍有效的防止不同培养阶段细胞衰退、损伤、死亡的方法，是细胞疗法成败的关键。另一种需要细胞保护的普遍情形出现在近年来逐渐得到应用的血液灌流疗法上。针对尿毒症、危重症、中毒、系统性红斑狼疮(SLE)、重型肝炎等众多疾病进行血液灌流治疗时，为防止微细吸附剂进入末梢血液毛细管，需将血液灌流器中的吸附剂压得很实，这样，在将肌酐、有机酚类、胍类、巴比妥类药物等有毒药物、农药、胆红素、吗啡、内毒素、血脂、DNA等毒物从血液中除去时，会发生血流通过吸附剂床层时经受高剪切压力、原来附着在细胞表面的内在保护剂脱落等情况，引起细胞氧化损伤。血液灌流疗法的一项重要技术指标是血液细胞如红细胞、白细胞、血小板的存活率。为提高血液灌流疗法的效率，需要细胞保护剂来保护，以防止血液细胞，尤其是血红细胞的损伤与死亡。金属硫蛋白是符合以上两大类应用条件的广谱保护剂。金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸基团，对多种重金属有高度亲和性，在一定的酸碱度(pH值)及细胞氧化-还原电位环境(可藉细胞器某处谷胱甘肽有还原型和氧化型比例，GSH/GSSG比例显示)条件下易与多个镉、锌等金属离子结合的多肽蛋白质。哺乳动物的金属硫蛋白由约61个氨基酸组成，含有20个半胱氨酸和7个金属离子。金属硫蛋白作为一种应激蛋白、抗自由基氧化剂、细胞锌离子介导剂等，具有提高人体免疫力、抵抗重金属中毒、参与微量元素的贮存、运输和代谢、排铅补锌、抗辐射、延缓衰老、保护人体心肺各器官等多种独特有效的生物学功能。

发明内容
本发明的目的是，针对血液灌流时血液细胞受损伤，以及细胞体外培养、扩增及细胞移植后于相应组织、器官生长过程中受到的损伤、成活率低等问题，提出一种细胞保护剂以及使用该保护剂用于血液灌流疗法，以及治疗与严重细胞损伤或减少的疾病的细胞移植疗法或称细胞疗法，包括这些细胞的体外培养、扩增及细胞移植后于相应组织、器官前后保护的方法。这一方法具有如下一种或一种以下具体特征I.本发明所述的细胞保护剂是以金属硫蛋白为主要有效成份，金属硫蛋白的浓度为 O. 001 μ M-IOOmM,优选浓度为 I μ M-IO μ Μ。2.本发明所述的金属硫蛋白可以是天然的、基因重组表达的、或它们的组合物。3.本发明所述的金属硫蛋白包括动物、植物等各种来源的金属硫蛋白提取物、半 成品、各种百分含量比例的粗品、各种纯度的纯品、各种纯度的精品等。4.本发明所述的金属硫蛋白尤其包括人源化金属硫蛋白，即人源化金属硫蛋白-I (hMT-Ι)、人源化金属硫蛋白_2 (hMT-2)、人源化金属硫蛋白_3 (hMT-3)、人源化金属硫蛋白-4(hMT-4)的一种或两种以上组合物。5.本发明所述的金属硫蛋白包括存在于一切药物载体上的金属硫蛋白；这些载体包括脂质体、纳米脂质体、柔性纳米脂质体、聚乙二醇等。6.本发明所述的基因重组表达包括但不限于经过基因突变、蛋白质修饰(如硒取代硫元素的半胱氨酸、蛋氨酸后的所谓硒金属硫蛋白)、蛋白质融合，以及各种为数众多的细胞工程表达产物。7.本发明所述的基因重组表达金属硫蛋白主要包括人源化金属硫蛋白，也就是说所表达的基因为人金属硫蛋白基因。8.本发明所述的基因重组表达包括由一定的商业或非商业化基因重组表达载体于细菌、酵母、藻类、昆虫、病毒、植物、动物细胞中的基因表达。9.本发明所述的商业或非商业化基因重组表达载体包括存在于一定基因表达载体的可表达金属硫蛋白的基因克隆。10.本发明所述的动物包括人以及兔、猪、羊、牛、鱼、虾等可食用动物。11.本发明所述的细胞包括但不限于来源于骨髓、脊髓、脐带血、胚胎肝脏、神经系统、淋巴系统的细胞，以及干细胞及干细胞衍生分化细胞。12.本发明所述的干细胞包括但不限于骨髓间质干细胞、骨髓源神经干细胞、造血干细胞、造血多能干细胞、造血祖细胞、诱导性多能干细胞(iPS)等。13.本发明所述的干细胞衍生分化细胞，其特征在于，所述的干细胞衍生分化细胞包括但不限于血红细胞、白细胞、血小板、神经细胞、心肌细胞、粒单细胞、巨核细胞、肝细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、肾细胞、内皮细胞。14.本发明所述的细胞疗法包括但不限于干细胞疗法、免疫细胞疗法、细胞介导的基因疗法、基因工程靶向细胞疗法等。15.本发明所述的血液灌流器吸附剂包括但不限于各种改性或非改性活性炭、各种改性或非改性高分子树脂、聚苯乙烯树脂、改性聚苯乙烯树脂、阳离子树脂、纤维素树脂、大孔吸附树脂、免疫吸附柱、亲和吸附柱、琼脂糖凝胶，葡聚糖凝胶等。
16.本发明所述的血液灌流疗法包括但不限于对尿毒症、危重症、中毒、系统性红斑狼疮(SLE)、重型肝炎等疾病的治疗，即是通过血液灌流器于体外将这些病人血液中的有毒分子如肌酐、有机酚类、胍类、巴比妥类药物等有毒药物、农药、胆红素、吗啡、内毒素、血脂、DNA等毒物除去的过程。本发明的理论依据是细胞损伤、凋亡、坏死的主要机制是氧化应激反应。金属硫蛋白作为一种应激蛋白、抗自由基氧化剂、细胞锌离子介导剂等，可高效对抗、淬灭细胞氧化应激反应，具有提高人体免疫力、抵抗重金属中毒、参与微量元素的贮存、运输和代谢、排铅补锌、抗辐射、延缓衰老、保护人体心肺各器官等多种独特有效的生物学功能。本发明依据的是金属硫蛋白突出的对抗细胞氧化应激反应的能力，其抗氧化能力是SOD的近5000倍、谷胱甘肽的近10000倍。
本发明的效果作用是血液细胞在体外血液灌流疗法，或其它细胞培养不同阶段的细胞死亡事件中，均有凋亡、坏死两种机制的共同参与，并多以凋亡为主。随时间延长细胞凋亡和坏死情况均逐渐增多金属硫蛋白可以明显减少体外培养细胞的损伤、凋亡和坏死。特别是以浓度为I. O μ M、2. O μ M的金属硫蛋白培养细胞，更具明显的抗氧化作用，能够减少细胞氧化应激损伤，增强细胞活力，减少细胞损伤、凋亡和坏死事件的发生，更好地改善其存活。含金属硫蛋白的细胞保护剂在血液灌流疗法以及神经干细胞等众多细胞的体外培养和移植后细胞保护研究与治疗中具有广阔应用前景。使用人源化金属硫蛋白的明显好处是避免免疫原性，因为人体细胞本身就含有该金属硫蛋白。
具体实施例方式实施例一以密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间质干细胞(BMSCs)，以神经干细胞专用培养基促其向神经干细胞(NSCs)的分化，以O. 5 μ Μ、1 μ Μ、5 μ M三种浓度金属硫蛋白添加培养基培养所得的骨髓源神经干细胞(BMSCs-d-NSCs)，于37°C的C02孵化箱中培养，分别在1、2、3、4周时以Annexin V-EGFP/PI双染流式细胞仪检测，以同一取材的未添加金属硫蛋白常规培养的同期细胞为对照，比较各组细胞凋亡和坏死情况。结果发现各组细胞传代培养后，各金属硫蛋白处理组较对照组活力更为旺盛，增殖速度快，细胞凋亡和坏死情况减少。培养2周时各组间凋亡细胞和坏死细胞比例均有明显差异；1μΜ、2μΜ金属硫蛋白处理组细胞凋亡和坏死比例均明显少于对照组。培养3周时各组凋亡细胞和坏死细胞比例差异更显著；各金属硫蛋白处理组细胞凋亡和坏死比例均明显少于对照组，且I μ Μ、5μ M处理组细胞凋亡和坏死比例也少于O. 5 μ M处理组。这些结果表明金属硫蛋白可以减少体外培养BMSCs-d-NSCs的凋亡和坏死，特别是以I. O μ Μ_5. O μ M金属硫蛋白培养细胞，更具明显的抗氧化损伤作用，能够增强细胞活力，减少细胞的凋亡和坏死事件的发生。实施例二 取Balb/c小鼠骨髓单个核细胞，用血浆凝块法，将细胞(2xl05/培养皿)加入含10% 2-巯基乙醇，10%氯化钙，10%牛血清白蛋白，5%猪血清，10%牛血浆的培养液中，并以O. 5 μ Μ、I μ Μ、5 μ M三种浓度金属硫蛋白添加培养液于37°C的C02孵化箱中培养，分别在1、2、3、4周时以Annexin V-EGFP/PI双染流式细胞仪检测，以同一取材的未添加金属硫蛋白常规培养的同期细胞为对照，比较各组细胞凋亡和坏死情况。结果发现各组细胞传代培养后，各金属硫蛋白处理组较对照组活力更为旺盛，增殖速度快，细胞凋亡和坏死情况减少。经流式细胞仪检测可见，从I周培养开始各组间凋亡细胞和坏死细胞比例均有明显差异；I μ Μ、5 μ M金属硫蛋白处理组细胞凋亡和坏死比例均明显少于对照组。培养4周时各组凋亡细胞和坏死细胞比例也均有明显差异；各金属硫蛋白处理组细胞凋亡和坏死比例均明显少于对照组，且I μ Μ、5 μ M处理组细胞凋亡和坏死比例也少于O. 5 μ M处理组。这些结果表明金属硫蛋白可以减少体外培养造血干细胞的凋亡和坏死，特别是含I. O μ Μ-5. O μ M金属硫蛋白的培养液，更具明显的抗氧化损伤作用，能够增强细胞活力，减少细胞的凋亡和坏死事件的发生。实施例三取经IV型胶原酶消化法传代的稳定人iPS细胞，用RT-PCR法检测鉴定人iPS多能性基因 0CT4(上游引物 CGAAGAGAAAGCGAACCAGTATC，下游引物 AGAACCACACTCGGACCACATC)、 Sox2 (上游引物 CCCCCGGCGGCAAATGCA，下游引物 TCGGCGCCGGGGAGATACAT)、Nanog (上游引物GCAAAAAAGGAAGACAAGGTCC,下游引物 CCTTCTGCGTCACACCATTG)，并检验其干细胞特征。以添加O. 5 μ Μ、1 μ Μ、5 μ M金属硫蛋白细胞保护剂的iPS干细胞培养基培养于37°C的C02孵化箱中培养。同以上实施例用流式细胞仪检测各组细胞凋亡和坏死情况。培养2周时各组间凋亡细胞和坏死细胞比例均有明显差异；1 μ Μ、5 μ M金属硫蛋白处理组细胞凋亡和坏死比例均明显少于对照组。培养3周时各组凋亡细胞和坏死细胞比例差异更明显。这些结果表明含金属硫蛋白的细胞保护剂，特别是I. O μ Μ-5. O μ M金属硫蛋白的培养液，对iPS细胞损伤的保护作用。
权利要求
1.一种含金属硫蛋白的细胞保护剂，其特征在于，以金属硫蛋白为主要有效成份的试剂及其应用。
2.如权利要求I所述的细胞保护剂，其特征在于，所述主要有效成分金属硫蛋白的浓度为O. OOl μ M-IOOmM,优选浓度为I μ M-IO μ M ;所述金属硫蛋白可以是天然的、基因工程表达的、或它们的组合物。
3.如权利要求2所述的金属硫蛋白，其特征在于，所述金属硫蛋白包括植物动物(人以及兔、猪、羊、牛、鱼、虾等一切可食用动物)、等各种来源的金属硫蛋白提取物、半成品、各种百分含量比例的粗品、各种纯度的纯品、各种纯度的精品等。
4.如权利要求2所述的金属硫蛋白，其特征在于，所述的金属硫蛋白尤其包括人源化金属硫蛋白，即人源化金属硫蛋白-I (hMT-1)、人源化金属硫蛋白-2 (hMT-2)、人源化金属硫蛋白-3 (hMT-3)、人源化金属硫蛋白-4(hMT-4)的一种或两种以上组合物。
5.如权利要求2所述的金属硫蛋白，其特征在于，所述金属硫蛋白包括在细菌、酵母、植物、哺乳动物细胞中的基因工程表达产物，包括但不限于经过基因突变、蛋白质修饰(如硒取代硫元素的半胱氨酸、蛋氨酸后的所谓硒金属硫蛋白)、蛋白质融合，以及各种为数众多的细胞工程表达产物。
6.如权利要求2所述的金属硫蛋白，其特征在于，所述的金属硫蛋白包括存在于一切药物载体上的金属硫蛋白；这些载体包括脂质体、纳米脂质体、柔性纳米脂质体、聚乙二醇坐寸ο
7.如权利要求2所述的基因工程表达，其特征在于，所述基因工程表达产物包括存在于一定基因表达载体的可表达的基因克隆，包括由一定的商业或非商业化基因重组表达载体于细菌、酵母、藻类、昆虫、病毒、植物、动物细胞中的基因表达。
8.如权利要求2所述的基因工程表达，其特征在于，所述基因重组表达如权利要求I所述的细胞，其特征在于，所述的包括但不限于来源于骨髓、脊髓、脐带血、胚胎肝脏、神经系统、淋巴系统的细胞，以及干细胞及干细胞衍生分化细胞；包括但不限于体外培养细胞、移植到组织后的细胞、体外灌流血细胞等。
9.如权利要求8所述的干细胞，其特征在于，所述的所述的干细胞包括但不限于骨髓间质干细胞、骨髓源神经干细胞、造血干细胞、造血多能干细胞、造血祖细胞、诱导性多能干细胞(iPS)等；所述的干细胞衍生分化细胞，其特征在于，所述的干细胞衍生分化细胞包括血红细胞、白细胞、血小板、神经细胞、心肌细胞、粒单细胞、巨核细胞、肝细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、肾细胞、内皮细胞。
10.如权利要求I所述的细胞保护剂的应用，其特征在于，应用领域包括但不限于血液灌流治疗尿毒症、危重症、中毒、系统性红斑狼疮(SLE)、重型肝炎时对人体血液细胞的保护，以及由细胞严重损伤或减少引起疾病的细胞疗法中对相应所培养、扩增细胞，或于相应组织、器官所移植、增生细胞的保护。这些由细胞严重损伤或减少引起的疾病包括但不限于帕金森病、急性脊髓损伤、多发性硬化症、老年痴呆症、关节炎、骨质疏松、心衰竭、突发性血小板减少症、心脏术后急性肾损伤、化疗药物引起的血细胞减少症、肺纤维化、糖尿病、肝硬化、卵巢早衰、白血病、股骨坏死症、肝炎、再生障碍性贫血、骨折、瘫痪、大脑损伤修复、急性心肌梗塞、软骨损伤等。
全文摘要
本发明针对血液灌流时血液细胞受损伤，以及细胞体外培养、扩增及细胞移植后于相应组织、器官生长过程中受到的损伤、成活率低等问题，向人们公开了一种含金属硫蛋白的细胞保护剂，以及使用该保护剂用于血液灌流疗法、细胞疗法，包括这些细胞的体外培养、扩增及细胞移植后于相应组织、器官前后保护的方法。这一含金属硫蛋白的细胞保护剂可广泛用于血液灌流治疗尿毒症、危重症、中毒、系统性红斑狼疮(SLE)、重型肝炎等疾病时对人体血液细胞的保护，以及由细胞严重损伤或减少引起疾病的细胞疗法中对相应所培养、扩增细胞，或于相应组织、器官所移植、增生细胞的保护。
文档编号A61K38/16GK102634479SQ20121002516
公开日2012年8月15日 申请日期2012年2月6日 优先权日2012年2月6日
发明者汪志友 申请人:汪志友