专利名称：编码g蛋白偶联受体的基因及其使用方法
技术领域：
本发明总的来讲涉及神经科学、生物信息学和分子生物学领域。更具体地讲，本发明涉及新鉴定的编码G蛋白偶联受体(GPCR)的多核苷酸、所述多核苷酸和多肽的应用、以及所述多核苷酸和多肽的生产。本发明还涉及鉴定可以作为GPCR的激动剂、拮抗剂和/或抑制剂、并因此可能用于治疗的化合物。
背景技术：
已经确定，许多在医学上重要的生物过程由参与细胞信号转导途径的多肽介导，所述细胞信号转导途径涉及G蛋白和第二信使，所述第二信使如cAMP、IP3和二酰甘油(Lefkowitz，1991)。这些多肽的某些实例包括G蛋白本身(例如G蛋白家族I、II和III)；G蛋白偶联受体(GPCR)，例如生物胺递质(例如肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺)的受体(Kobilka等，1987(a)；Kobilka等，1987(b)；Bunzow等，1988)、效应物多肽(例如磷脂酶C、腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶)的受体以及actuator多肽(例如多肽激酶A和多肽激酶C)的受体(Simon等，1991)。
细胞信号转导的一种特定途径是肌醇磷脂途径。在该途径中，细胞外信号分子(例如肾上腺素)结合G蛋白偶联受体(GPCR)，该过程激活GPCR。GPCR随后结合由α、β和γ多肽亚基组成的特异性三聚体G蛋白。在GPCR/G蛋白结合状态下，G蛋白α亚基上的GDP被GTP交换，导致α亚基与β/γ亚基解离。结合GTP的α亚基是所述多肽的活性状态。所述有活性的α亚基进一步激活磷脂酶C，磷脂酶C催化切割PIP2成为IP3和二酰甘油(DAG)。所述IP3和DAG作为进一步信号扩增(例如释放Ca2+和磷酸化)的第二信使。G蛋白本身催化GTP水解成GDP，使G蛋白回复其基本的无活性形式。由此，GPCR结合信号分子后，激活G蛋白。所述G蛋白有双重作用，一是作为从受体传递信号到效应物的中间体，二是作为控制所述信号持续时间的时钟。
GPCR是膜结合蛋白，包括特征在于具有七个推定的跨膜结构域的基因超家族。在细胞内，GPCR可以通过异三聚体G蛋白与各种胞内酶、离子通道和转运蛋白偶联(参见Johnson等，1989)。不同G蛋白α亚基优先刺激特定效应物，调节细胞内各种生物学功能。
偶联受体的G蛋白家族包括各种各样的生物活性受体，例如激素受体、病毒受体、生长因子受体和神经受体。该家族成员的实例包括但不限于多巴胺、降钙素、肾上腺素能药物、内皮缩血管肽、cAMP、腺苷、毒蝇碱性乙酰胆碱、5-羟色胺、组胺、凝血酶、激肽、促卵泡激素、视蛋白、内皮分化基因-1、视紫红质、添味剂(odorant)和巨细胞病毒受体。
人们认为，所述七次跨膜GPCR结构域代表通过胞外环或胞质环连接的跨膜α螺旋。已经鉴定GPCR的特征是包括这些七个保守的长约20-30个氨基酸的疏水性序列段，连接至少八个趋异的亲水性环。大多数GPCR(也称为7TM受体)在前两个胞外环的每个环上都具有一个保守的半胱氨酸残基，这两个半胱氨酸残基形成二硫键，相信其作用是稳定功能性多肽结构。所述7个跨膜区命名为TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6和TM7。由于TM3具有配体结合位点例如TM3天冬氨酸残基，因此怀疑其涉及几种GPCR。TM5丝氨酸、TM6天冬酰胺和TM6或TM7苯丙氨酸或酪氨酸也怀疑涉及某些受体家族的配体结合。
半胱氨酸残基的磷酸化和脂质化(棕榈基化或法尼基化)可能影响一些GPCR的信号转导。大多数GPCR在第三个胞质环和/或羧基末端内含有可能的磷酸化位点。对于几种GPCR如β-肾上腺素受体，多肽激酶A和/或特异性受体激酶引起的磷酸化介导受体脱敏。
目前，已经克隆来自各种真核物种的超过800种GPCR，其中140种是已知其内源受体的人GPCR(Stadel等，1997)。此外，几百种靶向GPCR的治疗剂已经成功投放市场，治疗各种适应征，所述GPCR如血管紧张肽受体、降钙素受体、肾上腺素受体受体、5-羟色胺受体、白三烯受体、催产素受体、前列腺素受体、多巴胺受体、组胺受体、毒蝇碱性乙酰胆碱受体、阿片样物质受体、促生长素抑制素受体和血管升压素受体(参见Stadel等，1997)。这表明这些受体有作为治疗靶的确定并且被证实的历史记录。对GPCR基因的搜索也鉴定出许多这样的基因所述基因的基因产物是GPCR家族成员，但未知它们的天然配体，这些GPCR家族成员一般被称为孤独受体。事实上，在已经鉴定的240种人类GPCR中，超过100种(即约45％)是孤独受体，估计至少还有超过400-1000种尚未鉴定的GPCR基因(Stadel等，1997)。
因此，明显需要鉴定和表征能够预防、缓解或矫正功能障碍或疾病的其它孤独GPCR、它们的基因和它们的配体，所述功能障碍或疾病包括但不限于感染如细菌感染、真菌感染、原生动物感染和病毒感染，尤其是HIV-1或HIV-2引起的感染；疼痛；癌症；厌食症；贪食症；哮喘；帕金森病；急性心力衰竭；低血压；高血压；尿潴留；骨质疏松症；心绞痛；心肌梗塞；溃疡；哮喘；变态反应；良性前列腺增生；以及精神神经疾病，包括焦虑、神经分裂症、躁郁症、谵妄、痴呆、严重智力迟钝和运动障碍，例如亨庭顿病或图雷特综合征。
发明概述本发明涉及新鉴定的编码G蛋白偶联受体(本文称为GPCR)的多核苷酸、所述多核苷酸和多肽的应用、以及所述多核苷酸和多肽的生产。本发明还涉及鉴定可以作为GPCR的激动剂、拮抗剂和/或抑制剂、并因此可能用于治疗的化合物。
在具体实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码以下多肽的核酸序列所述多肽包含SEQ ID NO4的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多核苷酸还包含编码异源蛋白的核酸序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列编码包含SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核酸序列。在某些其它实施方案中，所述多核苷酸选自DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、pre-mRNA和反义RNA。在其它实施方案中，所述载体DNA选自质粒、附加型载体、YAC和病毒载体。在又一个实施方案中，所述多核苷酸有效连接一种或多种选自以下的调节元件启动子、增强子、剪接信号、终止信号、核糖体结合信号和聚腺苷酸化信号。
在一个实施方案中，本发明涉及用重组表达载体转染、转化或感染的基因工程宿主细胞，所述重组表达载体包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列编码包含SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含以下核酸序列的分离的多核苷酸所述核酸序列编码包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的多肽。在一个具体实施方案中，所述多核苷酸还包含编码异源蛋白的核酸序列。
在其它实施方案中，本发明涉及包含以下核酸序列的重组表达载体所述核酸序列编码包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的多肽。在具体实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的核酸序列。在另一个实施方案中，所述多核苷酸选自DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、pre-mRNA和反义RNA。在又一个实施方案中，所述多核苷酸有效连接一种或多种选自以下的调节元件启动子、增强子、剪接信号、终止信号、核糖体结合信号和聚腺苷酸化信号。在其它实施方案中，所述载体DNA选自质粒、附加型载体、YAC和病毒载体。
在某些实施方案中，本发明涉及用重组表达载体转染、转化或感染的基因工程宿主细胞，所述重组表达载体包含以下核酸序列所述核酸序列编码包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的多肽。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
在某些其它实施方案中，本发明涉及包含以下核酸序列的分离的多核苷酸所述核酸序列编码包含SEQ ID NO9的氨基酸序列的多肽。在具体实施方案中，所述多核苷酸还包含编码异源蛋白的核酸序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列编码具有SEQ ID NO9的氨基酸序列的多肽。在具体实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO8的核酸序列。在其它实施方案中，所述多核苷酸选自DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、pre-mRNA和反义RNA。在其它实施方案中，所述多核苷酸有效连接一种或多种选自以下的调节元件启动子、增强子、剪接信号、终止信号、核糖体结合信号和聚腺苷酸化信号。在再一个实施方案中，所述载体DNA选自质粒、附加型载体、YAC和病毒载体。
在一个具体实施方案中，本发明涉及用重组表达载体转染、转化或感染的基因工程宿主细胞，所述重组表达载体包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列编码包含SEQ ID NO9的氨基酸序列的多肽。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
在又一个实施方案中，本发明涉及包含以下核酸序列的分离的多核苷酸所述核酸序列编码包含SEQ ID NO11的氨基酸序列的多肽。在具体实施方案中，所述多核苷酸还包含编码异源蛋白的核酸序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列编码具有SEQ ID NO11的氨基酸序列的多肽。在具体实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO10的核酸序列。在再一个实施方案中，所述多核苷酸选自DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、pre-mRNA和反义RNA。在又一个实施方案中，所述多核苷酸有效连接一种或多种选自以下的调节元件启动子、增强子、剪接信号、终止信号、核糖体结合信号和聚腺苷酸化信号。在另一个实施方案中，所述载体DNA选自质粒、附加型载体、YAC和病毒载体。
在另一个实施方案中，本发明涉及用重组表达载体转染、转化或感染的基因工程宿主细胞，所述重组表达载体包含具有以下核酸序列的多核苷酸所述核酸序列编码包含SEQ ID NO11的氨基酸序列的多肽。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
在某些实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO4的氨基酸序列的分离多肽、包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的分离多肽、包含SEQ ID NO9的氨基酸序列的分离多肽以及包含SEQ ID NO11的氨基酸序列的分离多肽。
在某些其它实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO1的核酸序列的分离的多核苷酸或其简并变异体。在具体实施方案中，SEQ IDNO1的多核苷酸编码区包含核苷酸298到1,653。
在一个优选实施方案中，本发明涉及反义RNA分子，所述反义RNA分子与包含SEQ ID NO1的核酸序列的多核苷酸或其简并变异体反义。在一个具体实施方案中，所述RNA与以下多核苷酸反义SEQ ID NO1的多核苷酸从约核苷酸1到约核苷酸297，或者SEQ IDNO1的多核苷酸从约核苷酸1,654到约核苷酸3,824。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO2的核酸序列的分离的多核苷酸或其简并变异体。在一个具体实施方案中，SEQ ID NO2的多核苷酸编码区包含核苷酸1到1,313。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及反义RNA分子，所述反义RNA分子与包含SEQ ID NO2的核酸序列的多核苷酸或其简并变异体反义。在一个具体实施方案中，所述RNA与以下多核苷酸反义SEQ ID NO2的多核苷酸从约核苷酸1,314到约核苷酸3,405。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO3的核酸序列的分离的多核苷酸或其简并变异体。在一个具体实施方案中，SEQ ID NO3的多核苷酸编码区包含核苷酸671到2,026。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及反义RNA分子，所述反义RNA分子与包含SEQ ID NO3的核酸序列的多核苷酸或其简并变异体反义。在一个具体实施方案中，所述RNA与以下多核苷酸反义SEQ ID NO3的多核苷酸从约核苷酸1到约核苷酸670，或者SEQ IDNO3的多核苷酸从约核苷酸2,027到约核苷酸3,779。
在再一个优选实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO5的核酸序列的分离的多核苷酸或其简并变异体。在一个具体实施方案中，SEQ ID NO5的多核苷酸编码区包含核苷酸684到2,033。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及反义RNA分子，所述反义RNA分子与包含SEQ ID NO5的核酸序列的多核苷酸或其简并变异体反义。在一个具体实施方案中，所述RNA与以下多核苷酸反义SEQ ID NO5的多核苷酸从约核苷酸1到约核苷酸683，或者SEQ IDNO5的多核苷酸从约核苷酸2,034到约核苷酸3,384。
在又一个优选实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO6的核酸序列的分离的多核苷酸或其简并变异体。在一个具体实施方案中，SEQ ID NO6的多核苷酸编码区包含核苷酸685到2,034。
在其它优选实施方案中，本发明涉及反义RNA分子，所述反义RNA分子与包含SEQ ID NO6的核酸序列的多核苷酸或其简并变异体反义。在一个具体实施方案中，所述RNA与以下多核苷酸反义SEQ ID NO6的多核苷酸从约核苷酸1到约核苷酸684，或者SEQ IDNO6的多核苷酸从约核苷酸2,034到约核苷酸3,384。
在又一个优选实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO8的核酸序列的分离的多核苷酸或其简并变异体。在一个具体实施方案中，SEQ ID NO8的多核苷酸编码区包含核苷酸332到1,858。
在某些优选实施方案中，本发明涉及反义RNA分子，所述反义RNA分子与包含SEQ ID NO8的核酸序列的多核苷酸或其简并变异体反义。在一个具体实施方案中，所述RNA与以下多核苷酸反义SEQ ID NO8的多核苷酸从约核苷酸1到约核苷酸331，或者SEQ IDNO8的多核苷酸从约核苷酸1,859到约核苷酸4,718。
在其它优选实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO10的核酸序列的分离的多核苷酸或其简并变异体。在一个具体实施方案中，SEQID NO10的多核苷酸编码区包含核苷酸250到1,785。
在其它优选实施方案中，本发明涉及反义RNA分子，所述反义RNA分子与包含SEQ ID NO10的核酸序列的多核苷酸或其简并变异体反义。在某些实施方案中，所述RNA与以下多核苷酸反义SEQID NO10的多核苷酸从约核苷酸1到约核苷酸249，或者SEQ IDNO10的多核苷酸从约核苷酸1,786到约核苷酸5,386。
在具体的优选实施方案中，本发明涉及以下多核苷酸包含与SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列的多核苷酸、包含与SEQ ID NO2或SEQ ID NO2的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列的多核苷酸、包含与SEQ ID NO3或SEQ ID NO3的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列的多核苷酸、包含与SEQ ID NO5或SEQ ID NO5的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列的多核苷酸、包含与SEQ ID NO6或SEQ IDNO6的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列的多核苷酸、包含与SEQ ID NO8或SEQ ID NO8的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列的多核苷酸、或者包含与SEQ ID NO10或SEQ ID NO10的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列的多核苷酸。
在其它实施方案中，本发明涉及与具有SEQ ID NO4、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列的蛋白选择性结合的抗体。
在其它实施方案中，本发明涉及转基因动物，所述转基因动物包含编码GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含选自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述动物选自小鼠、大鼠、兔和仓鼠。在其它实施方案中，所述多肽处于可调节表达系统的控制之下。在一个优选实施方案中，所述多肽包含一个调节GPCR活性的突变。在另一个优选实施方案中，所述动物对所述突变而言为杂合的。在另一个优选实施方案中，所述动物对所述突变而言为纯合的。
在其它实施方案中，本发明提供抑制GPCR多核苷酸在细胞内表达的方法，所述多核苷酸选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10，所述方法包括给所述细胞提供与所述多核苷酸反义的核酸分子。
在另一个实施方案中，本发明涉及测定试验化合物对GPCR多肽活性的影响的方法，所述方法包括下述步骤提供包含编码GPCR多肽的多核苷酸的转基因动物，其中所述GPCR多肽具有选自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；将试验化合物给予所述动物，在存在或不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对GPCR活性的影响。在具体实施方案中，所述多核苷酸具有至少一个选自核苷酸缺失、核苷酸取代和核苷酸插入的突变。
在另一个实施方案中，本发明提供测定试验化合物对GPCR多肽活性的影响的方法，所述方法包括下述步骤提供包含GPCR多肽的重组细胞，所述GPCR多肽具有选自SEQ ID NO4、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；使所述细胞与试验化合物接触，在存在或不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对GPCR活性的影响。在一个优选实施方案中，测定所述试验化合物作用选自测量GPCR激酶活性、测量GPCR磷酸化、测量磷脂酰肌醇水平、测量GTP酶活性、测量GTP水平、测量cAMP水平、测量GDP水平和测量Ca2+水平。在另一个实施方案中，所述多核苷酸具有至少一个选自核苷酸缺失、核苷酸取代和核苷酸插入的突变。
在其它实施方案中，本发明涉及治疗需要增强GPCR活性的受治疗者的方法，所述方法包括给予所述受治疗者治疗有效量的一种GPCR受体激动剂和/或给予所述受治疗者一种编码GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列，所述GPCR受体激动剂或编码GPCR多肽的多核苷酸采用在体内产生GPCR活性的形式。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗需要抑制GPCR活性的受治疗者的方法，所述方法包括给予所述受治疗者治疗有效量的一种GPCR受体拮抗剂；和/或给予所述受治疗者一种抑制编码GPCR多肽的多核苷酸表达的多核苷酸，所述GPCR多肽包含选自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；和/或给予所述受治疗者治疗有效量的一种与GPCR竞争其配体的多肽。
在又一个实施方案中，本发明提供诊断受治疗者与GPCR表达或活性相关的疾病或对所述疾病的易感性的方法，所述方法包括确定编码GPCR多肽的多核苷酸中是否存在突变，所述GPCR多肽包含选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；和/或测定来自所述受治疗者的样品中存在GPCR表达，其中所表达的GPCR是编码GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ IDNO11的氨基酸序列。
在再一个实施方案中，本发明提供治疗需要抑制GPCR活性的受治疗者的方法，所述治疗包括给予所述患者治疗有效量的一种结合GPCR多肽胞外部分的抗体，所述GPCR多肽包含选自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。
根据下面的详细描述、其优选实施方案和权利要求书，本发明的其它特征和优势将会是显而易见的。
附图简述

图1显示人和小鼠UP_11预测蛋白质序列的氨基酸序列比对。
图2显示UP_11和OM_10的亲水性分布图。该图使用Toppred和GES评分系统(Engelman等，1986)产生。显著性截断值1.0以实线表示。
图3显示从基因组预测和表达模式获得的UP_11 GPCR。
图4显示从基因组预测和表达模式获得的OM_10 GPCR。
图5显示人OM_10 cDNA和基因图谱。
发明详述本发明鉴定出编码两种新型G蛋白偶联受体(下文称为GPCR)的基因。更具体地讲，在某些实施方案中，本发明涉及新鉴定的人类基因组多核苷酸，所述多核苷酸编码命名为UP_11和OM_10的孤独GPCR。在其它实施方案中，本发明涉及上面鉴定的人类多核苷酸的鼠直向同源物，所述鼠直向同源物编码命名为mUP_11和mOM_10的孤独GPCR。本文定义的孤独受体是其天然存在的配体尚未得到鉴定的GPCR多肽。
通过TBLASTN(Altschul等，1997)对GenBank的高通量基因组序列(HTGS)部分和对Celera人类基因组数据库的搜索，鉴定本发明的孤独GPCR。使用人5-HT6受体序列(登录号L41147)进行所述搜索。使用perl script解析上面TBLASTN搜索的结果，鉴定高分值区段对蛋白(HSP)序列，然后使用BLASTP算法，用所述序列对全面的蛋白质序列数据库进行搜索。所述第二次BLAST搜索的命中根据E(期望)值进行排序，根据与第一个数据库命中的相似性程度，人工评价每个命中的潜在新颖性。这导致鉴定出人类基因组DNA中可能包含新型GPCR的几个区。从数据库中提取基因组DNA的这些区，使用Genscan算法(Burge和Karlin，1997)预测每个可能的新型GPCR的全长基因。使用这些全长基因预测，设计用于分离全长cDNA序列的引物和探针。
预测命名为OM_10的人GPCR多肽序列(SEQ ID NO9)由一个外显子编码，该外显子起始于SEQ ID NO8的核苷酸332，终止于核苷酸1,858。与OM_10最接近的数据库同源物是“RE2”，也称为“人类H2组胺受体”(国际申请第WO 00/06597号、第WO 00/040724号、第WO 98/20040号)，所述同源物包含与SEQ ID NO9氨基酸31到氨基酸220的192个氨基酸有32％相同以及与SEQ ID NO9氨基酸394到氨基酸468的76个氨基酸有32％相同的两个氨基酸序列段。SEQ ID NO9氨基酸220到氨基酸残基394的间插氨基酸序列段与IGS1(国际申请第WO 01/09184号)有同源性。预测该区编码所述OM_10多肽的第三个胞内环，该环是GPCR超家族成员中最具有可变性的区域。人OM_10多肽的鼠GPCR直向同源物(SEQ ID NO10)编码SEQ ID NO11所示的mOM_10多肽。mOM_10多核苷酸的编码序列包含SEQ ID NO10的核苷酸250到1,785。
命名为UP_11的人GPCR多肽序列(SEQ ID NO4)包含451个氨基酸残基，预测由总共3个外显子编码。SEQ ID NO1的人UP_11cDNA多核苷酸序列(也称为克隆179)与人受体GPR61有82％序列同一性(Lee等，2000)，具有SEQ ID NO1从核苷酸298到1,653的编码序列，在核苷酸位置1,920有一个内含子，在核苷酸位置2,879有一个缺失。由UP_11外显子2编码的氨基酸序列与日本申请第合受体蛋白”的232个氨基酸残基相同。SEQ ID NO2的人UP_11部分cDNA序列(也命名为克隆200)具有从核苷酸1到1,313的编码序列，在核苷酸位置1,593有一个内含子。SEQ ID NO3的人UP_11cDNA序列(也命名为克隆30)具有从核苷酸671到2,026的编码序列，在核苷酸位置70和2,288有一个内含子。
此外，分离包含鼠mUP_11序列的SEQ ID NO5有3,384个核苷酸的cDNA序列(克隆67.1)以及SEQ ID NO6有3,397个核苷酸的cDNA序列(克隆52.1)。SEQ ID NO5的核苷酸编码序列包含核苷酸684到2,033，SEQ ID NO6的核苷酸编码序列包含核苷酸685到2,034。对mUP_11序列的分析证明，mUP_11包含与人UP_11克隆52.1孤独GPCR UP_11有高度氨基酸序列相似性(即94％同一性)的一个编码外显子(图1)。克隆52.1孤独GPCR UP_11。
UP_11和OM_10的亲水性分布图(图2)提示存在7个跨膜(TM)结构域。除所述7个TM结构域外，所述UP_11和OM_10多肽包含多个进一步提示它们属于GPCR超家族的特征基序。例如，UP_11和OM_10都在跨膜区2上包含一个保守天冬氨酸、前2个胞外环中的保守半胱氨酸残基、与跨膜结构域3相邻的保守DRY三联体(在UP_11中，D被E保守取代)以及许多其它已知对于GPCR结构和功能重要的残基。对UP_11的表达分析(图3)以及对OM_10的表达分析(图4)表明，这两种基因都在中枢神经系统中高水平表达。当通过组织表达阵列进行测定时，在大脑皮质、额叶、顶叶、枕叶、颞叶、大脑皮质的旁中央小叶、脑桥、小脑、胼胝体、扁桃体、尾状核、海马、延髓、豆状核、黑质、accumbens nucleus、丘脑、垂体腺和脊髓中观察到UP_11表达。根据多组织RNA印迹分析，UP_11转录物主要在脑中检出，在骨骼肌和心脏中也可以检出。在RNA印迹上检测到三种UP_11转录物，说明所述转录物可能来自对外显子的不同使用。在小鼠全脑、嗅球、纹状体、皮质、海马、丘、中脑和小脑中检测到mUP_11转录物。OM_10主要在豆状核和尾状核中表达。中检测到mUP_11转录物。OM_10主要在豆状核和尾状核中表达。在扁桃体、海马和髓质中也观察到更弱的表达。在豆状核中检测到两种OM_10转录物。在纹状体、中脑、下丘脑、脑干和丘中检测到mOM_10转录物。
因此，在某些实施方案中，本发明涉及编码GPCR多肽的分离的多核苷酸或其片段，所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的核酸序列。在其它实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列的GPCR多肽。在其它实施方案中，本发明涉及编码GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列。在其它实施方案中，本发明提供重组载体，所述重组载体包含编码GPCR多肽的多核苷酸。在另一个实施方案中，在宿主细胞内包含载体，其中所述载体包含编码GPCR多肽的多核苷酸，在所述宿主细胞内表达所述多核苷酸，产生所述编码多肽或其片段。在其它实施方案中，提供测定试验化合物调节GPCR多肽活性的能力的方法、产生GPCR多肽的方法、诊断受治疗者与GPCR表达或活性有关的疾病或对所述疾病的易感性的方法、以及治疗需要抑制或激活GPCR活性的受治疗者的方法。
A.编码UP_11和OM_10 GPCR多肽的分离的多核苷酸考虑将本发明的分离的纯化GPCR多核苷酸用于生产GPCR多肽。因此，一方面，本发明提供编码UP_11或OM_10多肽的分离的纯化多核苷酸。UP_11多肽定义为包含在SEQ ID NO4中描述的氨基酸序列的多肽(人UP_11)、人UP_11的等位基因变异体以及人UP_11多肽的直向同源物如SEQ ID NO7中描述的氨基酸序列(mUP_11)。OM_10多肽定义为包含SEQ ID NO9中描述的氨基酸序列的多肽(人OM_10)、人OM_10的等位基因变异体以及人OM_10多肽的直向同源物如SEQ ID NO11中描述的氨基酸序列(mOM_10)。
因此，在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸是DNA分子。在一个优选实施方案中，本发明的多核苷酸编码包含SEQ ID NO4或SEQ ID NO7的氨基酸序列的UP_11多肽、其变异体或其片段。在另一个优选实施方案中，本发明的多核苷酸编码包含SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列的OM_10多肽、其变异体或其片段。
在本发明的另一方面，分离的纯化多核苷酸包含选自SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10的核酸序列、其简并变异体或其互补序列。
优选的UP_11多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6中所示的核苷酸序列。SEQ IDNO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列对应于人UP_11 cDNA。这些cDNA包含编码人UP_11多肽的序列(例如“编码区”，SEQ IDNO1从核苷酸298到2,879)以及5′非翻译序列(SEQ ID NO1核苷酸1到297)和3′非翻译序列(SEQ ID NO1核苷酸1654到3,824)。SEQ IDNO5和SEQ ID NO6的序列对应于编码人UP_11的鼠直向同源物的cDNA。
优选的OM_10多核苷酸包含SEQ ID NO8和SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列。SEQ ID NO8的序列对应于人OM_10 cDNA。该cDNA包含编码人OM_10多肽的序列(例如“编码区”，SEQ ID NO8从核苷酸332到1858)以及5′非翻译序列(SEQ ID NO8核苷酸1到331)和3′非翻译序列(SEQ ID NO8核苷酸1,859到4,718)。SEQ ID NO10的序列对应于编码人OM_10的鼠直向同源物的cDNA。
或者，本发明的多核苷酸可以仅包含SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的编码区。
本文所用的术语“多核苷酸”是指通过磷酸二酯键连接的核苷酸序列。在本文中，多核苷酸的方向从5′到3′。本发明的多核苷酸可以包含约40个碱基对到约数百个碱基对。多核苷酸最好包含约10个碱基对到约3,000个碱基对。具体多核苷酸的优选长度在下文中叙述。
本发明的多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子、核糖核酸(RNA)分子、或者使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链，但最好是双链DNA。当多核苷酸是DNA分子时，该分子可以是基因、cDNA分子或基因组DNA分子。本文中用单字母编码表示核苷酸碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。
“分离的”是指“经由人的劳动”而从自然状态改变。假如天然存在“分离的”组合物或物质，那么它已经被改变，或者离开其原始环境，或者二者都有。例如，根据本文所用的术语，在活动物体内天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但与其天然状态共存的材料分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。
“分离的”多核苷酸最好不含获得所述核酸的生物基因组DNA中天然邻接所述核酸的序列(即位于所述核酸5′端和3′端的序列)。例如，在各种实施方案中，分离的GPCR核酸可以包含获得所述核酸的细胞(例如神经元细胞或胎盘细胞)基因组DNA中天然邻接所述核酸分子的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷酸序列。然而，所述GPCR核酸分子可以与其它蛋白编码或调节序列融合，而仍然被认为是分离的。
可以使用标准克隆和筛选技术，从由人类细胞mRNA或基因组DNA产生的cDNA文库获得本发明的多核苷酸。也可以使用众所周知的商业化技术合成本发明的多核苷酸。
本发明还包括这样的核酸分子由于遗传密码的简并性，所述核酸分子与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列(及其片段)不同，并因此编码与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10中所示的核苷酸序列所编码的同样GPCR多肽。
在另一个优选实施方案中，本发明分离的多核苷酸包含与SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列或这些核苷酸序列的片段互补的核酸分子。与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列互补的核酸分子与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10的核苷酸序列完全互补，以便它能够与SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列杂交，由此形成稳定的双链体。
使用本领域众所周知的方法，可以容易地鉴定人和鼠UP_11和OM_10多核苷酸的直向同源物和等位基因变异体。这些GPCR的等位基因变异体和直向同源物将包含以下核苷酸序列所述核苷酸序列与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列或这些核苷酸序列的片段有一般至少约70-75％同源性、更一般至少约80-85％同源性、最常见至少约90-95％或更高同源性。根据与SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列或这些核苷酸序列的片段(最好在严格性条件下)杂交的能力，可以容易地鉴定所述核酸分子。
此外，本发明的多核苷酸可以仅包含UP_11或OM_10多核苷酸序列或基因的编码区的片段，例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10的片段。
当本发明的多核苷酸用于重组生产UP_11和OM_10多肽时，所述多核苷酸可以包括所述成熟多肽的编码序列本身，或者所述成熟多肽的编码序列与其它编码序列在同一可读框中，所述其它编码序列例如那些编码前导序列或分泌序列、前多肽序列、或原多肽序列或前原多肽序列或其它融合肽部分的序列。例如，可以编码便于纯化融合多肽的标记序列(参见Gentz等，1989，通过引用结合到本文中)。所述多核苷酸也可以包含非编码5′和3′序列，例如转录但不翻译的序列、剪接信号和聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点和稳定mRNA的序列。
除SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的GPCR核苷酸序列外，本领域技术人员将会认识到，在群体(例如人类群体)内可能存在导致UP_11或OM_10多肽的氨基酸序列改变的DNA序列多态性。由于天然等位基因变异，基因或多核苷酸中的所述遗传多态性可能存在于同一群体内的不同个体之间。本文所用的术语“基因”和“重组基因”是指包含编码GPCR多肽的可读框的多核苷酸，所述GPCR多肽最好是哺乳动物UP_11或OM_10多肽。所述天然等位基因变异一般可能导致多核苷酸的核苷酸序列中1-5％的变异。本发明范围内包括天然等位基因变异引起的UP_11或OM_10多核苷酸内任何和所有所述核苷酸变异和由此导致的UP_11或OM_10多核苷酸内氨基酸多态性。所述等位基因变异包括有活性等位基因变异体以及无活性或活性降低的等位基因变异体，后两种类型一般产生病理疾病。
此外，来自其它物种的编码UP_11或OM_10多肽的核酸分子和因此具有与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的人或鼠序列不同的核苷酸序列的核酸分子包括在本发明的范围内。可以如下分离本发明的对应于人UP_11或OM_10 cDNA的天然等位基因变异体和非人类直向同源物的多核苷酸根据它们与本文公开的人UP_11或OM_10多核苷酸的同源性，依照标准杂交技术，在严格杂交条件下，用人cDNA或其片段作为杂交探针进行分离。
因此，可以通过如下方法从人类以外的物种获得编码本发明多肽的多核苷酸，包括同源物和直向同源物，所述方法包括下述步骤在严格杂交条件下，用具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10序列或其片段的标记探针筛选合适的文库；然后分离包含所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。所述杂交技术是技术人员熟知的。技术人员将会认识到，在许多情况下，分离的cDNA序列将是不完全的，因为所述多肽的编码区在所述cDNA的5′末端截短。这是逆转录酶作用的结果，所述酶本质上具有低“持续合成能力(processivity)”(酶在聚合反应期间保持附着到模板上的能力的度量)，不能在第一条链cDNA合成期间完成mRNA模板的DNA拷贝。
因此，在某些实施方案中，本发明提供的多核苷酸序列信息使得可以制备能够与本文公开的所选多核苷酸的基因序列特异性杂交的相对短的DNA(或RNA)寡核苷酸序列。本文所用的术语“寡核苷酸”定义为包含两个或多个、通常超过三(3)个、一般超过十(10)个直到一百(100)个(虽然最好在二十个到三十个之间)脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。准确大小取决于许多因素，而这些因素又依赖于所述寡核苷酸的最终功能或应用。因此，在本发明的具体实施方案中，在考虑所选核苷酸序列的基础上制备合适长度的核酸探针，所述所选核苷酸序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10中所示的序列。所述核酸探针与编码GPCR的多核苷酸特异性杂交的能力使它们能够具体地用于多种实施方案。最重要的是，所述探针可以用于多种测定，以检测给定样品中存在互补序列。
在某些实施方案中，使用寡核苷酸引物是有利的。可以通过任何方法产生这些引物，包括化学合成、DNA复制、逆转录或它们的组合。使用本发明的多核苷酸设计所述引物的序列，以通过聚合酶链式反应(PCR)技术从哺乳动物细胞检测、扩增或突变编码GPCR多肽的基因或多核苷酸的特定区段。
在某些实施方案中，为检测杂交体形成，本发明多核苷酸和合适标记结合使用是有利的。本领域已知各种各样的合适标记，包括能够给出可检测信号的放射性配体、酶配体或其它配体，例如抗生物素蛋白/生物素。
与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10包含的核苷酸序列或其片段相同或足够相同的多核苷酸可以用作cDNA和基因组DNA的杂交探针，或用作核酸扩增(PCR)反应的引物，以分离编码本发明多肽的全长cDNA和基因组克隆，以及用于分离与SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10或其片段有高度序列相似性的其它基因(包括编码来自人以外物种的同源物和直向同源物的基因)的分离cDNA和基因组克隆。通常这些核苷酸序列与参比多核苷酸序列的核苷酸序列有至少约70％相同到至少约95％相同。所述探针或引物一般包含至少15个核苷酸，优选包含至少30个核苷酸，并且可以包含至少50个核苷酸。尤其优选的探针具有30-50个核苷酸。
有几种用于获得全长cDNA或延伸短cDNA的方法是本领域技术人员可以利用的并且是众所周知的，例如那些基于cDNA末端快速扩增法(RACE)的方法(参见Frohman等，1988)。例如，以MarathonTM技术(Clontech Laboratories Inc.)为例的技术最新进展已经显著简化对更长cDNA的搜索。在MarathonTM技术中，从由所选组织提取的mRNA制备cDNA，并在每一端连接一个“接头”序列。然后使用基因特异性寡核苷酸引物和接头特异性寡核苷酸引物的组合，进行核酸扩增(PCR)，来扩增“丢失”的cDNA 5′端。然后使用“嵌套”引物重复所述PCR反应，“嵌套”引物即设计用于在扩增产物内退火的引物(通常接头特异性引物的3′端在接头序列内退火，而基因特异性引物的5′端在已知基因序列内退火)。然后通过DNA测序和构建的全长cDNA分析该反应的产物，所述全长cDNA如下构建或者通过将所述产物直接连接到现有的cDNA上，产生完整序列，或者使用新序列信息设计5′引物，进行单独的全长PCR。
为提供符合本发明的某些优势，用于杂交研究或测定的优选核酸序列包括与编码UP_11或OM_10多肽的多核苷酸的至少10个到大约70个核苷酸序列段互补的探针分子，所述UP_11或OM_10多肽例如SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11中所示的多肽。大小为长至少10个核苷酸有助于保证所述片段具有形成既稳定又有选择性的双链体分子的足够长度。然而，为增加杂交体的稳定性和选择性，一般优选在长度大于10个碱基的序列段内有互补序列的分子，由此改善获得的特异性杂交体分子的质量和程度。当需要时，技术人员一般优先设计具有25-40个核苷酸、55-70个核苷酸或甚至更长的基因互补序列段的核酸分子。可以容易地如下制备所述片段例如，通过化学方法直接合成所述片段，通过应用核酸复制技术，例如美国专利第4,683,202号的PCR技术(通过引用全部结合到本文中)，或者通过从包含合适插入片段和合适限制酶位点的重组质粒切下所选DNA片段。
另一方面，本发明考虑分离的纯化多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的至少10个连续碱基的区段相同或互补的碱基序列，其中所述多核苷酸与编码UP_11或OM_10多肽的多核苷酸杂交。所述分离的纯化多核苷酸最好包含与SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的至少25到70个连续碱基的序列段相同或互补的碱基序列。例如，本发明的多核苷酸可以包含与所公开的核苷酸序列的40个或55个连续碱基相同或互补的碱基区段。
因此，由于本发明的多核苷酸探针分子与所述基因的互补序列段选择性形成双链体分子的能力，可以使用所述多核苷酸探针分子。根据所考虑的应用，技术人员将希望使用不同杂交条件，以获得所述探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高程度选择性的应用，技术人员通常希望使用相对严格的条件来形成杂交体(参见表1)。
当然，对于一些应用，例如当技术人员希望使用与潜在模板杂交的突变体引物链制备突变体时，或者当技术人员寻求从其它细胞分离GPCR多肽编码序列、功能等同物等等时，一般需要允许形成异源双链体的较不严格的杂交条件。因此，根据与对照杂交相比的阳性杂交信号，可以容易地鉴定出交叉杂交的种类。无论如何，一般认为增加甲酰胺加入量可以使条件更严格，增加甲酰胺加入量与提高温度的作用方式相同，破环杂交体双链体的稳定性。因此，可以容易地操作杂交条件，由此这也一般成为根据所希望的结果而可选的方法。
本发明也包括能够在降低的严格性条件下、更优选严格性条件下、最优选高严格性条件下与本文描述的多核苷酸杂交的多核苷酸。严格性条件的实例示于下表中高严格性条件是那些至少与例如条件A-F一样严格性的条件；严格性条件是至少与例如条件G-L一样严格性的条件；降低的严格性条件是至少与例如条件M-R一样严格性的条件。
表1严格性条件
(bp)1杂交体长度预期是杂交多核苷酸的杂交区。当多核苷酸与未知序列的靶多核苷酸杂交时，杂交体长度假定是所述杂交多核苷酸的长度。当已知序列的多核苷酸被杂交时，则可以通过将所述多核苷酸的所述序列进行序列比对并且鉴定出一个或多个最适序列互补性的区域，来确定杂交体长度。
缓冲液H在杂交缓冲液和洗涤缓冲液中，SSPE(1xSSPE为0.15M NaCl、10mMNaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可以替代为SSC(1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成之后，将洗涤进行15分钟。
TB-TR预期长度少于50个碱基对的杂交体的杂交温度应该是低于杂交体解链温度(Tm)5-10℃，其中Tm按照下列等式来确定。对于长度少于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基数)*4(G+C碱基数)。对于长度在18-49个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝81.5*16.6(log10Na+)*0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂交体中的碱基数，而Na+为杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1xSSC，Na+＝0.165M)。
对于多核苷酸杂交，严格性条件的其它实例在以下文献中提供Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第9章和第11章，和Ausubel等编著，1995，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，第2.10节和第6.3-6.4节，所述文献通过引用全部结合到本文中。
除上文所述编码GPCR多肽的核酸分子外，本发明的另一方面涉及与其反义的分离的核酸分子。“反义”核酸包含与编码蛋白的“有义”核酸互补的核苷酸序列，如与双链cDNA分子的编码链互补或者与mRNA序列互补。因此，反义核酸可以与有义核酸通过氢键结合。反义核酸可以与完整的GPCR编码链互补，或者仅与其片段互补。在一个实施方案中，反义核酸与编码GPCR多肽的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。
术语“编码区”是指包含翻译成为氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区，如SEQ ID NO1的完整编码区核苷酸298到1,653、SEQ IDNO2的完整编码区核苷酸1到1,313、SEQ ID NO3的完整编码区核苷酸671到2,206、SEQ ID NO5的完整编码区核苷酸684到2,033、SEQ ID NO6的完整编码区核苷酸685到2,034、SEQ ID NO8的完整编码区核苷酸332到1,858或SEQ ID NO10的完整编码区核苷酸250到1,785。在另一个实施方案中，所述反义核酸分子与编码GPCR多肽的核苷酸序列的编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”是指在编码区侧翼、不翻译成为氨基酸的5′和3′序列(即也称为5′和3′非翻译区)。例如，SEQ ID NO1的非编码区包含核苷酸1到297和核苷酸1,654到3,824、SEQ ID NO2的非编码区包含核苷酸1,314到3,456、SEQ ID NO3的非编码区包含核苷酸1到670和核苷酸2,027到3,779、SEQ ID NO5的非编码区包含核苷酸1到683和核苷酸2,034到3,384、SEQ ID NO6的非编码区包含核苷酸1到684和核苷酸2,035到3,384、SEQ ID NO8的非编码区包含核苷酸1到331和核苷酸1,859到4,718、SEQ ID NO10的非编码区包含核苷酸1到249和核苷酸1,786到5,386。
对于编码本文公开的GPCR多肽的编码链序列(例如SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10)，可以根据沃森-克里克碱基配对法则，设计本发明的反义核酸。所述反义核酸分子可以与UP_11或OM_10mRNA的完整编码区互补，但更优选是仅与UP_11或OM_10mRNA的编码区片段或非编码区片段反义的寡核苷酸。例如，所述反义寡核苷酸可以与UP_11 mRNA翻译起始位点周围的区互补。
反义寡核苷酸可以长约例如5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个核苷酸。可以使用本领域已知的方法，采用化学合成和酶促连接反应，构建本发明的反义多核苷酸。例如，使用设计用以增加分子的生物稳定性或增加在反义多核苷酸和有义多核苷酸之间形成的双链体的物理稳定性的天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸，可以化学合成反义多核苷酸(例如反义寡核苷酸)，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用来产生所述反义多核苷酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
另一方面，可以用以反义方向(即从插入多核苷酸转录的RNA对于目标靶多核苷酸而言必定为反义方向，在下面的小节中有进一步的描述)，将核酸亚克隆到表达载体中，通过生物学方法产生反义核酸。
本发明的反义核酸分子通常原位给予受治疗者，或者在受治疗者体内原位产生，以便它们与编码UP_11或OM_10多肽的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，因此通过例如抑制转录和/或翻译而抑制所述多肽的表达。所述杂交可以通过常规核苷酸互补性形成稳定的双链体，或者例如在结合DNA双链体的反义核酸分子的情况下，通过双螺旋大沟内的特异性相互作用。本发明反义核酸分子给予途径的实例包括在组织位点直接注射。或者，可以修饰反义核酸分子使其靶向所选细胞，然后系统给予。例如，对于系统给予，可以修饰反义分子，使其特异性结合在所选细胞表面表达的受体或抗原，例如通过将所述反义核酸分子连接到结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体。然后可以使用本文所述载体，将所述反义核酸分子传递到细胞。
在又一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-端基异构核酸分子。α-端基异构核酸分子与互补RNA形成特殊的双链杂交体，其中与通常的γ-单位相反，所述链相互平行(Gaultier等(1987))。所述反义多核苷酸分子也可以包含一个2′-邻甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987(a))或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，1987(b))。
在另一个实施方案中，本发明的反义核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与它们有互补区的单链核酸例如mRNA。因此，可以使用核酶(例如锤头型核酶(在Haselhoff和Gerlach，1988中描述))催化性切割GPCR mRNA转录物，由此抑制GPCR mRNA的翻译。可以根据本文公开的GPCR cDNA的核苷酸序列(例如SEQ ID NO1)，设计对GPCR编码核酸有特异性的核酶。例如，可以构建四膜虫属(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与GPCR编码mRNA中要切割的核苷酸序列互补。参见例如Cech等的美国专利第4,987,071号和Cech等的美国专利第5,116,742号，所述两个专利通过引用全部结合到本文中。或者，可以使用GPCR mRNA，从RNA分子库选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见例如Bartel和Szostak，1993。
或者，可以通过指导与UP_11或OM_10基因调节区(例如基因启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列形成三螺旋结构，预防所述基因在靶细胞中转录，从而抑制基因表达。一般参见Helene，1991；Helene等，1992；和Maher，1992)。
也可以采用RNA干涉(RNAi)来抑制GPCR基因表达。这是一项针对转录后基因沉默(PTGS)的技术，其中靶基因活性被关连双链RNA(dsRNA)特异性消除。RNAi在许多方面类似于植物中的PTGS并且已在许多无脊椎动物中检测到，所述无脊椎动物包括锥虫、水螅、涡虫、线虫和果蝇(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))。它可以参与调节转座元件固定化和抗病毒状态形成。哺乳动物系统中的RNAi公开于国际申请第WO 00/63364号，所述申请通过引用全部结合到本文中。基本上，将与靶(GPCR)同源的至少约600个核苷酸大小的dsRNA导入细胞，然后观察基因活性的序列特异性降低。
B.分离的UP_11和OM_10多肽在具体实施方案中，本发明提供分离的纯化UP_11和OM_10GPCR多肽。本发明的GPCR多肽最好是重组多肽。通常，在非人类细胞中通过重组表达产生GPCR。
依照本发明的UP_11多肽包括包含以下的多肽1)SEQ ID NO4或SEQ ID NO7中所示的氨基酸序列；2)人UP_11多肽的功能性和非功能性天然存在的等位基因变异体；3)重组产生的人UP_11多肽的变异体；和4)从除人类以外的生物分离的UP_11多肽(人UP_11多肽的直向同源物)。
依照本发明的OM_10多肽包括包含以下的多肽1)SEQ ID NO9或SEQ ID NO11中所示的氨基酸序列；2)人OM_10多肽的功能性和非功能性天然存在的等位基因变异体；3)重组产生的人OM_10多肽的变异体；和4)从除人类以外的生物分离的OM_10多肽(人OM_10多肽的直向同源物)。
依照本发明的人UP_11多肽的等位基因变异体包括1)从人类细胞或组织分离的多肽；2)与编码人UP_11多肽的遗传位点相同的遗传位点编码的多肽；和3)包含与人UP_11有实质同源性的多肽。同样，依照本发明的人OM_10多肽的等位基因变异体包括1)从人类细胞或组织分离的多肽；2)与编码人OM_10多肽的遗传位点相同的遗传位点编码的多肽；和3)包含与人OM_10有实质同源性的多肽。
人UP_11和OM_10的等位基因变异体包括功能性和非功能性UP_11和OM_10多肽。功能性等位基因变异体是保持结合UP_11配体或OM_10配体以及在细胞内转导信号的能力的人UP_11或OM_10多肽的天然存在的氨基酸序列变异体。功能性等位基因变异体通常仅包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11一个或多个氨基酸的保守取代，或者所述多肽非关键区内非关键残基的取代、缺失或插入。
非功能性等位基因变异体是没有结合配体和/或在细胞内转导信号的能力的人UP_11或OM_10多肽的天然存在的氨基酸序列变异体。非功能性等位基因变异体通常包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列非保守取代、缺失或插入，或者所述序列的成熟前截短，或者在关键残基或关键区的取代、缺失或插入。
本发明还提供人UP_11或OM_10多肽的非人类直向同源物。人UP_11或OM_10多肽的直向同源物是从非人类生物中分离并具有与人GPCR多肽相同的配体结合和信号传递能力的多肽。可以容易地鉴定如下多肽为人UP_11或OM_10多肽的直向同源物所述多肽包含与SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11实质同源的氨基酸序列。
在本文中，当两种蛋白(或所述蛋白的一个区)的氨基酸序列相互之间有至少约60-65％同源性、通常至少约70-75％同源性、更通常至少约80-85％同源性、最通常至少约90-95％或更高同源性时，则所述两种蛋白在实质上同源。为确定两种氨基酸序列(例如SEQ ID NO4和其等位基因变异体)或两种核酸之间的同源性百分率，为最佳比较的目的比对所述序列(例如可以在进行最佳比对的一种蛋白质序列或核酸序列与另一种蛋白质序列或核酸序列中引入空位(gap))。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当一种序列(例如SEQ ID NO4)上一个位置被另一个序列(例如人UP_11蛋白的等位基因变异体)上相应位置同样的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在该位置同源(即本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两种序列之间的同源性百分率是所述序列共享的相同位置数的函数(即同源性％＝相同位置数/总位置数×100)。
关于序列比较，通常将一个序列作为参比序列，将待测序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将待测序列和参比序列输入计算机，必要时指定亚序列坐标，并且指定序列算法程序参数。根据所述指定程序参数，序列比较算法则计算待测序列相对于参比序列的序列同一性百分率。
可以使用如下算法进行为比较目的的最佳序列比对例如Smith和Waterman，1981的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，1970的同源性比对算法、Pearson和Lipman相似性搜索方法、这些算法的计算机化工具(在Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者目测检查(一般参见Ausubel等，John Wiley& Sons；1992)。
有用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP运用渐近配对序列比对，由一组相关序列创建多组序列比对，以显示相关性和序列同一性百分率。它也绘出进化树或分枝图(dendogram)，以显示用来创建所述序列比对的聚类关系。PILEUP采用Feng和Doolittle，1987的渐近序列比对方法的简化方法。所使用的方法类似于Higgins和Sharp，1989描述的方法。所述程序可以比对多达300个序列，每个序列最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。所述多序列比对法始于两个最为相似序列的配对比对，产生一组两个经比对的序列。然后该组序列与下一个最相关的序列或下一组经比对的序列进行比对。通过两个个别序列的配对比对的简单延伸，将两组序列进行比对。通过一系列渐近配对序列比对，完成最终的序列比对。通过指定具体序列及其序列比较区的氨基酸或核苷酸坐标并且指定程序参数，运行该程序。例如，采用以下参数缺省空位加权(default gap weight)(3.00)、缺省空位长度加权(default gap length weight)(0.10)和加权末端空位(weighted end gap)，可以将参比序列与其它待测序列进行比较，以确定序列同一性关系百分率。
适用于测定序列同一性百分率和序列相似性百分率的算法的另一个实例是BLAST算法，该算法在Altschul等，1990中有描述。用于进行BLAST分析的软件公众可通过the National Center forBiotechnology Information得到。该算法包括首先通过鉴定在查询序列中与数据库序列中相同长度的字串比对时或者匹配或者满足某些正数值最低分值T的长度W的短字串，来鉴定高分序列配对(HSP)。T被称为邻近字串最低分值。这些原始邻近字串命中作为起始搜索以发现含有它们的更长HSP的种子。只要累积序列比对分值可以增加，字串命中则以两个方向沿每个序列延伸。
字串命中在每个方向的延伸当遇到下述情况之一时终止累积序列比对分值比其获得的最大值低数量X；累积分值为零或零以下，这是由于一个或多个负打分残基比对的累积所致；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定所述比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的缺省字长(wordlength)(W)为11，BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，1989)序列比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，并且比较两条链。
BLAST算法除计算序列同一性百分率外，也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin和Altschul，1993)。BLAST算法提供的一种相似性测定是最小和概率(P(N))，它提供两个核苷酸序列或氨基酸序列可能偶然发生匹配的概率的指标。例如，如果待测核酸与参比核酸比较中的最小和概率低于0.1，更优选低于大约0.01，最优选小于约0.001，则认为待测核酸与参比序列相似。
可以在本发明多肽的结构中进行修饰和改变，而仍获得具有UP_11样或OM_10样受体特征的分子。例如，可以用其它氨基酸取代序列中的某些氨基酸，而不明显损失受体活性。因为多肽的交互作用能力和本质定义多肽的生物学功能活性，所以可以在多肽序列中(当然，或者在其可能的DNA编码序列中)进行某些氨基酸序列取代，而仍然获得有相似性质的多肽。
当进行所述改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数对于赋予多肽交互生物学功能的重要性是本领域众所周知的(Kyte & Doolittle，1982)。已知某些氨基酸可以被其它具有相似亲水指数或分值的氨基酸取代，而仍然产生有相似生物活性的多肽。在疏水性和电荷特征的基础上，为每种氨基酸都指定亲水指数。这些指数是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
相信氨基酸残基的相对亲水特征决定所得多肽的二级结构和三级结构，而多肽的二级结构和三级结构又决定所述多肽与其它分子(例如酶、底物、受体、抗体、抗原等)的相互作用。本领域已知一种氨基酸可以被另一种具有相似亲水指数的氨基酸取代，而仍获得在功能上等同的多肽。在这样的改变中，优选亲水指数在+/-2以内的氨基酸的取代，尤其优选亲水指数在+/-1的氨基酸的取代，甚至更优选亲水指数在+/-0.5以内的氨基酸的取代。
也可以在亲水性的基础上进行相似氨基酸的取代，尤其是在由此产生的生物学功能等同多肽或肽用于免疫学实施方案的情况下。美国专利第4,554,101号陈述由相邻氨基酸的亲水性决定的多肽的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与所述多肽的生物学性质相关，该专利通过引用全部结合到本文中。
如在美国专利第4,554,101号中详细叙述的，为氨基酸残基指定以下亲水性值精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。已知一种氨基酸可以被另一种具有相似亲水性值的氨基酸取代而仍然获得在生物学上等同、尤其是在免疫学上等同的多肽。在所述改变中，优选亲水性值在±2内的氨基酸的取代，尤其优选亲水性值在±1内的取代，甚至更优选亲水性值在±0.5内的氨基酸的取代。
因此，如上文所概述的，氨基酸取代一般基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑上述各种特征的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(参见表2)。因此，本发明考虑如上所述的GPCR多肽的功能等同物或生物学等同物。
表2原始残基示例性取代的残基
也可以使用定点诱变制备多肽的生物学等同物或功能等同物。定点诱变是通过对可能DNA的特异性诱变，从多肽序列制备第二代多肽或在生物学上等同的多肽或肽的技术。如上所述，当需要进行氨基酸取代时，可能希望有所述改变。该技术进一步提供容易地制备和测试序列变异体的能力，例如通过在DNA中引入一个或多个核苷酸序列改变而加入一种或多种上文考虑的改变。定点诱变允许通过使用编码所需突变DNA序列的特异性寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸而产生突变体，提供具有足够大小和序列复杂性以在所跨越的缺失连接两端形成稳定双链体的引物序列。通常，优选长度约17-25个核苷酸的引物，在需要改变的序列的连接两侧各有约5-10个残基。
一般而言，定点诱变技术是本领域众所周知的。正如技术人员将会认识到的，该技术一般使用以单链形式和双链形式都可以存在的噬菌体载体。通常，如下进行依照本文的定点诱变首先获得单链载体，所述单链载体在其序列内包括编码所有或部分所选的GPCR多肽序列的DNA序列。制备(例如合成)带有所需突变序列的寡核苷酸引物。然后使该引物退火到所述单链载体，使用酶如大肠杆菌(E.coli)聚合酶I克列诺片段延伸，以完成携带突变的链的合成。因此，形成异源双链体，其中一条链编码原始的无突变序列，而第二条链带有所需突变。然后用该异源双链体载体转化合适的细胞，例如大肠杆菌细胞，然后选择包括携带所述突变的重组载体的克隆。市售的试剂盒提供除寡核苷酸引物以外的所有所需试剂。
UP_11 GPCR多肽和OM_10 GPCR多肽是参与细胞内信号途径的GPCR。本文所用的信号途径是指当配体与GPCR多肽结合时，调节(例如刺激或抑制)细胞功能/活性。所述功能的实例包括动员参与信号转导途径的细胞内分子，如磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)、肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)或腺苷酸环化酶；极化质膜；产生或分泌分子；改变细胞组分的结构；细胞增殖，如合成DNA；细胞迁移；细胞分化；和细胞存活。
根据细胞类型，GPCR多肽/配体结合所介导的反应可以不同。例如，在一些细胞中，配体结合GPCR多肽可能通过磷脂酰肌醇或环状AMP代谢和更新而刺激附着、迁移、分化等活性，而在其它细胞中，配体结合GPCR多肽将产生不同结果。不论由GPCR调节的细胞活性如何，普遍的情况是，GPCR多肽是GPCR并且与“G多肽”相互作用，在细胞内例如通过磷脂酰肌醇或环状AMP代谢和更新在多种细胞内信号途径中产生一种或多种第二信号。G多肽代表一个异三聚体多肽家族，所述异三聚体多肽由α、β和γ亚基组成，并且结合鸟嘌呤核苷酸。这些多肽通常连接细胞表面受体，如包含七个跨膜结构域的受体，例如配体受体。当配体结合受体后，构象变化传递到G多肽，导致α亚基交换结合的GDP分子成为GTP分子，并与N亚基解离。α亚基的GTP结合形式通常作为效应物调节部分起作用，导致产生第二信使，例如环状AMP(例如通过激活腺苷酸环化酶)、二酰甘油或肌醇磷酸。已知人体中有多于20种不同类型的α亚基，与种类较少的β亚基和γ亚基结合。
本文所用的“磷酯酰肌醇更新和代谢”是指涉及磷酯酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)更新和代谢的分子以及这些分子的活性。PIP2是一种存在于质膜胞质小叶中的磷脂。在一些细胞中，配体结合GPCR激活质膜上的磷脂酶C，所述磷脂酶C可以水解PIP2，产生1，2-二酰甘油(DAG)和肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)。一旦形成的IP3扩散到内质网表面，它就可以结合IP3受体，例如包含IP3结合位点的钙通道多肽。IP3结合能够诱导开启所述通道，允许钙离子释放到胞质中。IP3也可以被特异性激酶磷酸化，形成肌醇1，3，4，5-四磷酸，肌醇1，3，4，5-四磷酸是一种使钙从胞外基质进入胞质的分子。然后IP3和肌醇1，3，4，5-四磷酸可能分别被快速水解成无活性产物肌醇1，4-二磷酸和肌醇1，3，4-三磷酸。细胞可以重新利用这些无活性产物合成PIP2。水解PIP2产生的另一种第二信使是1，2-二酰甘油(DAG)，该分子留在细胞膜内，可用来激活多肽激酶C。多肽激酶C一般在细胞质内是可溶的，但当细胞内钙浓度增加时，该酶可移动到质膜上，可被DAG激活。不同细胞中多肽激酶C的激活导致不同的细胞反应，例如糖原合成酶的磷酸化，或者各种转录因子如NF-kB的磷酸化。本文所用的术语“磷酯酰肌醇活性”指PIP2或其一种代谢物的活性。
GPCR多肽可能参与的另一种信号途径是cAMP更新途径。本文所用的“环状AMP更新和代谢”是指涉及环状AMP(cAMP)更新和代谢的分子以及这些分子的活性。环状AMP是响应配体诱导的某些G多肽偶联受体刺激而产生的一种第二信使。在配体信号途径中，配体与配体受体结合可能导致激活腺苷酸环化酶，而腺苷酸环化酶催化cAMP的合成。新合成的cAMP可能又激活依赖于cAMP的多肽激酶。这种活化激酶可能例如使电压门控钾通道多肽或者与其结合多肽磷酸化，导致所述钾通道在动作电位期间不能打开。所述钾通道不能打开导致钾离子外流减少，这通常使神经元的膜复极化，导致膜去极化延长。当然，所述活化cAMP激酶也可以影响其它分子，例如酶(例如代谢酶)、转录因子、腺苷酸环化酶等。
本发明的UP_11或OM_10受体多肽是包含与UP_11或OM_10多肽有基本序列相似性、结构相似性和/或功能相似性的任何GPCR多肽，其中所述UP_11或OM_10多肽包含选自SEQ ID NO4、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。此外，本发明的UP_11或OM_10多肽不限于特定来源。因此，本发明提供从多种来源一般性检测和分离UP_11或OM_10受体多肽的种类。例如，事实上GPCR多肽存在于所有哺乳动物(包括人)中。GP57受体和GP58受体的序列以前已有描述(Lee等，2000；欧洲申请号EP 0859055)。同其它受体的情况一样，有可能不同物种的GPCR受体结构和功能之间的差异很小。当物种间存在差异时，本领域技术人员能够鉴定出这些差异。因此，本发明考虑来自任何哺乳动物的UP_11或OM_10多肽，其中优选的哺乳动物是人。
本发明还提供UP_11或OM_10多肽的片段。本文所用的片段包括来自UP_11或OM_10的至少8个连续氨基酸。在本发明中，考虑可能最好将UP_11或OM_10多肽切割成为片段，进一步用于结构分析或功能分析，或者用于产生试剂，例如UP_11或OM_10相关多肽和UP_11、OM_10特异性抗体。这可以通过用肽酶处理纯化或未纯化的UP_11或OM_10而完成，所述肽酶例如内切多肽酶glu-C(Boehringer，Indianapolis，IN)。用CNBr处理是另一种方法，由此可以从天然UP_11或OM_10产生UP_11或OM_10片段。也可以使用重组技术产生UP_11或OM_10的特定片段。
优选的片段是具有UP_11或OM_10多肽一种或多种生物活性(例如结合G蛋白的能力)的片段以及能够用作免疫原产生抗UP_11或抗OM_10抗体的片段。UP_11或OM_10多肽的生物活性片段包括由UP_11或OM_10多肽的氨基酸序列衍生的氨基酸序列的肽，并且表现UP_11或OM_10多肽的至少一种活性，所述UP_11或OM_10多肽的氨基酸序列例如SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQID NO11中所示的氨基酸序列或与UP_11或OM_10多肽同源的多肽的氨基酸序列，所述与UP_11或OM_10多肽同源的多肽包括比全长UP_11或OM_10多肽或者与UP_11或OM_10多肽同源的全长多肽更少的氨基酸。通常，生物活性片段(肽，如长5个、10个、15个、20个、30个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、50个、100个或更多氨基酸的肽)包含结构域或基序，如跨膜结构域或G蛋白结合结构域。
另外，本发明还考虑了配制与UP_11或OM_10立体相似的化合物，以模拟所述肽结构的关键部分，所述化合物称为肽模拟物(peptidomimetics)。模拟物(mimitic)是模拟多肽二级结构元件的含肽分子。参见例如Johnson等(1993)。应用肽模拟物背后的基本原理是多肽的肽骨架主要用于确定氨基酸侧链的方向，以便以这样的方式促进分子间相互作用，例如受体和配体间的相互作用。
目前肽模拟物概念的成功应用集中在多肽内β-转角的模拟物。同样，通过上文讨论的基于计算机的算法，可以预测UP_11或OM_10内的β-转角结构。一旦确定所述转角的组成氨基酸，就可以构建模拟物，获得氨基酸侧链必需元件的相似空间取向。
可以从天然表达UP_11或OM_10多肽的细胞纯化分离的所述多肽，或者从经改变以表达UP_11或OM_10多肽的细胞纯化所述多肽，或者使用已知的蛋白质合成方法合成所述多肽。如下所述，最好通过重组DNA技术产生分离的UP_11或OM_10多肽。例如，将编码所述蛋白的核酸分子克隆到表达载体中，然后将所述表达载体导入宿主细胞中，并在所述宿主细胞内表达所述UP_11或OM_10多肽。然后使用标准蛋白质纯化技术，根据合适的纯化方案，从所述细胞中分离出UP_11或OM_10多肽。作为重组表达的另一种方法，可以使用标准肽合成技术，化学合成UP_11或OM_10多肽或片段。最后，可以从天然表达UP_11或OM_10多肽的细胞(例如尾状核、豆状核)分离出天然UP_11或OM_10多肽。
本发明还提供UP_11或OM_10嵌合蛋白或融合蛋白。本文所用的UP_11或OM_10多肽“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含与非UP_11多肽或非OM_10多肽有效连接的UP_11或OM_10多肽。“UP_11或OM_10多肽”是指具有对应于UP_11或OM_10多肽的氨基酸序列的多肽，而“非UP_11多肽或非OM_10多肽”是指具有对应于与UP_11或OM_10多肽基本不同源的多肽的氨基酸序列的异源多肽，例如与UP_11或OM_10多肽不同的蛋白。在融合蛋白的范围内，术语“有效连接”是指所述UP_11或OM_10多肽以及所述非UP_11多肽或非OM_10多肽相互符合读框地融合。所述非UP_11多肽或非OM_10多肽可以与所述UP_11或OM_10多肽的N末端或C末端融合。例如，在一个实施方案中，所述融合多肽是GST-UP_11或OM_10融合多肽，其中UP_11序列或OM_10序列与GST序列的C末端融合。融合多肽的其它类型包括但不限于酶促融合蛋白，例如β-半乳糖苷酶融合物、酵母双杂种GAL融合物、聚His融合物和Ig融合物。
所述融合多肽，尤其是聚His融合物，可能促进重组UP_11或OM_10多肽的纯化。在另一个实施方案中，所述融合蛋白是在其N末端包含异源信号序列的UP_11或OM_10多肽。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，用异源信号序列可以增加UP_11或OM_10多肽的表达和/或分泌。
最好通过标准重组DNA技术，产生UP_11或OM_10嵌合蛋白或融合蛋白。例如，按照常规技术，将编码不同蛋白序列的DNA片段符合读框地连接在一起，例如使用平端末端或交错末端用于连接，用限制酶消化以提供合适末端，适当补平粘端，使用碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接，以及用酶促连接。在另一个实施方案中，可以通过常规技术合成融合基因，所述常规技术包括自动化DNA合成仪。或者，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续基因片段之间产生互补突出端，所述互补突出端随后可以退火，再扩增，产生嵌合基因序列(参见例如Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley & Sons；1992)。此外，可以购买到已经编码融合部分(例如GST蛋白)的许多表达载体。可以将编码UP_11或OM_10的核酸克隆到这样的表达载体中，致使所述融合部分符合读框地与UP_11或OM_10多肽连接。
C.抗UP_11抗体和抗OM_10抗体在另一个实施方案中，本发明提供与UP_11和OM_10多肽有免疫应答的抗体。本发明的抗体最好是单克隆抗体。此外，所述UP_11和OM_10多肽包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQID NO11的氨基酸残基序列。在某些实施方案中，包含SEQ IDNO12-16的氨基酸序列的人OM_10多肽片段用于产生单克隆抗血清和/或多克隆抗血清。同样，包含SEQ ID NO17-21的氨基酸序列的人UP_11多肽片段用于产生单克隆血清和/或多克隆血清。抗体的制备和表征方法是本领域众所周知的(参见例如Antibodies“A LaboratoryManual，E.Howell和D.Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。在其它实施方案中，本发明提供与UP_11多核苷酸和OM_10多核苷酸有免疫应答性的抗体。
本文所用的抗体是指当所述抗体结合UP_11或OM_10多肽时，所述抗体选择性结合UP_11或OM_10多肽，而不选择性结合无关蛋白。本领域技术人员容易了解，即使一种抗体结合与UP_11或OM_10多肽的片段或结构域有同源性的蛋白，也可认为该抗体在实质上结合UP_11或OM_10多肽。
本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含特异性结合抗原(与其发生免疫应答)的抗原结合位点的分子，所述抗原例如UP_11或OM_10。免疫球蛋白分子的免疫活性片段的实例包括F(ab)片段和F(ab′)2片段，这两种片段可以通过用酶如胃蛋白酶处理抗体而产生。本发明提供结合UP_11或OM_10的多克隆抗体和单克隆抗体。本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指仅包含一个种能够与UP_11或OM_10的特定表位发生免疫应答的抗原结合位点的抗体分子群体。因此，单克隆抗体组合物一般对其与之发生免疫应答的特定UP_11或OM_10多肽表现出一种结合亲和性。
为产生抗UP_11抗体或抗OM_10抗体，使用制备多克隆抗体和单克隆抗体的标准技术，用分离的UP_11或OM_10多肽或其片段作为免疫原，产生结合UP_11或OM_10的抗体。可以使用全长UP_11或OM_10多肽，或者可以用UP_11或OM_10的抗原性肽片段作为免疫原。UP_11或OM_10多肽的抗原性片段一般包含UP_11或OM_10多肽至少8个连续氨基酸残基，如选自SEQ ID NO4、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的8个连续氨基酸残基。所述抗原性肽最好包含UP_11或OM_10多肽的至少10个氨基酸残基，更优选至少15个氨基酸残基，甚至更优选至少20个氨基酸残基，最优选至少30个氨基酸残基。用于产生抗UP_11抗体或抗OM_10抗体的优选片段是位于UP_11或OM_10多肽表面的区，如亲水性区。
通常用UP_11或OM_10免疫原免疫合适的研究对象(例如兔、山羊、小鼠或其它动物、鸡)，制备抗体。合适的免疫原性制备物可以包含例如重组表达的UP_11或OM_10多肽，或者化学合成的UP_11肽或OM_10肽。所述制备物还可以包含佐剂，例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂或者相似的免疫刺激剂。用免疫原性UP_11或OM_10制备物免疫合适研究对象，诱导多克隆抗UP_11或抗OM_10抗体反应。
如上所述，可以用UP_11或OM_10免疫原免疫合适研究对象，制备多克隆抗UP_11或抗OM_10抗体。简而言之，如下制备多克隆抗体用包含本发明多肽或多核苷酸的免疫原免疫动物，然后从免疫动物收集抗血清。可以用多种动物生产抗血清。通常，用于生产抗血清的动物是兔、大鼠、仓鼠或豚鼠。由于兔的血体积相对较大，因此兔是用于生产多克隆抗体的优选选择。
正如本领域众所周知的，给定多肽或多核苷酸可能在其免疫原性方面有所不同。因此，通常需要在本发明的免疫原(例如多肽或多核苷酸)上偶联载体。示例性的优选载体有匙孔蝛血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。也可以用其它白蛋白例如卵清蛋白、鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白作为载体。
将多肽或多核苷酸与载体多肽缀合的方法是本领域众所周知的，包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰胺胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺和bis-biazotized benzidine。
正如本领域众所周知的，可以通过应用称为佐剂的免疫应答的非特异性刺激物，增强针对特定免疫原的免疫原性。示例性的优选佐剂包括完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于生产多克隆抗体的免疫原用量尤其取决于所述免疫原的性质和用于免疫的动物。可以使用多种途径(皮下途径、肌内途径、皮内途径、静脉内途径和胃肠外途径)给予免疫原。免疫后在不同点取免疫动物的血样，监测多克隆抗体的产生。当获得所需水平的免疫原性时，可以给免疫动物放血，然后分离血清并贮存。
另一方面，本发明考虑生产与GPCR多肽发生免疫应答的抗体的方法，所述方法包括下述步骤(a)用编码UP_11或OM_10多肽的多核苷酸转染重组宿主细胞；(b)在足以表达所述多肽的条件下培养所述宿主细胞；(c)回收所述多肽；(d)制备抗所述多肽的抗体。最好用SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的多核苷酸转染所述宿主细胞。甚至更优选本发明提供按照上述方法制备的抗体。
通过使用众所周知的技术，可以容易地制备本发明的单克隆抗体，所述技术例如在美国专利第4,196,265中举例说明的技术，该专利通过引用结合到本文中。通常，技术涉及首先用所选抗原(例如本发明的多肽或多核苷酸)以足以引起免疫应答的方式免疫合适的动物。啮齿动物例如小鼠和大鼠是优选的动物。然后使来自免疫动物的脾细胞与无限增殖骨髓瘤细胞融合。当所述免疫动物是小鼠时，优选的骨髓瘤细胞是鼠NS-1骨髓瘤细胞。
在选择性培养基中培养所述融合脾/骨髓瘤细胞，从亲代细胞中选择融合的脾/骨髓瘤细胞。将融合细胞与未融合的亲代细胞的混合物分离开来，例如通过加入阻断在组织培养基中从头合成核苷酸的试剂。示例性的优选试剂是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤时，在培养基中补充次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸源。当使用重氮丝氨酸时，在培养基中补充次黄嘌呤。
所述培养产生杂交瘤群体，然后从中选择出特异性杂交瘤。概括地讲，如下选择杂交瘤在微量滴定板中通过单克隆稀释培养细胞，然后检测各个克隆上清液与抗原多肽的反应性。然后无限繁殖所选克隆，提供单克隆抗体。
下面提供产生本发明抗体的具体实例给小鼠腹膜内注射包含本发明多肽的约1-200μg抗原。通过注射所述抗原以及佐剂例如完全弗氏佐剂(免疫应答的一种非特异性刺激剂，包含灭活结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis))，刺激B淋巴细胞生长。第一次注射一段时间后(例如至少两周)，给小鼠注射第二剂与不完全弗氏佐剂混合的抗原，进行加强免疫。
第二次注射后几周，从小鼠尾取血，通过针对放射性标记抗原的免疫沉淀滴定血清。最好重复所述加强免疫和滴定过程，直到获得合适滴度。取出具有滴度最高的小鼠的脾，用注射器匀浆所述脾，获得脾淋巴细胞。来自免疫小鼠的脾一般含有约5×107至2×108个淋巴细胞。
通过各种众所周知的方法诱导实验动物体内称为骨髓瘤细胞的突变淋巴细胞生长，然后从所述动物获得所述细胞。骨髓瘤细胞缺乏核苷酸生物合成的补救途径。因为骨髓瘤细胞是肿瘤细胞，所以它们能够在组织培养物中无限繁殖，并因此被称为是无限增殖的。已经建立来自小鼠和大鼠的各种骨髓瘤培养细胞系，例如鼠NS-1骨髓瘤细胞。
在适于促进融合的条件下，将骨髓瘤细胞与来自用本发明抗原/多肽注射的小鼠或大鼠的脾的正常抗体生产细胞混合。融合条件包括例如存在聚乙二醇。所得融合细胞是杂交瘤细胞。象骨髓瘤细胞一样，杂交瘤细胞在培养物中无限生长。
在选择性培养基例如HAT培养基(次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸苷)中培养，将杂交瘤细胞与未融合骨髓瘤细胞分离开来。未融合骨髓瘤细胞缺乏从补救途径合成核苷酸所需的酶，因为具有这些酶的细胞在氨基蝶呤、氨甲蝶呤或重氮丝氨酸存在下被杀死。未融合的淋巴细胞在组织培养物中也不能生长。因此，只有成功融合的细胞(杂交瘤细胞)才能够在选择培养基中生长。
每种存活的杂交瘤细胞生产一种抗体。然后根据与本发明抗原/多肽有免疫应答性的特异性抗体的产生，对这些细胞进行筛选。通过有限稀释所述杂交瘤细胞，分离单细胞杂交瘤。多次连续稀释所述杂交瘤，在让所述稀释物生长后，测试上清液中单克隆抗体的存在。然后大量培养产生所述抗体的克隆，以生产合适量的本发明抗体。
通过使用本发明的单克隆抗体，可以将本发明的特定多肽和多核苷酸作为抗原进行识别，并因此鉴定它们。一旦鉴定出这些多肽和多核苷酸后，可以通过例如抗体亲和层析等技术分离和纯化它们。在抗体亲和层析中，单克隆抗体结合固体底物，暴露于包含所需抗原的溶液。通过与结合抗体的特异性免疫反应，从所述溶液分离所述抗原。然后容易地从底物中分离出所述多肽或多核苷酸并进行纯化。
此外，在下面参考文献中可以找到尤其适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例例如，美国专利第5,223,409号；国际申请第WO 92/18619号；国际申请第WO 91/17271号；国际申请第WO 92/20791号；国际申请第WO 92/15679号；国际申请第WO93/01288号；国际申请第WO 92/01047号；国际申请第WO 92/09690号和国际申请第WO 90/02809号。
此外，可以使用标准重组DNA技术制备的包含人类和非人类片段的重组抗UP_11抗体或抗OM_10抗体，例如嵌合抗体和人源化单克隆抗体，也在本发明的范围内。可以通过本领域已知的重组DNA技术，制备所述嵌合抗体和人源化单克隆抗体，例如使用以下文献中介绍的方法美国专利第6,054,297号；欧洲申请第EP 184,187号；第EP 171,496号；第EP 173,494号；国际申请第WO 86/01533号；美国专利第4,816,567号；以及欧洲申请第EP 125,023号。
可以通过标准技术，用抗UP_11多肽抗体或抗OM_10多肽抗体(例如单克隆抗体)分离UP_11或OM_10多肽，所述标准技术例如亲和层析或免疫沉淀。
抗UP_11多肽抗体或抗OM_10多肽抗体可以方便纯化细胞内的天然UP_11或OM_10多肽，以及宿主细胞内表达的重组产生的UP_11或OM_10多肽。此外，可以使用抗UP_11多肽抗体或OM_10多肽抗体检测UP_11或OM_10多肽(例如在细胞裂解物或细胞上清液内)，以评价UP_11或OM_10多肽表达的丰度和模式。对UP_11或OM_10多肽循环片段的检测可以用于鉴定研究对象体内的UP_11或OM_10多肽更新。抗UP_11抗体或抗OM_10抗体可以在诊断上用于监测组织内的蛋白水平，作为临床试验程序的一部分，例如用于确定给定治疗方案的功效。通过将所述抗体偶联(即物理连接)到可检测物质上，可以便利检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、P-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、dichlorotriazinylarnine fluorescein、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和acquorin，而合适放射性材料的实例包括125I、131I、15S或3H。
D.重组表达载体和宿主细胞在另一个实施方案中，本发明提供包含编码UP_11或OM_10多肽的多核苷酸的表达载体。本发明的表达载体最好包含以下多核苷酸所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9或SEQ ID NO11的氨基酸残基序列的多肽。更优选本发明的表达载体包含以下多核苷酸所述多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO的核苷酸碱基序列。甚至更优选本发明的表达载体包含有效连接增强子-启动子的多核苷酸。在某些实施方案中，本发明的表达载体包含有效连接原核启动子的多核苷酸。或者，本发明的表达载体包含有效连接增强子-启动子的多核苷酸，其中所述增强子-启动子是真核启动子，所述表达载体还包含位于羧基末端氨基酸3′以及在编码多肽的转录单位内的聚腺苷酸化信号。
本文所用的术语“载体”是指能够转运其连接的另一种核酸的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，是指可以在其中连接其它DNA区段的环状双链DNA环。另一种载体类型是病毒载体，其中可以将其它DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合到宿主细胞基因组，从而随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。所述载体在本文中称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中应用的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明还包括有等同功能的其它形式表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
原核生物中的蛋白表达最通常在大肠杆菌内进行，使用包含指导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体。融合载体在其所编码的蛋白内加入多个氨基酸，加在重组蛋白的氨基端或羧基端。所述融合载体通常有三个目的1)增加重组蛋白的表达；2)增加所述重组蛋白的溶解度；和3)通过作为亲和纯化中的配体，有助于纯化所述重组蛋白。在融合表达载体中，通常在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白酶切割位点，使得能够将所述重组蛋白与所述融合部分分离开来，随后纯化所述融合蛋白。所述酶及其关连识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。
典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson，1988)、pMAL(NeW England Biolabs，Beverly；MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，所述表达载体分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或A蛋白与靶重组蛋白融合。
在一个实施方案中，将UP_11或OM_10基因的编码序列克隆到pGEX表达载体中，产生编码融合蛋白的载体，所述融合蛋白从N末端到C末端包含GST-凝血酶切割位点-UP_11或OM_10多肽。可以使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂，通过亲和层析纯化所述融合蛋白。通过用凝血酶切割所述融合蛋白，可以回收未与GST融合的重组UP_11或OM_10多肽。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等，1988)和pET IId(Studier等，1990)。从pTrc载体的靶基因表达依赖于宿主RNA聚合酶从杂种trp-lac融合启动子开始的转录。从pETIId载体的靶基因表达依赖于共表达的病毒RNA聚合酶J7 gnl介导的从T7 gnl 0-lac融合启动予开始的转录。该病毒聚合酶由宿主株BL21(DE3)或HMS I 74(DE3)从居留原噬菌体提供，所述居留原噬菌体携带在lacUV 5启动子转录控制下的T7 gnl基因。
最大化大肠杆菌中重组蛋白表达的一个策略是在蛋白水解所述重组蛋白的能力受损的宿主细菌中表达所述蛋白。另一个策略是改变要插入表达载体的核酸的核酸序列，以便每个氨基酸的各个密码子是在大肠杆菌中偏倚利用的那些密码子。可以通过标准DNA诱变技术或合成技术，进行本发明对核酸序列的所述改变。
在另一个实施方案中，所述UP_11或OM_10多核苷酸表达载体是酵母表达载体。在酿酒酵母(S.cerivisae)中的表达载体的实例包括pYepSec I(Baldari等，1987)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982)、pJRY88(Schultz等，1987)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。
或者，可以使用例如杆状病毒表达载体，在昆虫细胞内表达UP_11多核苷酸或OM_10多核苷酸。在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白可利用的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，1983)和pVL系列(Lucklow和Summers，1989)。
在又一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体，在哺乳动物细胞内表达本发明的多核苷酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，1987)和pMT2PC(Kaufman等，1987)。当在哺乳动物细胞内使用时，所述表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。
例如，常用的启动子来自多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于既在原核细胞又在真核细胞中使用的其它合适的表达系统，参见Sambrook等，“Molecular CloningA Laboratory Manual”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989的第16章和第17章，该文献通过引用全部结合到本文中。
在另一个实施方案中，所述重组哺乳动物表达载体能够指导所述核酸优先在特定细胞类型内表达(例如用组织特异性调节元件表达所述核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等，1987)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton，1988)，尤其是T细胞受体启动子(Winoto和Baltimore，1989)和免疫球蛋白启动子(Banerji等，1983，Queen和Baltimore，1983)、神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle，1989)、胰腺特异性启动子(Edlund等，1985)和乳腺特异性启动子(例如乳清蛋白启动子；美国专利第4,873,316号和欧洲申请第EP 264,166号)。也包括发育调节的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss，1990)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman，1989)。
本发明还涉及用于体外生产UP_11或OM_10多肽以及通过基因治疗传递UP_11或OM_10多肽的改良方法。本发明包括激活内源细胞基因表达并进一步允许活化内源细胞基因扩增的方法，所述方法不需要编码UP_11或OM_10多肽的外源DNA的体外操作和转染。这些方法在以下文献中有描述PCR国际申请WO 94/12650、美国专利第5,968,502号和Harrington等，2001，所有这些文献通过引用全部结合到本文中。这些方法以及本领域技术人员认为等同的这些方法的改变形式统称为“基因激活”。
因此，在某些实施方案中，本发明涉及用于生产蛋白的转染细胞、制备所述细胞的方法、使用所述细胞体外生产蛋白的方法以及基因治疗的方法，其中所述转染细胞包括原代细胞或二代细胞(即非无限增殖化细胞)和转染的无限增殖化细胞。本发明的细胞来源于脊椎动物，具体地说来源于哺乳动物，甚至更具体地讲来源于人。用本发明方法产生的细胞含有下面的外源DNA编码治疗药物的外源DNA，本身是治疗药物的外源DNA，和/或使所述转染细胞以比相应未转染细胞更高水平表达基因或以与相应未转染细胞内存在的不同调节或诱导模式表达基因的外源DNA。
本发明还涉及转染原代细胞、二代细胞和无限增殖化细胞以包括外源遗传材料的方法，产生克隆细胞株或异源细胞株的方法，以及使用所述转染的原代细胞、二代细胞或无限增殖化细胞免疫动物或在免疫动物体内产生抗体的方法。
本发明尤其涉及在来源于脊椎动物细胞、尤其是来源于哺乳动物细胞中基因打靶或同源重组的方法。也就是说，本发明涉及以下方法通过同源重组将DNA导入源自脊椎动物的原代细胞、二代细胞或无限增殖化细胞，使得将所述DNA导入所述原代细胞、二代细胞或无限增殖化细胞基因组DNA内的预选位点。所用的打靶序列由所述外源DNA要插入的位点决定(或参考所述位点选定)。在这些方法中使用本发明提供的cDNA UP_11或OM_10序列(即SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10)。本发明还涉及用本发明方法产生的同源重组的原代细胞、二代细胞或无限增殖化细胞，称之为同源重组(HR)原代细胞、二代细胞或无限增殖化细胞，以及所述HR原代细胞、二代细胞或无限增殖化细胞的应用。
本发明还涉及激活(即启动表达)来源于脊椎动物的原代细胞、二代细胞或无限增殖化细胞内存在的UP_11或OM_10基因的方法，其中UP_11或OM_10基因通常在所述细胞中不表达，或者不象所获得细胞那样以生理显著水平表达。根据本发明，用同源重组取代调节序列所获得的细胞中与所述基因正常结合的调节区或者使所述调节区失活，所述新调节序列使所述基因以比相应非转染细胞显著更高的水平表达，或者使所述基因以与相应非转染细胞中明显不同的调节模式或诱导模式表达。因此，本发明涉及制备蛋白的方法，所述方法启动表达或激活在转染原代细胞、二代细胞或无限增殖化细胞中编码所需产物的内源基因。
在一个实施方案中，可以通过包括选择标记基因，进一步扩增所述活化基因，所述选择标记具有如下性质通过在合适选择剂存在下培养所述细胞，可以选择包含所述选择标记基因扩增拷贝的细胞。在包含扩增的所述选择标记基因的细胞中，在扩增的选择标记基因附近或与其连接的活化内源基因也得到扩增。包含许多拷贝所述活化内源基因的细胞可用于体外蛋白生产和基因治疗。
在一些实施方案中，本发明还涉及激活细胞中内源基因表达的方法，或者通过非同源重组或随机激活基因表达(RAGE)过量表达细胞中内源基因的方法。所述方法包括将载体导入细胞中，允许所述载体通过非同源重组整合到所述细胞的基因组中，然后允许细胞中内源基因的激活或者过量表达。非同源重组或“非靶向”重组的应用不需要事先对所述内源基因序列有所认识。通过非同源重组表达内源基因和制备用于非同源重组的载体构建体的方法在国际专利申请WO 99/15650和WO 00/49162中有描述，这两个专利通过引用全部结合到本文中。
在非同源重组事件中使用的载体构建体应当包含至少一个与未配对剪接供体序列有效连接的转录调节序列，以及一个或多个可扩增标记。所述转录调节序列通常是但不限于启动子序列。所述转录调节序列除启动子序列外，还可以包括增强子序列。所述转录调节序列有效连接一个翻译起始密码子、一个信号分泌序列和一个未配对剪接供体位点。所述转录调节序列可另外有效连接一个翻译起始密码子、一个附加表位和一个未配对剪接供体位点；或者有效连接一个翻译起始密码子、一个信号分泌序列、一个附加表位和一个未配对剪接供体位点；或者有效连接一个翻译起始密码子、一个信号分泌序列、一个附加表位、一个序列特异性蛋白酶位点和一个未配对剪接供体位点。
可用于上述载体的可扩增标记的实例包括但不限于二氢叶酸还原酶(DHFR)、新霉素抗性(neo)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、嘌呤霉素(pac)、腺苷脱氨酶(ada)、天冬氨酸转氨甲酰酶(ATC)、二氢乳清酸酶、D型组氨酸(his D)、多药物抗性1(mdr 1)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpy)、谷氨酰胺合成酶(GS)和氨甲酰磷酸合成酶(CAD)。所述载体还可以包括筛选标记，例如编码细胞表面蛋白、荧光蛋白和/或酶的基因。在所述“激活”载体构建体中可以包括信号分泌序列，以便分泌活化基因表达产物。
所述载体构建体的调节序列可以是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子或增强子。应用诱导型启动子将允许在常规培养和扩增期间，所述细胞产生低基础水平的活化蛋白。随后在生产或筛选期间，可以诱导所述细胞表达大量所需蛋白。可以从细胞基因组或病毒基因组分离调节序列。细胞调节序列的实例包括但不限于肌动蛋白基因、金属硫蛋白I基因、胶原蛋白基因、血清白蛋白基因和免疫球蛋白基因。病毒调节序列的实例包括但不限于来自巨细胞病毒属(Cytomegalovirus，CMV)立即早期基因、腺病毒晚期基因、SV40基因、逆转录病毒LTR和疱疹病毒属(Herpesvirus)基因的调节元件(其它组织特异性调节序列和诱导型调节序列分别参见表3和表4)。
对初级转录物的剪接，及去除内含子的过程，由分别位于内含子5′和3′的剪接供体位点和剪接受体位点指导。剪接供体位点的共有序列是(A/C)AGGURAGU(其中R代表嘌呤核苷酸)，其中位置1-3的核苷酸(A/C)AG位于外显子内，而核苷酸GURAGU位于内含子内。
未配对的剪接供体位点在本文中定义为存在于载体构建体上、没有下游剪接受体位点的剪接供体位点。当所述载体通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中时，所述未配对的剪接供体位点与内源基因的剪接受体位点配对。来自所述载体构建体的剪接供体位点和来自内源基因的剪接受体位点将一起指导所述载体供体位点和所述内源剪接受体位点之间所有序列的切除。切除这些间插序列将除去干扰所述内源蛋白翻译的序列。
启动子是DNA分子的一个区，通常位于转录起始点(即转录起始位点)前面(上游)约100个核苷酸对以内。该区通常包含位于不同基因中处于相似的相对位置的几种类型DNA序列元件。本文所用的术语“启动子”包括在本领域所指的上游启动子区、启动子区或者通用真核RNA聚合酶II转录单位的启动子。
另一种类型独立存在的转录调节序列元件是增强子。增强子为特定编码区(例如基因)提供时间、位置和表达水平特异性。增强子的主要功能是在包含结合所述增强子的一个或多个转录因子的细胞内，增加编码序列的转录水平。与启动子不同，只要启动子存在，增强子就能在与转录起始位点不同距离的地方起作用。
本文所用的词组“增强子-启动子”是指包含增强子元件和启动子元件的复合单位。增强子-启动子与编码至少一种基因产物的编码序列有效连接。本文所用的词组“有效连接”是指增强子-启动子与所述编码序列的连接方式使得编码序列的转录受到所述增强子-启动子控制和调节。将增强子-启动子有效连接到编码序列的方法是本领域众所周知的。另外，正如本领域众所周知的，增强子-启动子相对于转录受到它们控制的编码序列的精确取向和位置，尤其取决于所述增强子-启动子的具体性质。因此，TATA框最小化启动子一般位于转录起始位点上游约25个到约30个碱基对，上游启动子元件一般位于转录起始位点上游约100个到约200个碱基对。与此不同，增强子可以位于起始位点下游，并且可以距离所述位点相当远的距离。
表达载体的编码序列有效连接到转录终止区。RNA聚合酶转录编码DNA序列通过聚腺苷酸化出现的位点。通常，位于所述聚腺苷酸化位点下游几百个碱基对的DNA序列终止转录。这些DNA序列在本文中称为转录终止区。这些区是转录的信使RNA(mRNA)有效腺苷酸化所需的。转录终止区是本领域众所周知的。本发明腺病毒载体构建体中所用的优选转录-终止区包含SV40或鱼精蛋白基因的聚腺苷酸化信号。
表3.组织特异性启动子
表4.诱导型启动子
表达或过量表达目标基因的细胞可以在以下条件下进行体外培养所述条件有利于以所需量生产已经被激活或其表达已经得到增加的内源基因的表达产物。也可以在以下条件下，将包含已经整合到其基因组的载体构建体的细胞导入真核生物(例如脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人)所述条件有利于在所述真核生物体内由所述细胞激活或过量表达所述基因。在具体实施方案中，产生基因组转录文库和蛋白表达文库(Harrington等，2001)。使用上述用于非同源重组的载体构建体，通过随机激活基因表达(RAGE)产生文库。
宿主细胞可来源于任何真核生物，可以是原代细胞、二代细胞或无限增殖细胞。此外，所述细胞可以来源于生物体内的任何组织。可以分离和激活细胞的有用组织的实例包括但不限于肝、脾、肾、骨髓、胸腺、心脏、肌肉、肺、脑、睾丸、卵巢、胰岛、肠、皮肤、胆囊、前列腺、膀胱和免疫造血系统。
可以将所述载体构建体整合到原代细胞、二代细胞或无限增殖化细胞中。原代细胞是已经从脊椎动物分离并且没有经历传代的细胞。二代细胞是已经历传代但没有无限增殖化的原代细胞。无限增殖化细胞是明显可以无限传代的细胞系。无限增殖化细胞系的实例包括但不限于HT1080、HeLa、Jurkat、293细胞、KB癌、T84结肠上皮细胞系、Raji、Hep G2或Hep 3B、肝癌细胞系、A2058黑素瘤、U937淋巴瘤和WI38成纤维细胞系、体细胞杂种和杂交瘤。
因此，为通过非同源重组激活本发明的内源基因，技术人员可以产生包含一个调节序列、一个或多个可扩增标记、一个附加表位或一个分泌信号序列以及一个未配对剪接供体序列的“激活”载体构建体。然后通过本领域任何已知的转染方法，将所述激活构建体导入优选的真核宿主细胞中。将所述载体导入细胞后，允许所述DNA通过非同源重组整合到宿主细胞基因组。整合可以发生在自发断裂的染色体或人工诱导断裂(例如γ辐射、限制酶)的染色体上。所述载体整合到宿主细胞基因组后，通过同时或顺序选择位于整合载体构建体上的一个或多个可扩增标记，可以以拷贝数量扩增基因座。该方法便于分离已经扩增包含所述整合载体的基因座的细胞克隆。分离和分选包含所述活化基因的细胞，通过基于PCR的克隆分离活化内源基因(详细实验方法参见国际申请WO 99/15650，该申请通过引用全部结合到本文中)。然而，本领域普通技术人员将会认识到，可以等同地使用任何本领域已知的克隆基因的方法，从分选的细胞中分离出活化基因。
本发明的转染细胞可用于人类和动物中的多种应用(例如活体外操作)。在一个实施方案中，可以将所述细胞植入人或动物体内，用于将UP_11或OM_10多肽传递到所述人或动物。可以将UP_11或OM_10多肽系统地或局部地传递到人体内，获得治疗益处。可以使用屏障装置将细胞保留在体内的固定位置，或者保护所述细胞并使所述细胞与宿主免疫系统分离，所述屏障装置包含表达治疗性UP_11或OM_10多肽产物的转染细胞，并且治疗产物是自由渗透的。屏障装置尤其有用，允许移植转染的无限增殖化细胞、来自另一物种的转染细胞(转染的异种细胞)或者来自非组织相容性匹配供体的细胞(转染的同种异体基因细胞)，以治疗人类或动物的病症。屏障装置也允许常规的短期(即瞬时)治疗，即当治疗方案由于任何原因需要中止时，容易接近需去除的细胞。转染的异种和同种异体基因细胞也可以用于短期基因治疗，以便可以体内传递所述细胞产生的基因产物，直到细胞受到宿主免疫系统的排斥。
本发明的转染细胞也用于引发抗体产生，或者用于免疫人类和动物，使其抵抗致病生物。植入的转染细胞可以用于传递免疫抗原，所述免疫抗原导致刺激宿主细胞免疫应答和体液免疫应答。可以设计这些免疫应答，以保护宿主免受未来的传染性生物的攻击(即接种疫苗)、刺激和增加抵抗正在进行的感染的抗病能力、或者产生针对所述转染细胞体内产生的抗原的抗体，所述抗体可以用于治疗或诊断目的。可以使用可移除的屏障装置，允许终止暴露于所述抗原的简单方法。或者，可以使用最终将会被排斥的细胞(异种或同种异体基因的转染细胞)，限制接触所述抗原，因为当所述细胞受到排斥后，抗原产生将停止。
本发明的方法可用于生产那些产生UP_11或OM_10多肽产物或反义RNA的原代细胞、二代细胞或无限增殖化细胞。此外，本发明的方法可用于生产那些产生非天然存在的核酶、蛋白或核酸的细胞，所述细胞用于体外生产UP_11域OM_10治疗性产物或用于基因治疗。
本发明还提供重组表达载体，所述重组表达载体包含以反义方向克隆到所述表达载体的UP_11或OM_10多肽编码DNA分子。也就是说，所述DNA分子以一定方式有效连接调节序列，所述方式允许表达(通过转录所述DNA分子)与UP_11或OM_10 mRNA反义的RNA分子。可以选择有效连接到以反义取向克隆的核酸的如负调节序列指导所述反义RNA分子在各种细胞类型中连续表达的调节序列，如病毒启动子和/或增强子；或者指导反义RNA组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调节序列。所述反义表达载体可以为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中反义核酸处于高效调节区的控制下产生，可以根据所述载体所导入的细胞类型确定其活性。
本发明的另一方面涉及已经引入本发明重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可以互换使用。应当理解，所述术语不仅指特定的研究细胞，而且指所述细胞的后代或潜在后代。由于突变或者环境影响，某些修饰可能出现在后续世代中，因此，实际上所述后代可能与亲代细胞不相同，但仍然包括在本文所用的术语范围内。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达UP_11或OM_10多肽。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
可以通过常规转化、感染或转染技术将载体DNA导入真核细胞或原核细胞中。本文所用的术语“转化”和“转染”是指多种本领域公知的用于将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染法或电穿孔法。在Sambrook等，(“Molecular CloningA Laboratory Manual”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它实验室手册中，可以找到用于转化或转染宿主细胞的合适方法。
为稳定转染哺乳动物细胞，根据所使用的表达载体和转染技术，已知只有少部分细胞可能将外源DNA整合到它们的基因组中。为鉴定和选择这些整合子，通常将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目标基因一起导入宿主细胞中。优选的选择标记包括那些赋予药物抗性的选择标记，所述药物例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。编码选择标记的核酸可以在编码UP_11或OM_10多肽的同一载体上导入宿主细胞，或者在不同载体上导入宿主细胞。可以通过药物选择，鉴定用导入的核酸稳定转染的细胞(例如，加入选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞死亡)。
本发明的宿主细胞，如培养物中的原核宿主细胞或真核宿主细胞，可以用于生产(即表达)UP_11或OM_10多肽。因此，本发明还提供使用本发明宿主细胞生产UP_11或OM_10多肽的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(在所述细胞中导入了编码UP_11或OM_10多肽的重组表达载体)直到产生UP_11或OM_10多肽。在另一个实施方案中，所述方法还包括从培养基或宿主细胞中分离UP_11或OM_10多肽。
表达载体包含编码UP_11或OM_10多肽的多核苷酸。所述多核苷酸将包括编码UP_11或OM_10多肽的核苷酸碱基序列，所述核苷酸碱基序列足够长，能够将所述序列段与编码非UP_11多肽或非OM_10多肽的多核苷酸序列段分开。本发明的多核苷酸也可以编码具有变异体氨基酸序列的生物学上功能性多肽或肽，所述变异体氨基酸序列例如具有根据各种考虑而所选的改变，所述考虑例如互换的氨基酸的相对亲水分值。这些变异体序列是那些从天然来源的变异体序列中分离的，或者使用诱变程序如定点诱变由本文公开的序列诱导的变异体序列。
本发明的表达载体优选包括编码包含如下多核苷酸所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ IDNO11的氨基酸残基序列的多肽。表达载体可以包括UP_11或OM_10多肽编码区本身，或者上文提到的任何UP_11或OM_10多肽，或者它可以包含在所述UP_11或OM_10多肽的基本编码区具有所选改变或修饰的编码区。或者，所述载体或者片段可以编码更大的多肽或仍然包括基本编码区的多肽。在任何情况下，应当认识到，由于密码子简并性以及生物学功能等同性，本发明的这一方面不限于对应于上文提到的多肽序列的具体DNA分子。
示例性的载体包括pCMV家族的哺乳动物表达载体，包括pCMV6b和pCMV6c(Chiron Corp.，Emeryville CA.)。在某些情况下，尤其是在这些单独的哺乳动物表达载体的情况下，所得构建体可能需要与包含选择标记如pSV2neo的载体共转染。通过共转染到二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系如DG44，借助加入所述表达载体的DNA，可以检测表达UP_11或OM_10多肽的克隆。
通过本领域已知的多种技术，可以将本发明的DNA分子、基因或多核苷酸加入到载体中。例如，已经证明载体pUC18尤其有价值。同样，相关载体M13mp18和M13mp19可以用于本发明的某些实施方案中，尤其是用于进行双脱氧法测序。
本发明的表达载体用作制备一定量UP_11或OM_10多肽编码DNA本身的方法，以及用作制备所编码的多肽和肽的方法。考虑当通过重组方法制备本发明的UP_11或OM_10多肽时，技术人员可以使用原核表达载体或真核表达载体，例如穿梭系统。然而，因为原核系统通常不能正确加工前体多肽，尤其是所述系统不能正确加工膜结合真核多肽，并且由于使用本发明公开的内容可以预期真核UP_11或OM_10多肽，因此技术人员可能在真核宿主中表达所述序列。然而，甚至当所述DNA区段编码真核UP_11或OM_10多肽时，考虑原核表达可能具有某些其它应用性。因此，本发明可以与能够在真核细胞和原核细胞之间穿梭的载体结合使用。所述系统在本文中有描述，允许使用细菌宿主细胞和真核宿主细胞。
当希望表达重组UP_11多肽或重组OM_10多肽并且考虑使用真核宿主时，最值得使用加入真核生物复制起点的载体，如质粒。此外，为在真核系统中表达的目的，技术人员希望将UP_11或OM_10编码序列置于有效真核启动子的附近或控制之下，所述有效真核启动子例如与中国仓鼠卵巢细胞结合使用的启动子。为产生在启动子控制下的真核或者原核编码序列，通常需要将所述多肽适当翻译读框的翻译起始侧5′末端置于所选启动子3′或下游约1个核苷酸到约50个核苷酸之间。此外，当期望真核表达时，技术人员一般希望在包括UP_11或OM_10多肽的转录单位内加入合适聚腺苷酸化位点。
pCMV质粒是在本发明中尤其有用的一系列哺乳动物表达载体。所述载体主要设计用于基本所有的培养细胞，在SV40转化的猿COS细胞系中工作尤其出色。pCMV 1、2、3和5载体相互之间在每种质粒多接头区内的某些独特限制性位点上有所不同。pCMV 4载体与这4种质粒的不同之处是在所述多接头前的序列内包含翻译增强子。虽然功能上相似的pCMV6b和c载体并不直接来源于pCMV1-5系列载体，但可以从Chiron Corp.(Emeryville，CA)获得pCMV6b和c载体，所述载体相互之间相同，只是所述多接头区的取向相反。
所述pCMV质粒的通用组成如下。载体骨架是pTZ18R(Pharmacia)，包含一个用于产生单链DNA的噬菌体f1复制起点以及一个氨苄青霉素抗性基因。所述CMV区由人巨细胞病毒(Towne株)主要立即早期基因强启动子调节区的核苷酸-760到+3组成。人生长激素片段(hGH)包含代表该基因序列1533到2157的转录终止信号和聚腺苷酸化信号。该片段中有一个Alu中等重复DNA序列。最后，SV40复制起点和早期区启动子-增强子来源于其中描述的pcD-X质粒(HindII到PstI片段)。该片段中启动子的取向使转录从CMV/hGH表达盒开始进行。
所述pCMV质粒相互之间的区别在于所述多接头区内的差异以及所述翻译增强子存在与否。开始的pCMV1质粒已经受到累积的修饰，在所述多接头区内赋予数量增加的单一限制性位点。为创建pCMV2，破环pCMV1两个EcoRI位点中的一个。为创建pCMV3，通过缺失从所述SV40区开始的短区段(StuI到EcoRI)，修饰pCMV1，如此使得所述多接头内的PstI、SalI和BamHI位点成为单一位点。为创建pCMV4，加入对应于从CMV启动子转录的mRNA 5′非翻译区的DNA合成片段。通过降低多肽合成中对起始因子的要求，所述序列作为翻译增强子起作用。为创建pCMV5，从pCMV1的SV40原点区缺失DNA区段(HpaI到EcoRI)，使得所述起始多接头内的所有位点成为单一位点。
已经在猿COS细胞、小鼠L细胞、CHO细胞和HeLa细胞中成功地表达了pCMV载体。在几个并排比较中，它们在CHO细胞中的表达水平比基于SV40的载体高4到9倍。已经使用所述pCMV载体表达LDL受体、核因子1、GSα多肽、多肽磷酸酶、小突触小泡蛋白、突触蛋白、胰岛素受体、流感血凝素、雄激素受体、固醇26-羟化酶、类固醇17-羟化酶和类固醇21-羟化酶、细胞色素P-450氧化还原酶、β-肾上腺素能受体、叶酸受体、胆固醇侧链切割酶和其它cDNA的宿主。应当注意到，可以使用这些质粒中的SV40启动子表达其它基因，例如显性选择标记。最后，在pCMU的HindIII位点和PstI位点之间的多接头内有ATG序列，可能引起假的翻译起始。如果可能，在表达质粒中应当避免该密码子。
在又一个实施方案中，本发明提供用编码UP_11或OM_10多肽的多核苷酸转化、感染或转染的重组宿主细胞，以及来自这些转化或转染细胞的转基因细胞。最好用SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10的多核苷酸转染本发明的重组宿主细胞。用外源多核苷酸如DNA分子转化或转染细胞的方法是本领域众所周知的，包括例如以下技术磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导的转染、直接显微注射和腺病毒感染(Sambrook等，1989)。
最广泛使用的方法是由磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染。虽然机制仍然不清楚，但相信转染DNA通过胞吞作用进入细胞胞质，然后被转运到细胞核内。根据细胞类型，在任何一个时间可以转染超过90％的培养细胞群体。因为由磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染的高效率，所述方法是需要外源DNA在大量细胞内瞬时表达实验的可选方法。磷酸钙介导的转染也用于建立整合多个拷贝外源DNA的细胞系，所述多个拷贝外源基因通常以头尾相连的串联排列排列在宿主细胞基因组上。
在原生质体融合方法中，将来自携带大量目标质粒拷贝的细菌的原生质体直接与培养的哺乳动物细胞混合。细胞膜融合后(通常借助聚乙二醇)，将所述细菌的内容物传递到所述哺乳动物细胞质，然后将所述质粒DNA转运到细胞核内。对于转染，原生质体融合并不如通常用于瞬时表达测定的许多细胞系那样有效，但该方法可用于其中DNA胞吞作用无效率的细胞系。原生质体融合通常产生串联整合到宿主染色体的多拷贝质粒DNA。
将短暂的高电压电脉冲应用于多种哺乳动物细胞和植物细胞导致质膜上形成纳米大小的孔。DNA或者通过这些孔，或者作为伴随所述孔关闭的膜成分重新分配的结果，被直接摄入细胞胞质内。电穿孔非常有效，可以用于克隆基因的瞬时表达，以及用于建立携带整合的多个拷贝目标基因的细胞系。电穿孔与磷酸钙介导的转染和原生质体融合不同，经常产生携带一个或至少几个整合的外源DNA拷贝的细胞系。
脂质体转染涉及将DNA和RNA封装入脂质体内，然后使所述脂质体与细胞膜融合。DNA如何被传递到细胞的机制还不清楚，但转染效率可以高达90％。
将DNA分子直接显微注射到核的好处是DNA不暴露于细胞区室如低pH内体。因此，显微注射主要用作建立携带整合的多个拷贝目标基因的细胞系。
应用腺病毒作为载体进行细胞转染是本领域众所周知的。已经报道针对各种细胞的腺病毒载体介导的细胞转染。
转染细胞可以是原核细胞或真核细胞。本发明的宿主细胞最好是真核宿主细胞。本发明的重组宿主细胞可以是COS-1细胞。如果需要生产人UP_11或OM_10多肽，培养的哺乳动物细胞或人类细胞尤其有用。
另一方面，本发明的重组宿主细胞是原核宿主细胞。本发明的重组宿主细胞最好是大肠杆菌DH5α株的细菌细胞。一般而言，原核细胞优选用于起始克隆本发明中使用的DNA序列，以及构建本发明中使用的载体。例如，大肠杆菌K12株可能尤其有用。其它可以应用的微生物菌株包括大肠杆菌B和大肠杆菌x1976(ATCC第31537号)。当然，这些实例是说明性的，而不是限制性的。
原核细胞可以应用于表达。可以使用上文提到的菌株，以及大肠杆菌W3110(ATCC第273325号)、芽孢杆菌(bacilli)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其它肠细胞科如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)以及各种假单胞菌。
一般而言，包含来自与宿主细胞匹配的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主一起使用。所述载体一般携带一个复制位点以及能够提供对转化细胞进行表型选择的标记序列。例如，可以使用来自大肠杆菌的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，因此提供鉴定转化细胞的容易方法。所述pBR质粒或者其它微生物质粒或噬菌体也必须含有或者经修饰后含有用于表达其本身多肽的微生物能够使用的启动子。
在重组DNA构建中最通常使用的那些启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统以及色氨酸(TRP)启动子系统(欧洲申请第EP 0036776号)。虽然这些是最通常使用的启动子，但已经发现和利用其它微生物启动子，并且已经公开关于它们核苷酸序列的细节，这使得技术人员能够将功能性启动子导入质粒载体中。
除原核生物外，也可以使用真核微生物如酵母。真核微生物中最通常使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiase)或普通的面包酵母，虽然可以容易得到多种其它菌株。为在酵母属(Saccharomyces)中表达，通常使用例如质粒YRp7。该质粒已经包含trpI基因，该基因为不能在色氨酸存在下生长的酵母突变株提供选择标记，所述酵母突变株例如ATCC第44076号或PEP4-1。然后，通过在不存在色氨酸的情况下生长，作为酵母宿主细胞基因组特征存在的trpI损害提供检测转化的有效环境。
酵母载体中合适的启动子序列包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，所述其它糖酵解酶例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。在构建合适表达质粒时，也将与这些基因结合的终止序列导入所述表达载体内需要表达的序列的下游，提供mRNA的聚腺苷酸化和终止。提供由生长条件控制转录的额外好处的其它启动子是下列酶的启动子区乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、上文提到的甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。包含与酵母匹配的启动子、起点或复制和终止序列的任何质粒载体是合适的。
除微生物外，也可以用来自多细胞生物的细胞的培养物作为宿主。原则上，任何所述细胞培养物都是可使用的，不论所述细胞培养物是来自脊椎动物细胞培养物还是来自无脊椎动物细胞培养物。然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞，近些年来，繁殖培养物(组织培养物)中的脊椎动物细胞已经成为常规操作。所述有用宿主细胞系的实例是AtT-20、VERO细胞和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系以及W138细胞系、BHK细胞系、COSM6细胞系、COS-7细胞系、293细胞系和MDCK细胞系。用于所述细胞的表达载体一般包括(如果需要)复制起点、位于需要表达的基因上游的启动子、以及任何需要的核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。
为在哺乳动物细胞中应用，所述表达载体上的控制功能常常来自病毒材料。例如，通常使用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒以及最频繁使用猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子尤其有用，因为可以容易地从所述病毒获得还包含SV40病毒复制起点的片段的这两种启动子。也可以使用更小或更大的SV40片段，只要其中包括从HindIII位点向病毒复制起点内BglI位点延伸的约250bp序列。此外，技术人员常常希望并且有可能利用通常与所需基因序列连接的启动子或控制序列，只要所述控制序列与所述宿主细胞系统匹配即可。
通过构建所述载体使其包括外源起点，可以提供复制起点，所述外源起点例如可以来自SV40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV、CMV)来源，或者可以由宿主细胞染色体复制机制提供。假如所述载体整合到宿主细胞染色体，那么后一种方式常常就足够了。
在又一个实施方案中，本发明考虑制备UP_11或OM_10多肽的工艺或方法，所述工艺或方法包括用编码UP_11或OM_10多肽的多核苷酸转染细胞，产生转化的宿主细胞；然后在足以表达所述多肽的生物学条件下维持所述转化细胞。所述转化宿主细胞优选是真核细胞。或者，所述宿主细胞是原核细胞。更优选所述原核细胞是大肠杆菌DH5α株细菌细胞。甚至更优选转染到所述转化细胞的多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的核酸序列。此外，使用上文公开的表达载体完成转染。
在所述工艺中使用的宿主细胞能够表达功能性重组UP_11或OM_10多肽。优选的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。然而，各种细胞适用于本发明的工艺，例如酵母细胞、人类细胞系和其它本领域技术人员众所周知的真核细胞系。
转染后，所述细胞在足以表达UP_11或OM_10受体多肽的培养条件下维持一段时间。培养条件是本领域众所周知的，包括离子组成和浓度、温度、pH等。通常，在培养基内的培养条件下维持转染细胞。各种细胞类型合适的培养基是本领域众所周知的。在一个优选实施方案中，温度为约20℃到约50℃，更优选约30℃到约40℃，甚至更优选约37℃。
pH值优选为约6.0到约8.0，更优选约6.8到约7.8，最优选约7.4。重量摩尔渗透压浓度优选为约200微摩尔每升(mosm/L)到约400mosm/L，更优选从约290mosm/L到约310mosm/L。转染和表达编码蛋白所需的其它生物学条件是本领域众所周知的。
维持转染细胞达到足以表达UP_11或OM_10多肽的一段时间。合适的时间尤其依赖于所使用的细胞类型，并且可以容易地由技术人员确定。通常维持时间为约2天到约14天。
从转染细胞或培养所述细胞的培养基中回收或收集重组UP_11或OM_10多肽。回收包括分离和纯化所述UP_11或OM_10多肽。多肽的分离和纯化技术是本领域众所周知的，包括例如沉淀、过滤、层析、电泳等程序。
E.转基因动物在某些实施方案中，本发明涉及具有体细胞和生殖细胞的非人类动物，所述体细胞和生殖细胞具有功能被破环的至少一个、更优选两个本发明内源G-多肽偶联受体(GPCR)等位基因。因此，本发明提供具有突变型UP_11或OM_10基因并因此缺乏UP_11或OM_10活性的活动物。对于在野生型对照动物中产生正常量UP_11或OM_10的刺激，这些动物会产生数量显著降低的UP_11或OM_10。本发明的动物可用于例如作为评价UP_11或OM_10抑制剂的标准对照，或者作为正常人UP_11或OM_10基因的受体，由此创建用于体内筛选人UP_11或OM_10抑制剂的模型系统，以及用于鉴定UP_11或OM_10抑制剂治疗的疾病状态。所述动物也用作研究配体对UP_11或OM_10多肽的影响的对照。
在本发明的转基因非人类动物中，最好通过内源等位基因以及导入所述动物胚胎干细胞前体内的突变UP_11或OM_10多核苷酸或其部分之间的同源重组，破环UP_11或OM_10基因。然后允许所述胚胎干细胞前体发育，产生UP_11或OM_10基因功能被破环的动物。本文所用的术语“转基因动物”是非人类动物，优选哺乳动物，更优选啮齿动物如大鼠或小鼠，其中所述动物的一个或多个细胞包括转基因。转基因动物的其它实例包括非人类灵长类动物、绵羊、狗、母牛、山羊、鸡、两栖动物等。所述动物可以具有一个功能被破环的UP_11或OM_10等位基因(即所述动物可能对于所述突变是杂合的)，或更优选所述动物具有功能都被破环的UP_11或OM_10等位基因(即所述动物对于所述突变是纯合的)。
在本发明的一个实施方案中，功能被破环的UP_11或OM_10等位基因产生这样的动物与非突变动物相比，所述动物的细胞中基本上不存在UP_11或OM_10基因表达产物。在另一个实施方案中，可以破环所述UP_11或OM_10等位基因，以便在所述动物的细胞中产生改变的(即突变的)UP_11或OM_10基因产物。本发明优选的UP_11或OM_10基因功能被破环的非人类动物是小鼠。假设本发明纯合动物中UP_11或OM_10功能基本上完全失活，本发明杂合动物中UP_11或OM_10功能受到约50％抑制，那么用这些动物作为阳性对照，评价UP_11或OM_10抑制剂的有效性。例如，在需要测试的UP_11或OM_10抑制剂的存在下，给予野生型动物(即具有未突变UP_11或OM_10基因的动物)正常诱导UP_11或OM_10产生或活性的刺激，然后可以测量所述动物体内UP_11或OM_10的产生或活性。然后可以将所述野生型动物中的UP_11或OM_10反应与同样给予UP_11或OM_10刺激的本发明杂合动物和纯合动物中的UP_11或OM_10反应进行比较，确定所述试验抑制剂最大UP_11或OM_10抑制的百分率。
此外，本发明的动物用于确定具体疾病状况是否涉及UP_11或OM_10的作用，以及是否因此能够用UP_11或OM_10抑制剂进行治疗。例如，可以尝试在UP_11或OM_10基因功能被破环的本发明动物体内诱导疾病状态。然后可以确定所述动物对于所述疾病状况的易感性或抗性。根据本发明动物对疾病状况的抗性，可以鉴定能够用UP_11或OM_10抑制剂治疗的疾病状况。本发明的另一方面涉及转基因非人类动物，所述转基因非人类动物具有功能被破环的内源UP_11或OM_10基因，但在其基因组中也携带和表达编码异源UP_11或OM_10的转基因(即来自另一物种的GPCR)。所述动物最好是小鼠，所述异源UP_11或OM_10是人UP_11或OM_10(例如SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO8)。已经用人UP_11或OM_10重新构建的本发明的动物可以用于鉴定体内抑制人UP_11或OM_10的试剂。例如，在需要测试的试剂存在或不存在的情况下，可以给予所述动物诱导UP_11或OM_10产生和/或活性的刺激，然后测量所述动物体内的UP_11和OM_10反应。根据以下标准鉴定体内抑制人UP_11或OM_10的试剂与所述试剂不存在时的UP_11或OM_10反应相比，在所述试剂存在时UP_11或OM_10反应降低。本文所用的“转基因”是整合到细胞(由所述细胞发育成转基因动物)基因组的外源DNA，并且所述外源DNA保留在成熟动物的基因组中，由此指导所述转基因动物体内一种或多种细胞类型或组织中所编码的基因产物表达。
本发明的再一方面涉及用于破环宿主细胞内UP_11或OM_10基因功能的多核苷酸构建体。所述核酸构建体包含a)非同源取代部分；b)位于所述非同源取代部分上游的第一个同源区，所述第一个同源区具有与第一个UP_11或OM_10基因序列有基本同一性的核苷酸序列；和c)位于所述非同源取代部分下游的第二个同源区，所述第二个同源区具有与第二个UP_11或OM_10基因序列有基本同一性的核苷酸序列，所述第二个UP_11或OM_10基因序列占据在天然存在的内源UP_11或OM_10基因内所述第一个UP_11或OM_10基因序列下游的位置。此外，所述第一个和第二个同源区足够长，使得当将核酸构建体导入宿主细胞时，在所述核酸分子和宿主细胞中内源UP_11或OM_10基因之间能够发生同源重组。本文所用的“同源重组动物”是非人类动物，优选哺乳动物，更优选小鼠，其中内源UP_11或OM_10基因已经通过所述内源基因与外源DNA分子之间的同源重组而被改变，所述外源DNA分子在所述动物发育之前导入动物细胞，例如动物胚胎细胞。
在一个优选实施方案中，所述非同源取代部分包含一个阳性选择表达盒，最好包括与调节元件有效连接的新霉素磷酸转移酶基因。在另一个优选实施方案中，所述核酸构建体也包括在同源区上游或下游末端的负选择表达盒。优选的负选择表达盒包括有效连接调节元件的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。本发明的另一方面涉及其中掺入了本发明核酸构建体的重组载体。
本发明的再一方面涉及宿主细胞，其中已经在所述宿主细胞中导入了本发明核酸构建体，由此允许所述核酸构建体与宿主细胞内源UP_11或OM_10基因之间的同源重组，导致内源UP_11或OM_10基因的功能被破环。所述宿主细胞可以是正常表达UP_11或OM_10的哺乳动物细胞例如人神经元，或者是多能细胞例如小鼠胚胎干细胞。所述核酸构建体已经导入其中并且与内源UP_11或OM_10基因同源重组的胚胎干细胞进一步发育，产生转基因非人类动物，所述动物具有源自所述胚胎干细胞并因此在它们的基因组中携带UP_11或OM_10基因被破环的细胞。可以选择在其种系中携带UP_11或OM_10基因被破环的动物，然后繁育所述动物，产生在所有体细胞和生殖细胞中都具有UP_11或OM_10基因被破环的动物。然后繁育所述小鼠至UP_11或OM_10基因被破坏的纯合性。
考虑在一些情况下，可以通过稳定导入本文所述的一种或多种天然、合成修饰或突变的UP_11或OM_10多核苷酸组合物，改变本发明转基因动物的基因组。本文所用的“转基因动物”指任何动物，优选非人类哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、松鼠、仓鼠、兔、豚鼠、猪、微型猪(micro-pig)、prairie、狒狒、松鼠猴和黑猩猩等)、鸟或两栖动物，其体内的一种或多种细胞包含由于人类的干预而导入的异源核酸，所述人类干预例如本领域众所周知的转基因技术。借助精细遗传操作，例如显微注射或重组病毒感染，通过将所述核酸导入所述细胞的前体，直接或间接地将所述核酸导入所述细胞。术语遗传操作不包括经典杂交育种或体外受精，而是指引入重组DNA分子。可以将该分子整合到染色体内，或者该分子可以是在染色体外复制的DNA。
可以如下产生本发明的转基因动物例如通过显微注射、逆转录病毒感染，将UP_11或OM_10多肽编码核酸导入受精卵母细胞的雄性原核内，然后允许所述卵母细胞发育成为假孕的雌性代孕动物。可以将SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO8的人UP_11或OM_10多核苷酸序列作为转基因导入非人类动物的基因组。
此外，根据与人UP_11或OM_10多核苷酸(上文所述)的杂交，可以分离人UP_11或OM_10基因的非人类同源物，例如小鼠UP_11或OM_10基因，并用所述同源物作为转基因。在所述转基因中也可以包括内含子序列和聚腺苷酸化信号，增加所述转基因表达的效率。可以将组织特异性调节序列有效连接到UP_11或OM_10转基因，指导UP_11或OM_10多肽在特定细胞内的表达。通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物(尤其是例如小鼠等动物)的方法已经是本发明内的常规方法，在例如美国专利第4,736,866号、第4,870,009号和第4,873,191号以及Hogan，1986中有描述。使用同样的方法产生其它转基因动物。根据基因组中UP_11或OM_10转基因的存在和/或UP_11或OM_10mRNA在动物组织或细胞中的表达，可以鉴定出转基因建立者动物。然后使用转基因建立者动物繁育携带所述转基因的其它动物。此外，携带编码UP_11或OM_10多肽的转基因的转基因动物可以进一步繁育成为携带其它转基因的其它转基因动物。
为产生同源重组动物，制备包含UP_11或OM_10基因至少一个片段的载体，所述片段中已经引入缺失、添加或取代，由此改变(例如功能被破环)所述UP_11或OM_10基因。所述UP_11或OM_10基因可以是人类基因(例如来自从人类基因组文库分离的人类基因组克隆，如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或SEQ ID NO8)，但更优选是人GPCR基因的非人类同源物(例如SEQ ID NO5、SEQ IDNO6或SEQ ID NO10的鼠多核苷酸)。所述小鼠UP_11或OM_10基因可以用于构建适于改变小鼠基因组中内源UP_11或OM_10基因的同源重组载体。在一个优选实施方案中，设计所述载体，以便当发生同源重组时，所述内源UP_11或OM_10基因功能被破环(即不再编码功能性蛋白；也称为“剔除(knock out)”载体)。
或者，可以设计所述载体，以便当发生同源重组时，所述内源UP_11或OM_10基因发生突变，或者以其它方式被改变，但仍然编码功能性蛋白(例如可以改变上游调节区，由此改变内源UP_11或OM_10多肽的表达)。在同源重组载体中，所述UP_11或OM_10基因被改变的片段在其5′和3′末端两侧是UP_11或OM_10基因的其它核酸(例如SEQ ID NO1侧翼的非编码序列是5′核苷酸1-297和3′核苷酸1,654-3,824，SEQ ID NO2的非编码序列是3′核苷酸1,314-3,456，SEQ ID NO3的非编码序列是5′核苷酸1-670和3′核苷酸2,027-3,779)，以允许所述载体携带的外源UP_11或OM_10基因与胚胎干细胞的内源UP_11或OM_10基因之间发生同源重组。其它侧翼的UP_11或OM_10核酸具有足够长度，使得能够与内源基因之间成功地进行同源重组。
所述载体内一般包括数千碱基的侧翼DNA(在5′末端和3′末端)(参见例如Thomas和Capecchi，1987，有关同源重组载体的介绍)。将所述载体导入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，然后选择其中导入的UP_11或OM_10基因与内源UP_11或OM_10基因之间发生同源重组的细胞(参见例如Li等，1992)。然后将所选细胞注射到动物(例如小鼠)胚泡，形成聚集嵌合体(参见例如Bradley，1987，第113-152页)。然后可以将嵌合胚胎植入合适的假孕雌性代孕动物体内，繁育所述胚胎至产期。可以使用在生殖细胞中携带同源重组的DNA的后代，通过所述转基因的种系传递，繁育其中所有细胞都包含所述同源重组DNA的动物。构建同源重组载体和同源重组动物的方法进一步在Bradley，1991和国际申请第WO 90/11354号、第WO 91/01140号、第WO 92/0968号和第WO 93/04169号中有描述。
在又一个实施方案中，可以产生非人类转基因动物，所述转基因动物包含允许所述转基因表达受到调节的所选系统。所述系统的一个实例是噬菌体PL的cre/loxP重组酶系统。有关所述cre/loxP重组酶系统的介绍，参见例如Lakso等，1992。重组酶系统的另一个实例是酿酒酵母的FLP重组酶系统(O’Gonnan等，1991)。假如使用cre/loxP重组酶系统调节所述转基因的表达，那么需要包含编码Cre重组酶以及所选蛋白的转基因的动物。可以通过构建“双”转基因动物提供所述动物，例如通过使两种转基因动物交配，其中一种动物携带编码所选蛋白的转基因，而另一种动物携带编码重组酶的转基因。
也可以根据Wilmut等，1997和国际申请第WO 97/07668号和第WO 97/07669号中描述的方法，产生本文描述的非人类转基因动物的克隆。概括地讲，可以分离来自转基因动物的细胞如体细胞，诱导其离开生长循环，进入G0期。然后例如通过使用电脉冲，使所述休眠细胞与去核卵母细胞融合，所述去核卵母细胞来自分离所述休眠细胞的同一物种的动物。然后培养所述重新构建的卵母细胞，以便其发育成为桑椹胚或胚泡，然后转移到假孕的雌性代孕动物体内。该雌性假孕动物生出的后代将是分离所述细胞(例如体细胞)的动物的克隆。
F.本发明的应用和方法本文描述的核酸分子、多肽、多肽同源物、调节剂和抗体可以用于但不限于一种或多种以下方法a)药物筛选测定；b)诊断分析，尤其是疾病鉴定、等位基因筛选和药物遗传学检测中的诊断分析；c)治疗方法；d)药物基因组学(pharmacogenomics)；和e)监测临床试验期间的效应。本发明的UP_11或OM_10多肽可以作为药物靶，开发调节UP_11或OM_10多肽活性的药物。本发明的分离核酸分子可以用于表达UP_11或OM_10多肽(例如通过宿主细胞内或基因治疗应用中的重组表达载体)、检测UP_11或OM_10mRNA(例如在生物学样品中)或UP_11或OM_10基因中的天然存在的或重组产生的遗传突变、以及调节UP_11或OM_10多肽活性，如下文进一步描述。此外，所述UP_11或OM_10多肽可以用于筛选调节UP_11或OM_10多肽活性的药物或化合物。此外，本发明的抗UP_11或OM_10抗体可以用于检测和分离UP_11或OM_10多肽，尤其是生物学样品中存在的UP_11或OM_10多肽片段，以及用于调节UP_11或OM_10多肽活性。
药物筛选测定本发明提供鉴定化合物或药剂的方法，所述化合物或药剂能够用于治疗特征在于(或涉及)UP_11或OM_10核酸不正常或异常表达和/或UP_11或OM_10多肽不正常或异常活性的疾病。这些方法在本文中也称为药物筛选测定，通常包括下述步骤筛选候选/试验化合物或药剂，鉴定属于UP_11或OM_10多肽激动剂或拮抗剂的化合物，尤其是筛选与UP_11或OM_10多肽相互作用(例如结合)的能力、调节UP_11或OM_10多肽与靶分子相互作用的能力和/或调节UP_11或OM_10核酸表达和/或UP_11或OM_10多肽活性的能力。
可以使用具有一种或多种这些能力的候选/试验化合物或药剂作为药物，治疗特征在于UP_11或OM_10核酸不正常或异常表达和/或UP_11或OM_10多肽不正常或异常活性的疾病。候选/试验化合物包括例如1)肽，例如可溶性肽，包括Ig尾融合肽，随机肽文库成员，以及由D-构型和/或L-构型氨基酸组成的组合化学产生的分子文库成员；2)磷酸肽(例如随机和部分简并的定向磷酸肽文库成员，参见例如Songyang等，1993)；3)抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体和单链抗体以及Fab、F(ab’)2、Fab表达文库片段，以及抗体的表位结合片段)；和4)有机小分子和无机小分子(例如从组合文库和天然产物文库获得的分子)。
在一个实施方案中，本发明提供筛选与UP_11或OM_10多肽相互作用(例如结合)的候选/试验化合物的测定。通常，所述测定是基于重组细胞的测定或无细胞测定，包括下述步骤例如，在允许候选/试验化合物与UP_11或OM_10多肽或其片段相互作用(例如结合)而形成复合物的条件下，使表达UP_11或OM_10多肽或其生物活性片段的细胞或者分离的UP_11或OM_10多肽与所述候选/试验化合物混合，然后检测复合物的形成，其中所述候选化合物与所述UP_11或OM_10多肽或其片段相互作用(例如结合)的能力，说明在所述复合物中存在所述候选化合物。使用竞争性结合测定，可以检测所述UP_11或OM_10多肽和所述候选化合物之间复合物的形成，并且可以使用例如标准免疫测定定量复合物的形成。
在另一个实施方案中，本发明提供筛选测定，所述筛选测定鉴定调节(例如刺激或抑制)UP_11或OM_10多肽和通常与所述UP_11或OM_10多肽相互作用(很有可能还调节UP_11或OM_10多肽活性)的分子(靶分子)之间相互作用的候选/测试化合物。所述靶分子的实例包括与UP_11或OM_10多肽在同样信号途径中的蛋白，例如在认知功能信号途径或涉及UP_11或OM_10多肽活性的途径中UP_11或OM_10多肽上游(包括活性的刺激剂和抑制剂)或下游起作用的蛋白，例如G蛋白或涉及cAMP或磷脂酰肌醇更新和/或腺苷酸环化酶或磷脂酶C激活的其它相互作用物(interactor)。通常，所述测定是基于重组细胞的测定，包括下述步骤将表达UP_11或OM_10多肽或其生物活性片段的细胞、UP_11或OM_10多肽靶分子(例如UP_11或OM_10配体)以及候选/试验化合物在不同条件下混合在一起，其中当不存在所述候选化合物时，UP_11或OM_10多肽或其生物活性片段与所述靶分子相互作用(例如结合)；然后检测包括UP_11或OM_10多肽和所述靶分子的复合物形成，或者检测UP_11或OM_10多肽与所述靶分子之间的相互作用/反应。
对复合物形成的检测可以包括通过例如测量UP_11或OM_10多肽的诱导效应来直接定量所述复合物。在候选化合物存在下(相对于在不存在候选化合物进行检测时)，UP_11或OM_10多肽与所述靶分子之间相互作用(例如UP_11或OM_10多肽与所述靶分子之间形成复合物)在统计学上的显著改变，如降低，说明UP_11或OM_10多肽与所述靶分子之间相互作用的调节(例如刺激或抑制)。可以使用例如免疫测定，定量UP_11或OM_10多肽与所述靶分子之间复合物形成的调节。
为进行无细胞药物筛选测定，最好固定化UP_11或OM_10多肽或其靶分子，以利于将复合物与所述一种或两种蛋白未形成复合物的形式分离，以及方便所述测定的自动化。在候选化合物存在或不存在的情况下，UP_11或OM_10多肽与靶分子的相互作用(例如结合)可以在任何适于盛装所述反应物的容器内完成。所述容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供融合蛋白，所述融合物中添加了允许所述蛋白结合到基质上的结构域。例如，可以将谷胱甘肽-S-转移酶/UP_11或OM_10融合蛋白吸收到谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)上或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后与细胞裂解物(例如用35S标记的裂解物)和所述候选化合物结合，所述混合物在有利于形成复合物的条件(例如盐和pH是生理条件)下温育。温育后，洗涤所述珠，除去任何未结合的标记，然后固定化基质，直接测定放射性标记，或者解离所述复合物后测定上清液中的放射性标记。或者，可以从基质上解离所述复合物，通过SDS-PAGE分离，使用标准电泳技术，根据凝胶定量珠组份内发现的UP_11或OM_10结合蛋白水平。
在本发明的药物筛选测定中也可以使用将蛋白固定在基质上的其它技术。例如，利用生物素和链霉抗生物素的缀合，可以固定化UP_11或OM_10多肽或其靶分子。使用本领域众所周知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，可以从生物素NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化UP_11或OM_10多肽分子，然后固定化到链霉抗生物素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔内。或者，可以将与UP_11或OM_10多肽反应但并不干扰所述蛋白与其靶分子结合的抗体衍生化到所述板的孔内，然后通过抗体缀合，将UP_11或OM_10多肽捕获到所述孔内。如上所述，在所述板上表现出UP_11或OM_10多肽的孔内温育UP_11或OM_10结合蛋白和候选化合物的制备物，然后可以定量在所述孔内捕获的复合物的量。除上文针对GST固定化复合物叙述的那些方法外，检测所述复合物的方法包括使用抗体免疫检测复合物，所述抗体与所述UP_11或OM_10多肽靶分子反应，或者与UP_11或OM_10多肽反应而与所述靶分子竞争；所述方法还包括酶联测定，所述测定依赖于检测与靶分子结合的酶活性。
在又一个实施方案中，本发明提供鉴定能够用于治疗疾病的化合物的方法(例如筛选测定)，所述疾病的特征在于不正常或异常的UP_11或OM_10核酸表达或UP_11或OM_10多肽活性，或者与不正常或异常的UP_11或OM_10核酸表达或UP_11或OM_10多肽活性有关。该方法一般包括下述步骤测定所述化合物或药剂调节UP_11或OM_10核酸表达或UP_11或OM_10多肽活性的能力，由此鉴定用于治疗特征在于不正常或异常的UP_11或OM_10核酸表达或UP_11或OM_10多肽活性的疾病的化合物。测定所述化合物或药剂调节UP_11或OM_10核酸表达或UP_11或OM_10多肽活性的能力的方法通常是基于细胞的测定。例如，对于通过涉及UP_11或OM_10多肽的途径转导信号的配体，可以在候选化合物存在或不存在的情况下，诱导对所述配体敏感的细胞过量表达UP_11或OM_10多肽。
可以鉴定产生依赖于UP_11或OM_10多肽的反应(刺激或抑制)在统计学上显著改变的候选化合物。在一个实施方案中，UP_11或OM_10核酸的表达或者UP_11或OM_10多肽活性在细胞内受到调节，然后测量候选化合物对于目标读出(例如cAMP或磷脂酰肌醇更新)的影响。例如可以测定响应依赖于UP_11或OM_10多肽的信号级联反应而受到正调节或负调节的基因表达。在优选实施方案中，所述基因的调节区(例如5′侧翼启动子和增强子区)有效连接编码可容易检测的基因产物的检测标记(例如萤光素酶)。也可以通过例如免疫印迹法，测定UP_11或OM_10多肽或UP_11或OM_10多肽靶分子的磷酸化。
或者，可以利用下述方法鉴定UP_11或OM_10基因表达调节剂(例如可以用于治疗特征在于不正常或异常UP_11或OM_10核酸表达或UP_11或OM_10多肽活性的疾病的化合物)在所述方法中，使细胞与候选化合物接触，然后测定所述细胞中UP_11或OM_10mRNA或蛋白的表达。将所述候选化合物存在下UP_11或OM_10mRNA或蛋白的表达水平与所述候选化合物不存在的情况下UP_11或OM_10mRNA或蛋白表达水平进行比较。然后根据该比较，可以鉴定作为UP_11或OM_10核酸表达调节剂的候选化合物，所述候选化合物可以用于治疗特征在于不正常UP_11或OM_10核酸表达的疾病。例如，当UP_11或OM_10mRNA或蛋白的表达在所述候选化合物存在的情况下比所述候选化合物不存在的情况下更高(统计学上显著更高)，那么将所述候选化合物鉴定为UP_11或OM_10核酸表达的刺激物。或者，当UP_11或OM_10核酸表达在所述候选化合物存在的情况下比所述候选化合物不存在的情况下更低(在统计学上显著更低)，那么将所述候选化合物鉴定为UP_11或OM_10核酸表达的抑制剂。通过本文所述用于检测UP_11或OM_10mRNA或蛋白的方法，可以测定细胞内的UP_11或OM_10核酸表达水平。
在本发明的某些方面，UP_11或OM_10多肽或其部分可以在双杂交测定或三杂交测定中用作“诱饵蛋白”(参见例如美国专利第5,283,317号；美国依法登记的发明第H1,892号；Zervos等，1993；Madura等，1993；Bartel等，1993(a)；Iwabuchi等，1993；国际申请第WO94/10300号)，鉴定其它蛋白，这些蛋白与UP_11或OM_10结合或相互作用(“UP_11或OM_10结合蛋白”或者“UP_11-或OM_10-bp”)或者涉及UP_11或OM_10活性。所述UP_11或OM_10结合蛋白也可能涉及UP_11或OM_10多肽或UP_11或OM_10靶的信号传递，例如作为UP_11或OM_10介导的信号途径的下游元件。或者，所述UP_11或OM_10结合蛋白可以是UP_11或OM_10抑制剂。
因此，在某些实施方案中，本发明考虑测量蛋白质蛋白质相互作用，例如UP_11或OM_10和UP_11或OM_10结合蛋白之间的相互作用。酵母双杂交系统对于研究蛋白质蛋白质相互作用特别有用。可以获得所述系统的不同形式，用于筛选酵母噬菌粒(Harper等，1993；Elledge等，1991)或者质粒(Bartel等，1993(a)，(b)；Finley和Brent，1994)cDNA文库，以克隆相互作用的蛋白并研究已知的蛋白对。最近，已经描述了用于高通量筛选蛋白质蛋白质相互作用的特异性抑制剂的双杂交方法以及一次鉴定蛋白对之间许多不同相互作用的双杂交筛选(参见美国依法登记的发明第H1,892号)。
双杂交系统的成功依赖于以下事实可以分离许多转录因子(例如GAL4)的DNA结合结构域以及聚合酶激活结构域，然后再连接以恢复功能性(Morin等，1993)。概括地讲，该测定利用两种不同的DNA构建体。在一种构建体中，编码UP_11或OM_10多肽的基因与编码已知转录因子(例如GAL-4)DNA结合结构域的基因融合。在另一种构建体中，使来自DNA序列文库的编码未鉴定蛋白(“猎物”或“样品”)的DNA序列与编码所述已知转录因子的激活结构域的基因融合。假如所述“诱饵”蛋白和所述“猎物”蛋白能够在体内相互作用，形成依赖于UP_11或依赖于OM_10的复合物，那么所述转录因子的DNA结合结构域和激活结构域就能够相互接近。这种相互接近允许有效连接响应所述转录因子的转录调节位点的报道基因(例如LacZ)的转录。可以检测所述报道基因的表达，然后分离包含所述功能性转录因子的细胞集落，用于获得编码与UP_11或OM_10多肽相互作用的蛋白的克隆基因。
根据这些药物筛选测定鉴定的UP_11或OM_10多肽活性和/或UP_11或OM_10核酸表达的调节剂可以用于治疗例如神经系统疾病。这些治疗方法包括下述步骤例如通过如本文所述的药用组合物，给予需要所述治疗的受治疗者(例如患有本文所述疾病的受治疗者)所述UP_11或OM_10多肽活性和/或核酸表达的调节剂。
诊断分析本发明还提供检测生物学样品中存在UP_11或OM_10多肽或UP_11或OM_10核酸分子或其片段的方法。所述方法包括使所述生物学样品与能够检测UP_11或OM_10多肽或mRNA的化合物或药剂接触，以便能够检测所述生物学样品中存在UP_11或OM_10多肽/编码核酸分子。用于检测UP_11或OM_10mRNA的优选试剂是能够与UP_11或OM_10mRNA杂交的已标记或可标记核酸探针。所述核酸探针可以是例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的全长UP_11或OM_10cDNA或其片段，例如长至少15个、30个、50个、100个、250个或500个核苷酸并且与UP_11或OM_10mRNA足以在严格性条件下特异性杂交的寡核苷酸。用于检测UP_11或OM_10多肽的优选试剂是能够结合UP_11或OM_10多肽的已标记或可标记抗体。抗体可以是多克隆抗体，或者更优选是单克隆抗体。可以使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。术语“已标记或可标记”当指探针或抗体时，包括用可检测物质偶联(即物理连接)所述探针或抗体以直接标记所述探针或抗体，以及利用与另一种直接标记的试剂的反应性，间接标记所述探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，以及用生物素标记DNA探针末端，以便能够用荧光标记的链霉抗生物素进行检测。术语“生物学样品”包括从受治疗者分离的组织、细胞和生物学流体，以及受治疗者体内存在的组织、细胞和流体。也就是说，本发明的检测方法可以用于检测体外以及体内生物学样品内的UP_11或OM_10mRNA或蛋白。例如，用于检测UP_11或OM_10mRNA的体外技术包括RNA印迹杂交和原位杂交。用于检测检测UP_11或OM_10多肽的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。或者，可以通过将标记抗UP_11或OM_10抗体导入受治疗者体内，检测所述受治疗者体内的UP_11或OM_10多肽。例如，可以用放射性标记物标记抗体，然后可以通过标准成像技术检测受治疗者体内所述抗体的存在和位置。尤其有用的是检测在受治疗者体内表达的UP_11或OM_10多肽等位基因变异体的方法，以及检测样品中UP_11或OM_10多肽片段的方法。
本发明还包括用于检测生物学样品中存在UP_11或OM_10多肽的试剂盒。例如，所述试剂盒可以包含试剂，例如能够检测生物学样品中UP_11或OM_10mRNA的已标记或可标记化合物或药剂；测定所述样品中UP_11或OM_10多肽含量的方法；以及将所述样品中UP_11或OM_10多肽含量与标准进行比较的方法。所述化合物或药剂可以包装在合适的容器内。所述试剂盒还可以包括使用所述试剂盒检测UP_11或OM_10mRNA或蛋白的说明书。
本发明的方法也可以用于检测UP_11或OM_10基因内的天然存在的遗传突变，由此确定携带所述突变基因的受治疗者是否有患如上文所述特征在于不正常或异常UP_11或OM_10核酸表达或UP_11或OM_10多肽活性的疾病的风险。在优选实施方案中，所述方法包括检测从所述受治疗者体内获得的细胞样品中是否存在以下情况遗传突变或者UP_11或OM_10基因的错误表达，所述遗传突变的特征在于影响编码UP_11或OM_10多肽的基因的完整性的至少一种改变。例如，可以通过确定下面情况中至少一种的存在而检测所述遗传突变1)缺失UP_11或OM_10基因的一个或多个核苷酸；2)在UP_11或OM_10基因中添加一个或多个核苷酸；3)取代UP_11或OM_10基因的一个或多个核苷酸；4)UP_11或OM_10基因的染色体重排；5)在UP_11或OM_10基因的信使RNA转录物水平上的改变，6)UP_11或OM_10基因的异常修饰，例如基因组DNA的甲基化模式，7)存在UP_11或OM_10基因信使RNA转录物的非野生型剪接模式，8)UP_11或OM_10蛋白的非野生型水平，9)丢失UP_11或OM_10等位基因，和10)UP_11或OM_10蛋白的不适当翻译后修饰。如本文所述，可以使用本领域已知的许多测定技术，检测UP_11或OM_10基因内的突变。
在某些实施方案中，对所述突变的检测包括在聚合酶链式反应(PCR)例如锚定PCR或RACE PCR中应用探针/引物(参见例如美国专利第4,683,195号和美国专利第4,683,202号)，或者在连接链式反应(LCR)中应用探针/引物，后者尤其可以用于检测UP_11或OM_10基因内的点突变。该方法可以包括下述步骤从患者中收集细胞样品，接着从所述样品细胞中分离核酸(例如基因组核酸、mRNA或者它们两者)，然后在允许UP_11或OM_10基因(如果存在的话)杂交和扩增的条件下，使所述核酸样品与一种或多种与UP_11或OM_10基因特异性杂交的引物接触，随后检测扩增产物的存在与否，或者检测所述扩增产物的大小，并将其与对照样品的长度进行比较。
在一个可替代的实施方案中，可以通过限制酶切割模式的改变，鉴定来自样品细胞的UP_11或OM_10基因中的突变。例如，分离样品和对照DNA，扩增(任选)，用一种或多种限制性内切核酸酶消化，然后通过凝胶电泳测定片段长度大小，并进行比较。样品和对照DNA之间片段长度大小的差异说明样品DNA内的突变。此外，可以应用序列特异性核酶(参见美国专利第5,498,531号，该专利通过引用全部结合到本文中)，通过核酶切割位点的发生或损失，计数特异性突变的存在。
在另一个实施方案中，可以使用本领域多种已知测序反应中的任何一种直接对UP_11或OM_10基因进行测序，并通过将样品UP_11或OM_10基因的序列与相应野生型(对照)序列进行比较，检测突变。测序反应的实例包括那些基于由Maxim和Gilbert(1977)或Sanger(1977)开发的技术的测序反应。当进行所述诊断分析时，可以利用各种自动化测序程序，其中包括通过质谱法进行测序(参见例如国际申请第WO 94/16101号；Cohen等，1996；和Griffin等1993)。
用于检测UP_11或OM_10基因中突变的其它方法包括以下方法应用对抗切割试剂的保护，检测RNA/RNA或RNA/DNA双链体中的错配碱基(Myers等，1985(a)；Cotton等，1988；Saleeba等，1992)，比较突变和野生型核酸的电泳迁移率(Orita等，1989；Cotton，1993；和Hayashi，1992)，以及使用变性梯度凝胶电泳测定突变或野生型片段在包含变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动(Myers等，1985)。用于检测点突变的其它技术的实例包括选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增和选择性引物延伸。
治疗方法本发明的另一方面涉及用于治疗患有特征在于不正常或异常UP_11或OM_10核酸表达和/或UP_11或OM_10多肽活性(或与其有关)的疾病或紊乱的受治疗者(例如人)的方法。这些方法包括给予所述受治疗者UP_11或OM_10多肽/基因调节剂(激动剂或拮抗剂)以便进行治疗的步骤。术语“不正常或异常UP_11或OM_10多肽表达”是指非野生型UP_11或OM_10多肽的表达或UP_11或OM_10多肽表达的非野生型水平。不正常或异常UP_11或OM_10多肽活性是指非野生型UP_11或OM_10多肽活性。由于UP_11或OM_10多肽涉及细胞内参与信号传递的途径，因此不正常或异常UP_11或OM_10多肽活性或表达干扰由UP_11或OM_10多肽信号传递介导的正常功能调节。本文所用的术语“治疗”是指减轻或缓解紊乱或疾病的至少一种不良影响或症状，所述紊乱或疾病指例如特征在于不正常或异常UP_11或OM_10多肽活性或UP_11或OM_10核酸表达(或与其有关)的紊乱或疾病。
本文所用的UP_11或OM_10多肽/基因调节剂是能够调节UP_11或OM_10核酸表达和/或UP_11或OM_10多肽活性的分子。例如，UP_11或OM_10基因或蛋白调节剂可以调节UP_11或OM_10核酸表达，例如正调节(激活/激动)或负调节(抑制/拮抗)所述表达。在另一个实例中，UP_11或OM_10多肽/基因调节剂可以调节(例如刺激/激动或者抑制/拮抗)GPCR多肽活性。如果需要通过抑制UP_11或OM_10核酸表达以治疗特征在于不正常或异常(非野生型)UP_11或OM_10核酸表达/UP_11或OM_10多肽活性(或与其有关)的紊乱或疾病，那么UP_11或OM_10调节剂可以是如本文所述的反义分子，如核酶。可以用于抑制UP_11或OM_10核酸表达的反义分子的实例包括与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10的5′非翻译区片段(也包括起始密码子)互补的反义分子以及与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的3′非翻译区片段互补的反义分子。
抑制UP_11或OM_10核酸表达的UP_11或OM_10调节剂也可以是抑制UP_11或OM_10核酸表达的小分子或其它药物，例如使用本文所述筛选测定鉴定的小分子或药物。假如需要通过刺激UP_11或OM_10核酸表达而治疗特征在于不正常或异常(非野生型)UP_11或OM_10核酸表达和/或UP_11或OM_10多肽活性(或与其有关)的疾病或紊乱，那么UP_11或OM_10调节剂可以是例如编码UP_11或OM_10多肽的核酸分子(例如包含与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10的核苷酸序列同源的核苷酸序列的核酸分子)，或者使用本文所述筛选测定所鉴定的刺激UP_11或OM_10核酸表达的小分子(肽)或药物。
或者，假如需要通过抑制UP_11或OM_10多肽活性而治疗特征在于不正常或异常(非野生型)UP_11或OM_10核酸表达和/或UP_11或OM_10多肽活性(或与其有关)的疾病或紊乱，那么UP_11或OM_10调节剂可以是抗UP_11抗体或抗OM_10抗体，或者抑制UP_11或OM_10多肽活性的小分子或其它药物，例如使用本文所述筛选测定而鉴定的小分子或药物。假如需要通过刺激UP_11或OM_10多肽活性而治疗特征在于不正常或异常(非野生型)UP_11或OM_10核酸表达和/或UP_11或OM_10多肽活性(或与其有关)的疾病或紊乱，那么UP_11或OM_10调节剂可以是活性UP_11或OM_10多肽或其片段(例如具有与SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的氨基酸序列或其片段同源的氨基酸序列的UP_11或OM_10多肽或其片段)，或者是小分子或其它药物，例如使用本文所述筛选测定所鉴定的刺激UP_11或OM_10多肽活性的小分子或药物。
本发明的其它方面涉及调节UP_11或OM_10多肽介导的细胞活性的方法。这些方法包括下述步骤使所述细胞与调节UP_11或OM_10多肽活性或UP_11或OM_10核酸表达的试剂(或包括有效量试剂的组合物)接触，以便UP_11或OM_10多肽介导的细胞活性相对于正常水平被改变(例如cAMP或磷脂酰肌醇代谢)。本文所用的“GPCR多肽介导的细胞活性”或“UP_11或OM_10多肽介导的细胞活性”指正常或异常的细胞活性或功能。UP_11或OM_10多肽介导的细胞活性的实例包括磷脂酰肌醇更新、分子(例如蛋白)产生或分泌、收缩、增殖、迁移、分化和细胞存活。本文所用的术语“改变的”指细胞相关活性的改变，如增加或减少，所述细胞相关活性尤其是cAMP或磷脂酰肌醇更新，以及腺苷酸环化酶或磷脂酶C激活。
在一个实施方案中，所述试剂刺激UP_11或OM_10多肽活性或UP_11或OM_10核酸表达。在另一个实施方案中，所述试剂抑制UP_11或OM_10多肽活性或UP_11或OM_10核酸表达。这些调节方法可以在体外进行(例如所述细胞与所述试剂一起进行培养)，或者在体内进行(例如将所述试剂给予受治疗者)。在一个优选实施方案中，所述调节方法在体内进行，即所述细胞存在于受治疗者如哺乳动物(例如人)体内，并且所述受治疗者患有特征在于异常或不正常UP_11或OM_10多肽活性或UP_11或OM_10核酸表达或与其有关的紊乱或疾病。
在治疗方法中使用的核酸分子、蛋白、UP_11或OM_10调节剂、化合物等可以加入下文描述的合适药用组合物，然后通过允许所述分子、蛋白、调节剂或化合物等执行其既定功能的途径将其给予所述受治疗者。
UP_11或OM_10多核苷酸表达和/或UP_11或OM_10多肽活性的调节剂可以用于治疗各种疾病或紊乱，所述疾病或紊乱包括但不限于心肺系统，如急性心力衰竭、低血压、高血压、心绞痛、心肌梗塞等；胃肠系统；中枢神经系统；肾病；肝病；过度增生性疾病，例如癌症和牛皮癣；细胞凋亡疾病；疼痛；子宫内膜异位；厌食；易饿病；哮喘；骨质疏松；神经精神病如精神分裂症、谵妄、双相性精神病、抑郁、焦虑、心理失衡；尿潴留；溃疡；变态反应；良性前列腺增生；和运动障碍，如亨庭顿舞蹈病(Huntington′s disease)或图雷特综合征(Tourett′s syndrome)。
涉及脑的疾病包括但不限于涉及神经元的疾病，涉及神经胶质(例如星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和小神经胶质)的疾病；脑水肿、颅内压升高和疝形成、以及脑水肿；畸形和发育性疾病，例如神经管缺陷、前脑异常、后窝异常、以及脊髓空洞症和脊髓积水；围产期脑损伤；脑血管疾病，例如那些与低氧、局部缺血和梗塞有关的疾病，包括低血压、血流灌注不足、以及低血流状态——全脑局部缺血和病灶性脑局部缺血——由于局部血流供应引起的梗塞、颅内出血，包括大脑内(实质内)出血、蛛网膜下出血和破裂的颅内小动脉瘤，以及脉管畸形、高血压性脑血管疾病，包括腔隙梗塞、裂隙出血和高血压性脑病；感染，例如急性脑膜炎，包括急性化脓性(细菌性)脑膜炎和急性无菌性(病毒性)脑膜炎、急性病灶性化脓性感染，包括脑脓肿、硬膜下积脓和硬膜外脓肿，慢性细菌性脑膜脑炎，包括结核和分支杆菌病、神经梅毒和神经疏螺旋体病(莱姆病)、病毒性脑膜脑炎，包括节肢动物传(虫媒)病毒性脑炎，1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(带状疱疹)、巨细胞病毒、脊髓灰质炎、狂犬病和1型人免疫缺陷病毒，包括FHV-1脑膜脑炎(亚急性脑炎)、空泡脊髓病、AIDS相关肌病、外周神经病以及儿童AIDS、进行性多病灶性脑白质病、亚急性硬化性全脑炎、真菌性脑膜脑炎、其它神经系统的传染病；可传播的海绵状脑病(朊病毒病)；脱髓鞘病，包括多发性硬化、多发性硬化变种、急性弥散性脑脊髓炎和急性坏死性出血性脑脊髓炎，以及其它伴有脱髓鞘的疾病；变性性疾病，例如影响大脑皮质的变性性疾病，包括早老性痴呆和皮克病，基底神经节和脑干的变性性疾病，包括帕金森神经功能障碍、特发性帕金森病(震颤性麻痹)、进行性核上麻痹、皮质基底变性、多系统萎缩，包括纹状体黑质变性、夏-德雷格综合征和橄榄体脑桥小脑萎缩，以及亨廷顿舞蹈病；脊髓小脑变性，包括脊髓小脑共济失调，包括弗里德赖希共济失调和共济失调-毛细管扩张；影响运动神经元的变性性疾病，包括肌萎缩性侧索硬化(运动神经元病)、延髓脊髓萎缩(肯尼迪综合征)；和脊髓肌肉萎缩；代谢的先天错误，例如脑白质营养不良，包括克拉贝病、异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良、Elizaeus-Merzbacher病和卡纳范病、线粒体性脑肌病，包括利氏病和其它线粒体性脑肌病；中毒性和获得性代谢病，包括维生素缺乏症，如硫胺素(维生素B1)缺乏症和维生素B12缺乏症、代谢紊乱的神经后遗症，包括低血糖、高血糖和肝性脑病、中毒性疾病，包括一氧化碳、甲醇、乙醇和放射性中毒性疾病，包括氨甲蝶呤与放射组合诱导的损伤；肿瘤，例如神经胶质瘤，包括星形细胞瘤，包括原纤维性(弥散性)星形细胞瘤和多形成胶质细胞瘤、纤维性星形细胞瘤、多形黄色星形细胞瘤和脑干神经胶质细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤和室管膜瘤以及相关室旁质损害、神经元肿瘤、分化不足的肿瘤，包括成神经管细胞瘤、其它实质肿瘤，包括原发性脑淋巴瘤、生殖细胞瘤和松果体实质肿瘤、脑脊髓瘤、转移性肿瘤、副肿瘤性综合征、外周神经鞘肿瘤，包括神经鞘瘤、纤维神经瘤和恶性外周神经鞘肿瘤(恶性神经鞘瘤)、神经皮肤综合征(斑痣性错构瘤病)，包括神经纤维瘤病，包括1型神经纤维瘤病(NF1)和2型神经纤维瘤病(NF2)、结节性脑硬化和Von Hippel-Lindau病，以及神经精神病，例如精神分裂症、躁郁症、抑郁症、焦虑和惊恐性障碍。
药物基因组学(Pharmacogenomics)可以将试验/候选化合物或者通过如本文描述的筛选测定所鉴定的对UP_11或OM_10多肽活性(例如UP_11或OM_10基因表达)有刺激或抑制作用的调节剂给予个体，以治疗(预防性治疗或治疗性治疗)与不正常UP_11或OM_10多肽活性有关的疾病(例如神经疾病)。结合这样的治疗，可以考虑所述个体的药物基因组学(即对个体基因型与该个体对外源化合物或药物的反应之间关系的研究)。治疗药物代谢的差异通过改变药理上有活性的药物的剂量和血液浓度之间的关系，可能导致严重毒性或治疗失败。因此，个体的药物基因组学允许根据所述个体的基因型，选择用于预防性或治疗性治疗的有效化合物(例如药物)。所述药物基因组学可以进一步用于确定合适的剂量和治疗方案。因此，可以确定个体内的UP_11或OM_10多肽活性、UP_11或OM_10核酸表达或UP_11或OM_10基因突变程度，由此选择用于治疗性或预防性治疗所述个体的合适化合物。
药物基因组学涉及对药物反应时由于受影响病人中的药物处置和异常作用改变所致的临床显著性遗传变异。参见例如Eichelbaum，1996和Linder，1997。一般而言，可以区分两种类型的药物遗传学病症。遗传病症作为单因素遗传，改变了药物对机体的作用方式(药物作用改变)；或者遗传病症作为单因素遗传，改变了机体对药物的作用方式(药物代谢改变)。这些药物遗传学病症可以或者作为罕见缺陷发生或者作为多态性发生。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(GOD)是常见的遗传性酶病，其中主要临床并发症是在摄入氧化剂药物(抗疟疾药、磺胺类药、镇痛药、硝基呋喃类药)和消耗蚕豆后的溶血作用。
作为示例性的实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用强度和持续时间的主要决定因素。药物代谢酶(例如N-乙酰转移酶2(NAT2)和细胞色素P450酶CYP2136和CYP2C19)遗传多态性的发现，解释了为什么一些病人摄取药物的标准安全剂量后没有获得预期的药物效应，或者显示过分的药物反应和严重毒性。
这些多态性在群体中表现为两种表型，即强代谢者(extensivemetabolizer，EM)和弱代谢者(poor metabolizer，PM)。PM的流行在不同群体中是不同的。例如，编码CYP2136的基因具有高度多态性，已经在PM中鉴定出几种突变，都导致缺失功能性CYP2D6。CYP2136和CYP2C19的弱代谢者当接受标准剂量时，非常普遍地有过分药物反应和副作用的经历。
假如代谢物是活性治疗部分，那么PM显示没有治疗反应，例如可待因通过其CYP2136形成的代谢物吗啡而介导的镇痛效应。另一个极端是所谓极度快速代谢者，他们对标准剂量没有反应。最近，已经鉴定极度快速代谢的分子基础是由于CYP2D6基因扩增。
因此，可以确定个体内的UP_11或OM_10多肽活性、UP_11或OM_10核酸表达或UP_11或OM_10基因的突变程度，由此选择用于治疗性或预防性治疗受治疗者的合适药剂。此外，可以进行药物遗传学研究，通过鉴定编码药物代谢酶的多态性等位基因的基因型，从而鉴定受治疗者的药物反应性表型。当用UP_11或OM_10调节剂治疗受治疗者时，将这方面的知识应用于剂量或药物选择，能够避免副反应或治疗失败，并因此增强治疗或预防功效，所述UP_11或OM_10调节剂例如通过本文所述其中一种示例性筛选测定而鉴定的调节剂。
在临床试验期间监测效应监测化合物(例如药物)相应UP_11或OM_10多肽/基因表达或活性的影响不仅可以应用于基本药物筛选，而且可以应用于临床试验。例如，在对表现UP_11或OM_10基因表达、蛋白水平降低或UP_11或OM_10多肽活性受到负调节的受治疗者的临床试验中，可以监测通过本文所述筛选测定确定的试剂对于增加UP_11或OM_10基因表达、蛋白水平或正调节UP_11或OM_10活性的有效性。或者，在对表现UP_11或OM_10基因表达、蛋白水平升高或UP_11或OM_10多肽活性受到正调节的受治疗者的临床试验中，可以监测通过筛选测定确定的试剂对于降低UP_11或OM_10基因表达、蛋白水平或负调节UP_11或OM_10活性的有效性。在所述临床试验中，UP_11或OM_10多肽以及优选其它涉及例如神经系统相关疾病的基因的表达或活性可以用作特定细胞对配体反应性的“读出”或标记。
作为非限制性的实例，可以鉴定用调节UP_11或OM_10多肽/基因活性的化合物(例如药物或小分子，在如本文所述的筛选测定中鉴定)治疗时细胞内受到调节的基因，其中包括UP_11或OM_10基因。因此，为了在例如临床试验中研究化合物对CNS疾病的作用，可以分离细胞，制备RNA，分析UP_11或OM_10基因以及其它涉及所述疾病的基因的表达水平。可以如下定量基因表达的水平(即基因表述模式)通过如本文所述的RNA印迹分析或RT-PCR，或者通过本文描述的其中一种方法测量产生的蛋白量，或者通过测量UP_11或OM_10多肽或其它基因的活性水平。用这种方法，所述基因表达模式可以作为标记，说明所述细胞对所述化合物的生理反应。因此，可以确定治疗前和用所述化合物治疗所述个体过程中不同时间点的该反应状态。
在一个优选实施方案中，本发明提供监测用化合物(例如用本文所述筛选测定鉴定的激动剂、拮抗剂、肽模拟物(peptidomimetic)、蛋白、肽、核酸、小分子或其它药物候选物)治疗受治疗者的有效性的方法，所述方法包括下述步骤(i)给予所述化合物前从受治疗者获取给药前样品；(ii)检测所述给药前样品中UP_11或OM_10多肽、mRNA或基因组DNA的表达水平；(iii)从所述受治疗者获取一个或多个给药后样品；(iv)检测所述给药后样品中的UP_11或OM_10多肽、mRNA或基因组DNA表达水平或活性；(v)将给药前样品中UP_11或OM_10多肽、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性与一种或多种给药后样品中UP_11或OM_10多肽、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性进行比较；然后(vi)由此改变将所述化合物给予所述受治疗者的给药量。例如，可能希望增加所述化合物的给药量，以增加UP_11或OM_10多肽/基因表达或活性达到比检测值更高的水平，即增加所述药剂的有效性。
或者，可能希望减少所述药剂的给药量，以降低UP_11或OM_10表达或活性到比检测值更低的水平，即降低所述化合物的有效性。
药用组合物本发明的UP_11或OM_10核酸分子、UP_11或OM_10多肽(尤其是UP_11或OM_10的片段)、UP_11或OM_10多肽调节剂以及抗UP_11或OM_10抗体(在本文也称为“活性化合物”)可以加入适于给予受治疗者(例如人)的药用组合物。所述组合物通常包括所述核酸分子、蛋白、调节剂或抗体以及药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括与给药相适应的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述介质和试剂用作药学活性物质的应用是本领域众所周知的。除了与所述活性化合物不相适应的任何常规介质或试剂外，所述介质可以用于本发明的组合物。在所述组合物中也可以加入辅助的活性化合物。
将本发明的药用组合物配制成适合它的计划给药途径。给药途径的实例包括胃肠外给药(例如静脉内给药、皮内给药、皮下给药)、经口给药(例如吸入给药)、透皮给药(局部给药)、经粘膜给药和直肠给药。对于胃肠外、皮内或皮下应用所用的溶液剂或混悬剂可以包括以下组分无菌稀释剂例如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠进行调节。可以将胃肠外制剂装入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量管形瓶中。
适合用于注射的药用组合物包括无菌水溶液(就水溶性而论)或者用于临时制备无菌注射液或分散剂的分散剂和无菌粉针剂。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)，在所有情况下，注射用组合物应该是无菌的并且应该是易于注射的液体。所述组合物在生产和储藏条件下必须是稳定的并且必须防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及它们的合适混合物。可以例如通过利用包衣剂例如卵磷脂，就分散剂而论，通过保持所需粒度以及通过利用表面活性剂，来维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等，可以实现防止微生物的作用。在许多情况下，在所述组合物中最好是包括等渗剂例如糖类、多羟基醇例如甘露醇、山梨醇、氯化钠。通过在所述组合物中包括延迟吸收的试剂例如一硬脂酸铝和明胶，可以使所述注射用组合物的吸收延长。
通过将所述活性化合物(例如UP_11或OM_10多肽或抗UP_11或OM_10抗体)以所需量掺入到具有一种以上列举的组分或以上列举的组分的组合的合适溶剂中，必要时接着进行过滤除菌，可以制备无菌注射液。一般而言，通过将所述活性化合物掺入到含有基本分散介质和所需其它来自以上列举的组分的无菌溶媒中，制备分散剂。就用于制备无菌注射液的无菌粉针剂而论，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，得到所述有效成分加上它们的任何额外所需来自先前过滤除菌溶液的组分的粉针剂。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。可以将其装入明胶胶囊剂中或者压成片剂。为了经口治疗性给药，所述活性化合物可以与赋形剂一起掺入并且以片剂、锭剂或胶囊剂使用。口服组合物也可采用可用作漱口剂的液体载体来制备，其中所述液体载体中的所述化合物经口给予，漱口后吐出或者吞下。可以包括药学上相容的粘合剂和/或辅料作为所述组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有任一下述组分或相似性质的化合物粘合剂例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖、崩解剂例如藻酸、羧甲基淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或氢化植物油；助流剂例如胶态二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或矫味剂例如欧薄荷、水杨酸甲酯或橙皮矫味剂。
对于吸入给药，用装有合适抛射剂如二氧化碳等气体的加压容器或分配器或者喷雾器以气雾剂喷雾形式给予所述化合物。系统给药也可以是通过经粘膜或透皮方式。对于经粘膜给药或透皮给药，在所述制剂中使用适合穿过屏障的渗透剂。一般而言，这样的渗透剂是本领域已知的，并且对于经粘膜给药，包括例如去垢剂、胆盐和夫西地酸衍生物。可以通过应用鼻喷雾剂或栓剂完成经粘膜给药。对于透皮给药，将所述活性化合物配制成本领域公知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。
所述化合物也可以制备成栓剂形式(例如用常规栓剂基质例如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠给药的直肠灌肠剂。
在一个实施方案中，所述活性化合物同保护所述化合物抵抗从机体快速消除的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入片和微囊化传递系统。
可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。这类制剂的制备方法对于本领域技术人员将会是显而易见的。所述材料也可以在市场上从例如Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.获得。脂质体混悬剂(包括用抗病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。可以按照本领域技术人员已知的方法，例如在美国专利第4,522,811号中描述的方法，制备这些制剂，所述专利通过引用全部结合到本文中。
尤其有利的是配制易于给药和剂量均匀性的剂量单位形式的口服或胃肠外组合物。本文所用的剂量单位形式包括适合作为待治疗患者的单元剂量的物理上分离的单位；计算每个单位含有预定量的活性化合物并结合所需的药用载体产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的技术标准取决于和直接取决于所述活性化合物的独特特征以及待达到的特定疗效和用于治疗个体的这种活性化合物的所属领域的固有限制。
可以将本发明的核酸分子插入到载体中并且将其用作基因治疗载体。可以通过例如静脉内注射、局部给药(参见美国专利5,328,470)或立体定位(stereotatic)注射(参见例如Chen等，1994)，将基因治疗载体给予患者。所述基因治疗载体的药物制剂可包括基因治疗载体的可接受的稀释剂，或者可以包括其中包埋基因传递载体的缓释基质。另一方面，在可以从重组细胞完整地产生完全基因传递载体例如逆转录病毒载体的情况下，所述药物制剂可以包括一种或多种产生所述基因传递系统的细胞。所述药用组合物可以包括在容器、包装或分配器中并且附有给药说明书。
G.部分UP_11或OM_10序列的应用本文鉴定的所述cDNA序列的片段(及相应的完整基因序列)可以以多种方式用作多核苷酸试剂。例如，这些序列可以用于(a)将它们各自的基因作图到染色体上；并因此定位与遗传疾病有关的基因区；(b)由小量生物学样品鉴定个体(组织分型)；和(c)协助对生物学样品的法医鉴定。这些应用在下面的部分描述。
染色体作图把UP_11或OM_10序列作图到染色体上是将这些序列与疾病相关基因相联系的重要的第一步。UP_11序列作图到染色体1p11，OM_10序列作图到染色体Xq27。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传)，鉴定作图到同一染色体区上的基因与疾病之间的关系。
此外，可以鉴定受到和未受到UP_11或OM_10基因相关疾病影响的个体之间在DNA序列上的差异。假如在一些或所有受影响个体内观察到一个突变，而在任何未受影响个体内没有观察到所述突变，那么所述突变有可能是该特定疾病的病因。受影响个体与未受影响个体之间的比较总的来讲涉及首先寻找染色体内的结构改变，例如在染色体伸展上可见或可以使用基于该DNA序列的PCR检测到的缺失或易位。最后，对几个个体进行完全基因测序，证实突变的存在，并将突变与多态性区分开。
实施例使用标准技术进行下面的实施例，所述标准技术除了详细描述的以外，都是本领域技术人员众所周知和常规的技术。下面的实施例是为举例说明的目的提出，不应当以任何方式理解为限制本发明的范围。
实施例1鉴定人UP_11和OM_10多核苷酸序列使用人5-HT6受体序列(登录号L41147)，对Genbank的高通量基因组序列(HTGS)部分和Celera人类基因组数据库进行TBLASTN(Altschul等，1997)搜索，以鉴定新型GPCR样基因。解析所得HSP，组装，然后使用BLASTP对完整的蛋白质数据库再次进行搜索。所述第二次BLAST搜索用于鉴定新型编码GPCR的基因组序列。进一步使用Genscan(Burge和Karlin，1997)分析新型序列，用BLAST同源性预测推定的新型GPCR。使用所述预测的人类序列，设计在获取人UP_11或OM_10物理克隆时使用的寡核苷酸引物。
使用预测的人UP_11和OM_10序列，对Celera小鼠基因组数据库也进行BLAST搜索。使用Sequencher(GeneCodes)组装与UP_11或OM_10有高度相似性的Celera小鼠片段，使用Genscan预测小鼠可读框。
如下所述，从cDNA文库中分离cDNA克隆(人UP_11分离物179(SEQ ID NO1)、人UP_11分离物200(SEQ ID NO2)和人UP_11分离物30(SEQ ID NO3)；小鼠mUP_11分离物67.1(SEQ ID NO5)和小鼠mUP_11分离物52.1(SEQ ID NO6)；人OM_10(SEQ ID NO8)和小鼠mOM_10(SEQ ID NO10))。
实施例2用于克隆UP_11和OM_10的方法文库构建使用Clontech PolyA RNA(分别是人大脑、海马(目录号6578-1)、人类大脑、扁桃体(目录号6574-1)和小鼠大脑(目录号6616-1))以及用于cDNA合成和质粒克隆试剂盒(目录号18248-013)的LifeTechnologies SuperScript质粒系统，构建质粒cDNA文库L600C、L601C和L701C。对生产商的方案作如下三个改进(1)在第一条链和第二条链的合成反应中，用DEPC处理的水取代(αP32)dCTP。(2)在1％琼脂糖凝胶，0.1μg/ml溴化乙锭，1xTAE凝胶上，通过凝胶电泳对Sal I适应的cDNA进行大小分级分离。从所述凝胶上切下溴化乙锭染色的≥3.0kb的cDNA。通过电洗脱(ISCO Little Blue Tank电洗脱仪和方法)，从所述琼脂糖凝胶纯化cDNA。(3)将所述凝胶纯化、大小分级分离的Sal I切割cDNA连接到NotI-SalI消化的pCMV-SPORT6(Life Technologies Inc.，L600，L601)或pBluescript SK(Stratagene，L701)。
质粒构建人UP_11如下构建包含预测的人UP_11基因序列的质粒pCRII2HUP11_12B。
使用标准技术进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。组合包含以下终浓度成分的反应混合物0.1μg人类基因组DNA(Clonetech，目录号6550-1)；10pmol正向引物5′ATGCATGCAAGCTTGCACCATGCTCCTGCTGGACTTGACTGC(SEQ ID NO22)；10pmol反向引物5′ATGCATGCCTCGAGTGACTCCAGCCGGGGTGA(SEQ IDNO23)；dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.2mM(Amersham PharmaciaBiotech目录号27-2094-01)；1.5单位Taq DNA聚合酶；1x PCR反应缓冲液(20mM Tris-HCl(PH8.4)，50mM KCl，Life Technologies，目录号10342)；0.15mM MgCl2。所述混合物在94℃温育1分钟，然后是35个循环的94℃30秒钟、65℃25秒钟、72℃70秒钟，最后在72℃温育5分钟(MJResearch DNA Engine Tetrad PTC-225)。
在1％琼脂糖、0.1μg/ml溴化乙锭、0.5xTBE凝胶(Maniatis等，1982)上，通过凝胶电泳对所述PCR反应产物(“DNA”)进行大小分级分离。从琼脂糖凝胶上切下合适大小的溴化乙锭染色的DNA条带。使用Clonetech NucleoSpin核酸纯化试剂盒(目录号K3051-2)和生产商的方案，从所述琼脂糖提取DNA。然后，使用Invitrogen TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen目录号K4600)和生产商的改进方案，将所述DNA亚克隆到载体pCRII-TOPO。概括地讲，将约40ng所述凝胶纯化的PCR产物与1μl生产商提供的pCRII-TOPO DNA(10ng/μl)和1μl稀释的盐溶液0.3M NaCl，0.15M MgCl2，在6μl终体内内温育。所述混合物在室温(约25℃)下温育5分钟。将1μl所述反应物加入到电感受态细胞(ElectroMAX DH10B细胞，Life Technologies目录号18290-015)，然后使用Biorad大肠杆菌脉冲仪(电压1.8KV，3-5毫秒脉冲)进行电穿孔。将1ml LB(Sambrook等，1989)加入到所述细胞中，然后所述混合物在37℃温育1.5小时。所述混合物接种到LB-氨苄青霉素琼脂平板上，在37℃温育过夜。通过对从分离集落制备的质粒DNA进行限制性消化分析(标准分子技术)和序列分析(ABI PrismBigDye终止子循环测序，目录号4303154，ABI 377仪器)，鉴定包含所述预测的人UP_11序列的细菌克隆。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒和方案(Qiagen Inc，目录号27106)，制备质粒DNA。
质粒构建人OM_10如上文针对人UP_11所述构建包含预测的人OM_10基因的质粒pCRII2KOM10_6B，并对所述方法作如下改进。
OM_10正向引物是5′ATGCATGCAAGCTTGCACCATGACGTCCACCTGCACCAACAG(SEQ ID NO24)，反向引物是5′ATGCATGCCTCGAGAGGAAAAGTAGCAGAATCG(SEQ IDNO25)。
人UP_11 cDNA克隆179、200、30的分离使用标准分子生物学技术，用P32标记的DNA探针，通过筛选约2,000,000个初级转化子，从质粒cDNA文库L601C分离UP_11cDNA克隆179(SEQ ID NO1)、200(SEQ ID NO2)和30(SEQ IDNO3)。68℃下，在5xDenhardt’s、5xSSC、1％SDS、100μg/ml变性的鲑精中进行菌落转移杂交。所述菌落转移在60℃下在0.1xSSC、1％SDS中洗涤。探针产生如下文所述。通过限制消化分析和序列分析(ABI Prism BigDye终止子循环测序，目录号4303154，ABI 377仪器)，分析来自L601C的分离阳性杂交菌落的如上文所述制备的质粒DNA。cDNA克隆179、30和200包含预测的UP_11可读框。
探针产生如下产生在文库筛选中使用的人UP_11特异性探针。使用EcoRI(New England Biolabs，目录号101)，按照生产商的方案，限制性消化来自pCRII2HUP11_12B的质粒DNA。在1.5％琼脂糖，0.1μg/ml溴化乙锭，1x TAE凝胶上，通过凝胶电泳对限制性片段进行大小分级分离。从所述琼脂糖凝胶上切下合适大小(约1200bp)的溴化乙锭染色的DNA带。然后，使用Clonetech NucleoSpin核酸纯化试剂盒(目录号K3051-2)和生产商的方案，从所述琼脂糖提取DNA。使用Prime-ItII随机引物标记试剂盒和方案(Stratagene，目录号300385)，用Redivue(αP32)dCTP(Amersham Pharmacia，目录号AA0005)标记所提取的DNA。用Amersham的NICK柱和方案(目录号17-0855-02)，除去未掺入的(αP32)dCTP。
人OM_10克隆的分离根据上文如分离人UP_11cDNA克隆所述，分离人OM_10cDNA克隆，其中所述分离方法包括以下改进。(1)筛选文库L600C的2,000,000个初级转化子，分离出一个包含预测的人OM_10可读框的克隆。(2)用来自质粒pCRII2KOM10_6B的约1500bp EcoRI限制性片段筛选所述文库。
小鼠OM_10和UP_11克隆的分离根据上文如分离人UP_11cDNA克隆所述，分离小鼠UP_11和OM_10cDNA克隆，其中所述分离方法包括以下改进。(1)对于每个基因，筛选文库L701C的2,000,000个初级转化子。(2)在60℃下，在5x Denhardt’s、4xSSC、1％SDS、100μg/ml变性鲑精中，进行菌落转移杂交。所述菌落转移物在60℃下，在0.25xSSC、1％SDS中洗涤。(3)用质粒pCRII2HUP11_12B的约1200bp EcoRI限制性片段或质粒pCRII2KOM10_6B的约1500bp EcoRI限制性片段探测所述转移物。
在所述UP_11筛选中，鉴定出两个阳性杂交菌落，即分离物67.1(SEQ ID NO5)和分离物52.1(SEQ ID NO6)；这两个菌落都包含根据对Celera小鼠基因组的TblastN搜索而预测的小鼠UP_11可读框。在所述OM_10筛选中，鉴定出一个阳性杂交菌落，该菌落包含根据对Celera小鼠基因组的TblasN搜索而预测的小鼠OM_10可读框。
实施例3人和小鼠UP_11和OM_10基因的组织表达人UP_11和OM_10为评价人UP_11和OM_10基因的组织分布，使用每道包含1μg来自各种人类组织的poly A+RNA(目录号7780-1和7755-1，Clontech，Palo Alto，CA)的印迹，进行RNA印迹分析，然后用人UP_11或OM_10特异性探针进行探测。滤膜在68℃下，在10ml Express Hyb杂交溶液(Clontech，Palo Alto，CA)中预杂交1小时，然后加入约100ng32P标记的探针。使用Stratagene Prime-It试剂盒，目录号300392(Clontech，Palo Alto，CA)产生所述探针。
所述人UP_11特异性P32标记的DNA探针包含SEQ ID NO1人UP_11序列中的核苷酸442-1653。人OM_10特异性P32标记的DNA探针包含SEQ ID NO8人OM_10序列的核苷酸332-1,858。
在12道人类多组织RNA印迹分析(7780)中，使用人UP_11特异性探针，在全脑组织中检测到约3kb、4.4kb和8kb转录物的信号强，而在骨骼肌中检测到所述转录物的信号弱。在该RNA印迹分析的其它组织中没有检测到转录物。在脑IIMTN(7755)中，在小脑、大脑皮质、髓质、枕极、额叶、颞叶和豆状核检测到同样大小的转录物。使用人类多组织表达阵列(目录号7775-1，用户手册PT3307-1)膜进一步分析人UP_11的表达。在所述人类多组织表达阵列上检测到与来自多组织的poly(A)+RNA的杂交与胎儿大脑、全脑、大脑皮质、额叶、顶叶、枕叶、颞叶、大脑皮质的旁中央脑回、脑桥、左小脑和右小脑、海马、延髓、豆状核、accumbens和垂体腺有强杂交；与胼胝体、扁桃体、尾状核、黑质和丘脑有中度杂交，而与脊髓弱杂交。在该阵列上，其它组织中没有检测到杂交。
使用人OM_10特异性探针，在所述人类12道多组织RNA印迹分析(7780)的任何组织中都没有检测到转录物。在脑II MTN(7755)中，与豆状核内约8kb和4kb的两种转录物有强杂交。在小脑、大脑皮质和髓质中观察与所述约8kb转录物较弱的杂交。在该RNA印迹上，没有检测到其它组织的转录物。使用人类多组织表达阵列(目录号7775-1，用户手册PT3307-1)膜，进一步分析人OM_10的表达。在所述人类多组织表达阵列中检测到与来自多组织的poly(A)+RNA的杂交与豆状核和尾状核有强杂交，与延髓、海马和扁桃体有弱杂交。在该阵列上没有检测到其它组织的杂交。
小鼠UP_11和OM_10为评价小鼠UP_11和OM_10转录物的组织分布，使用每道包含1μg从各种小鼠组织中分离的poly A+RNA(目录号7762-1，Clontech，Palo Alto，CA)的印迹进行RNA印迹分析，然后用小鼠UP_11或OM_10特异性探针进行探测。所述Clontech滤膜在10ml ExpressHyb杂交溶液(Clontech，Palo Alto，CA)中于68℃预杂交1小时，然后加入约100ng P32标记的探针。使用Stratagene Prime-It试剂盒，目录号300392(Clontech，Palo Alto，CA)产生所述探针。小鼠MTN印迹(目录号7762-1)如下通过RNA印迹分析评价小鼠脑内的组织分布。显微解剖小鼠(129Sv株或Balb/c株)脑的指定区域，立即在干冰上冷冻。使用Triazol(Gibco，15596)和生产商的方案，从所述冷冻组织分离总RNA。通过在变性凝胶(7.4％甲醛，1.1％琼脂糖，1xMOPS缓冲液(0.1MMOPS，5mM乙酸钠，1mM EDTA))上进行电泳，分级分离总RNA。65℃下，温育样品缓冲液(62.5％甲酰胺，1.25xMPOS缓冲液)内的RNA5分钟，加入甲醛获得7.4％的终浓度，然后在65℃下继续温育5分钟，在冰上冷却直到进行电泳。在所述凝胶的每个样品道上加样约10-15μg总RNA。在20xSSC内，将所述大小分级分离的RNA通过毛细管转印，转移到Hybond N+尼龙膜上过夜。然后，印迹在水中清洗，在UV下交联。在65℃下，印迹在Quickhyb缓冲液(Stratagene)中与20μg/ml变性的超声处理鲑精DNA(dSS)温育15分钟。然后，印迹在Quickhyb中与25μg/ml dSS和50ng P32标记的探针温育，如上文所述在65℃下合成2小时。在65℃下，在2xSSC，1％SDS中洗涤印迹两次，每次10分钟。在65℃下0.05xSSC，1％SDS中进行最后两次洗涤，每次45分钟。将印迹对X-射线胶片曝光。
所述小鼠UP_11特异性P32标记的DNA探针包含SEQ ID NO5小鼠UP_11序列的核苷酸684-2033。所述小鼠OM_10特异性P32标记DNA探针包含SEQ ID NO10小鼠OM_10序列的核苷酸1080-1780。
在小鼠MTN(7762)上，使用所述小鼠UP_11特异性探针，在全脑中检测到约4kb和4.4kb的转录物，在睾丸中检测到多种弱杂交转录物(约9.5kb、约4kb、约2kb、约1kb)。在该RNA印迹分析中的其它组织内没有检测到转录物。在所有测试的小鼠脑亚区组织中检测到约4kb和4.4kb的两种转录物，所述小鼠脑亚区组织是嗅球、纹状体、皮质、海马、丘、中脑和小脑。
在小鼠MTN(7762)上，使用所述小鼠OM_10特异性探针，在全脑内检测到一种约6_kb的转录物。在该RNA印迹分析的其它组织中没有检测到转录物。在小鼠脑亚区纹状体、下丘脑、丘、中脑和脑干中检测到一种约6_kb的转录物。在嗅球、皮质、海马或小脑内没有检测到转录物。
实施例4人和小鼠OM_10的染色体位置将从人血液中分离的淋巴细胞在补充10％胎牛血清和植物凝集素的α基本培养基(a-MEM)中于37℃培养68-72小时。用BrdU(0.18mg/ml，Sigma)处理所述淋巴细胞培养物，使细胞群体同步。用无血清培养基洗涤所述同步细胞三次，释放所述阻断剂，然后在含胸苷(2.5μg/ml；Sigma)的MEM中于37℃再培养6小时。收获细胞，通过标准程序制做载玻片，所述标准程序包括低渗处理、固定和风干。
小鼠染色体载玻片的制备从小鼠脾分离单核细胞，然后将其在补充15％胎牛血清，3μg/ml伴刀豆球蛋白A、10μg/ml脂多糖和5×10-5M巯基乙醇的RPMI 1640培养基中于37℃进行培养。44小时后，用0.18mg/ml BrdU处理所述培养的淋巴细胞14小时。用补充胸苷(2.5μg/ml)的a-MEM洗涤所述同步细胞，并在所述培养基中于37℃下再培养4小时。根据制备人类染色体的常规方法(低渗处理、固定和风干)制备染色体载玻片。
探针标记、原位杂交和检测用Gibco BRL BioNick标记试剂盒(15℃，1小时(Heng等，1992))，用dATP生物素化DNA探针。根据Heng等，1992；和Heng和Tsui，1993，使用SeeDNA Biotech(PO Box 21082，Windsor Ontario Canada)进行FISH检测。概括地讲，载玻片在55℃烘烤1小时。用RNA酶A处理后，所述载玻片在含70％甲酰胺的2xSSC中于70℃变性2分钟，然后用乙醇脱水。探针在含50％甲酰胺和10％硫酸葡聚糖的杂交混合物中于75℃变性5分钟。将探针加样到变性的染色体载玻片上。杂交过夜后，使用已公开的方法(Heng等，1992)，洗涤、检测和扩增载玻片。分别记录FISH信号和DAPI结合模式。通过CCD相机拍摄和组合影像，通过叠加FISH信号和DAPI分离的染色体带，将所述FISH作图信息指定到染色体带上(Heng和Tsui，1993)。
使用来自人OM_10 cDNA克隆的约4.7kb NotI/SalI限制性片段作为应用于所述人类染色体载玻片的探针。使用来自小鼠OM_10cDNA克隆的约5.3kb NotI/SalI限制性片段作为应用于所述小鼠染色体载玻片上的探针。
所述小鼠OM_10探针与小鼠染色体XA5杂交。所述人OM_10探针与人类染色体Xq26-q27杂交。这些染色体位置是可能的同线区，这支持我们将这些基因命名为直向同源物的观点(NCBI图谱JacksonLaboratory，Mouse Genome Informatics)。
实施例5重组UP_11和OM_10蛋白在细菌细胞中的表达在本实施例中，UP_11或OM_10作为重组谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白在大肠杆菌中表达，分离并表征所述融合蛋白。具体地说，将UP_11或OM_10与GST融合，将该融合蛋白在大肠杆菌如PEB 199株中表达。由于预测人UP_11和OM_10多肽分别是约49kDa和57kDa，预测GST是26kDa，因此预测所述融合蛋白的分子量是约75kDa和83kDa。用IPTG诱导所述GST-UP_11或OM_10融合蛋白在PEB199中的表达。通过在谷胱甘肽珠上进行的亲和层析，从诱导后PEB 199株的粗细菌裂解物纯化所述重组融合蛋白。
对从所述细菌裂解物纯化的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，可以确定所得融合蛋白的分子量。
实施例6重组UP_11和OM_10蛋白在COS细胞中的表达为在COS细胞中表达UP_11或OM_10基因，可以使用InvitrogenCorporation(San Diego，CA)的pcDNA/Amp载体。该载体包含SV40复制起点、氨苄青霉素抗性基因、大肠杆菌复制起点、CMV启动子和其后的多接头区，以及SV40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码完整UP_11或OM_10蛋白的DNA片段以及与所述片段的3′末端符合读框地融合的HA标记(Wilson等，1984)克隆到该载体的多接头区，由此将所述重组蛋白的表达置于所述CMV启动子的控制之下。
为构建该质粒，使用两个引物，通过PCR扩增所述UP_11或OM_10DNA序列。5′引物包含目标限制位点，其后是所述UP_11或OM_10编码序列从起始密码子开始的约二十个核苷酸；3′引物序列包含与另一个目标限制位点互补的序列、翻译终止密码子、HA标记和所述UP_11或OM_10编码序列的最后20个核苷酸。用合适限制酶消化所述PCR扩增的片段以及所述pCDNA/Amp载体，然后使用CIAP酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，使所述载体去磷酸化。所选用的所述两个限制位点最好不同，以便以正确的取向插入所述UP_11或OM_10基因。将所述连接混合物转化到大肠杆菌细胞(可以使用从Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA获得的HB101株，DH5a，SUPE)，将所述转化培养物接种到氨苄青霉素培养基平板上，选择抗性菌落。从转化子分离质粒DNA，通过限制性分析，检查正确片段的存在。
随后使用磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染法或电穿孔法，用所述UP_11或OM_10-pcDNA/Amp质粒DNA转染COS细胞。在Sambrook等，1989中可以找到用于转染宿主细胞的其它合适方法。使用HA特异性单克隆抗体，通过放射性标记(可以使用从NEN，Boston，MA获得的S35-甲硫氨酸或S35-半胱氨酸)和免疫沉淀(Harlow，E.和Lane，D.AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988)检测所述UP_11或OM_10蛋白的表达。概括地讲，用S35-甲硫氨酸(或S35-半胱氨酸)标记所述细胞达8小时。然后收集培养基，用去污剂(RIPA缓冲液，150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5)裂解所述细胞。用HA特异性单克隆抗体沉淀所述细胞裂解物和所述培养基。然后通过SDS-PAGE分析沉淀的蛋白。或者，使用合适的限制性位点，将包含所述UP_11或OM_10编码序列的DNA直接克隆到所述pCDNA/Amp载体的多接头中。
采用上文所述的方法，将所得质粒转染到COS细胞，然后使用UP_11或OM_10特异性单克隆抗体，通过放射性标记和免疫沉淀检测所述UP_11或OM_10蛋白的表达。
实施例7UP_11和OM_10在哺乳动物细胞中的表达细胞系的产生将人或小鼠UP_11或OM_10的可读框连接到哺乳动物表达载体pCDNA3.1+zeo(Invitrogen，1600 Faraday Avenue，Carlsbad，CA92008)中。用所述质粒转染HEK 293细胞，然后用500μg/ml零霉素(zeocin)进行选择。通过RT-PCR检测零霉素抗性克隆的UP_11或OM_10表达，然后测试它们刺激cAMP产生的能力。
环化酶测定测定前24小时，将4×105细胞接种到96孔Biocoat细胞培养板(Becton Dickinson，1 Becton Drive，Franklin Lakes，NJ 07417-1886)。然后将所述细胞在37℃下在Krebs-碳酸氢盐缓冲液中温育15分钟。在500μM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)中预处理5分钟，然后用1μM毛喉素或缓冲液刺激12分钟，以测定基础cAMP水平。使用SPA测定(Amersham Pharmacia Biotech，800 Centennial Avenue，Pistcataway，NJ08855)确定cAMP水平。
实施例8人UP_11和OM_10蛋白的表征在本实施例中，将人UP_11和OM_10蛋白的氨基酸序列与已知蛋白的氨基酸序列进行比较，然后鉴定各种基序。人UP_11蛋白是一种包含451个氨基酸残基的蛋白，其氨基酸序列示于SEQ IDNO4中。所述OM_10蛋白是一种包括508个氨基酸残基的蛋白，其氨基酸序列示于SEQ ID NO9中。疏水性分析(图2)表明人UP_11蛋白包含预期的7个跨膜结构域，它们位于氨基酸残基11-16、36-49、69-83、112-121、160-182、242-250和286-287(Peak range，GvH scale，Toppred)。疏水性分析(图2)表明人OM_10蛋白包含预期的7个跨膜结构域，它们位于氨基酸残基34-49、86-90、109-118、155-162、188-214、403-418和437-446(Peak range，GvH scale，Toppred)。
实施例9抗OM_10和抗UP_11多克隆抗体的产生如下产生针对OM_10和UP_11肽片段的多克隆抗体表5用于产生多克隆抗血清的人OM_10肽PLYGWGQAAFDERNA (SEQ ID NO12)CVENEDEEGAEKKEE (SEQ ID NO13)QHEGEVKAKEGRMEA (SEQ ID NO14)CSIDLGEDDMEFGED (SEQ ID NO15)MLKKFFCKEKPPKE (SEQ ID NO16)表6用于产生多克隆抗体的人UP_11肽SSSALFDHALFGEVA (SEQ ID NO17)GAPQTTPHRTFGGG (SEQ ID NO18)CFFKPAPEEELRLPS (SEQ ID NO19)KQEPPAVDFRIPGQIAE(SEQ ID NO20)CLNRQIRGELSKQFV (SEQ ID NO21)实施例10UP_11和OM_10基因打靶载体的构建使用标准技术，用全长人UP_11或OM_10编码序列作为探针，从小鼠脑cDNA文库(从Stratagene购买)分离部分鼠UP_11.或OM_10cDNA克隆。然后再次使用标准技术，用所述鼠UP_11或OM_10cDNA作为探针，筛选由129个小鼠株制备的基因组DNA文库。然后将分离的鼠UP_11或OM_10基因组克隆亚克隆到质粒载体pBluescript(从Stratagene购买)，以进行限制性作图、部分DNA测序和构建打靶载体。为破环所述UP_11或OM_10基因的功能，可以制备打靶载体，其中将非同源DNA插入第一个编码外显子内，在该过程中缺失起始密码子和约600bp UP_11或OM_10编码序列(包括前5个跨膜结构域)，并使得剩余的下游UP_11或OM_10编码序列相对翻译起始而言不在读框内。因此，假如需要从所述UP_11或OM_10基因以其它方式剪接的转录物形成任何翻译产物，它们将不包含GPCR正常功能所需的所有7个跨膜结构域。使用标准分子克隆技术，构建UP_11或OM_10打靶载体。所述打靶载体将包含在起始密码子上游的1-5kb鼠UP_11或OM_10基因组序列，紧接其后是在磷酸甘油激酶启动子控制下的新霉素磷酸转移酶(neo)基因。紧接在所述新霉素盒下游是1-5kb鼠UP_11或OM_10基因组序列，该基因组序列对应于在鼠UP_11或OM_10起始密码子下游的约2kb区。其后是在磷酸甘油激酶启动子控制下的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV tk)基因。该载体中的上游和下游基因组盒采取与所述内源鼠基因同样的5′→3′取向。所述正选择neo基因取代所述UP_11或OM_10序列的第一个编码外显子，并与UP_11或OM_10基因的取向相反，而所述负选择HSV tk基因在所述构建体的3′末端。该构型允许应用正选择和负选择方法进行同源重组(Mansour等，1988)。在将所述质粒转染进胚胎干细胞之前，所述质粒通过限制酶消化线性化。
实施例11胚胎干细胞的转染和分析将胚胎干细胞(例如D3株，Doestschman等，1985)在补充15％胎牛血清、2mM谷氨酸、青霉素(50u/ml)/链霉素(50u/ml)、非必需氨基酸、100uM 2-巯基乙醇和500u/ml白血病抑制因子的Dulbecco氏改良Eagles培养基内培养的新霉素抗性胚胎成纤维细胞饲养层上进行培养。每天更换培养基，每2-3天传代培养细胞，然后通过电穿孔(25uF电容和400伏)，用线性化质粒转染所述细胞。转染后，在非选择性培养基中培养所述转染细胞1-2天。随后，所述细胞在含更昔洛韦和新霉素的培养基中进行培养，其中最后3天在仅含新霉素的情况下进行培养。扩充所述克隆后，在液氮中冷冻等份细胞。从剩余细胞制备DNA，进行基因组DNA分析，以鉴定其中在内源UP_11或OM_10基因和所述打靶构建体之间发生同源重组的克隆。为制备基因组DNA，在100mM Tris HCl pH8.5、5mM EDTA、0.2％SDS、200mM NaCl和100μg蛋白酶K/ml中裂解ES细胞克隆。通过异丙醇沉淀回收DNA，溶解于10mM Tris HCl pH8.0、0.1mM EDTA。为鉴定同源重组克隆，同限制酶消化从所述克隆分离的基因组DNA。限制性消化后，可以将所述DNA在0.8％琼脂糖凝胶上分离，吸印到Hybond N膜上，在65℃下与以下探针杂交结合最接近所述打靶载体5′末端的UP_11或OM_10基因的区的探针，以及结合在所述打靶载体3′末端远端的UP_11或OM_10基因的区的探针。标准杂交后，在65℃下用40mM NaPO4(pH7.2)、1mM EDTA和1％SDS洗涤印迹，然后将所述印迹对X-射线胶片曝光。所述5′探针与野生型UP_11或OM_10等位基因的杂交导致通过具有neo插入片段的突变UP_11或OM_10等位基因的放射自显影而容易辨别的片段。
实施例12UP_11或OM_10缺陷型小鼠的产生使雌性小鼠和雄性小鼠交配，在妊娠第3.5天分离胚泡。给每个胚泡注射来自实施例2所述克隆的10到12个细胞，将7个或8个胚泡转移到假孕雌性子宫内。在妊娠第18天，通过剖腹产接生幼崽，与代孕BALB/c母鼠放在一起饲养。所得雄性和雌性嵌合体分别与雌性和雄性BALB/C小鼠(无色素被毛)交配，通过129ES细胞基因组经由种系传代获得的色素被毛颜色，确定种系遗传。所述色素杂合子有可能携带被破环的UP_11或OM_10等位基因，因此使这些动物交配。孟德尔遗传学预测约25％的后代对于UP_11或OM_10无效突变将是纯合的。通过获得尾基因组DNA，确定所述动物的基因型。
为证实UP_11或OM_10-/-小鼠不表达全长UP_11或OM_10mRNA转录物，从各种组织分离RNA，用UP_11或OM_10cDNA探针通过标准RNA杂交技术进行分析，或通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行分析。使用4M硫氰酸胍，从各种小鼠器官提取RNA，然后如Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))所述，在5.7M CsCl中离心。对脑或胎盘中UP_11或OM_10mRNA表达的RNA印迹分析将证明在来自UP_11或OM_10-/-小鼠的脑或胎盘中检测不到全长UP_11或OM_10mRNA。特异性针对新霉素基因的引物将在UP_11或OM_10+/-动物体内检测到转录物，但在+/+动物体内检测不到转录物。使用RNA印迹分析和RT-PCR分析证实纯合的UP_11或OM_10基因破环导致在UP_11或OM_10-/-小鼠体内检测不到全长UP_11或OM_10mRNA转录物。为检查UP_11或OM_10缺陷型小鼠体内的UP_11或OM_10蛋白表达，使用标准技术，在来自分离组织(包括脑和胎盘)的裂解物上进行蛋白质印迹分析。这些结果将证实纯合的UP_11或OM_10基因破环导致在-/-小鼠体内检测不到UP_11或OM_10蛋白。
实施例13对UP_11或OM_10产生的抑制设计作为本发明组合物的RNA分子在本实验中，所有RNA分子长约600nt，并且所有RNA分子设计为不能产生功能性UP_11或OM_10蛋白。所述分子没有帽子序列和poly-A序列；不存在天然起始密码子，所述RNA不编码全长产物。设计下列RNA分子(1)与部分UP_11或OM_10鼠信使RNA(mRNA)同源的单链(ss)有义多核苷酸序列；(2)与部分UP_11或OM_10鼠mRNA互补的ss反义RNA多核苷酸序列，(3)包含有义和反义部分UP_11或OM_10鼠mRNA多核苷酸序列的双链(ds)RNA分子，(4)与部分UP_11或OM_10鼠异源RNA(hnRNA)同源的ss有义RNA多核苷酸，(5)与部分UP_11或OM_10鼠hnRNA互补的ss反义RNA多核苷酸序列，(6)包含有义和反义UP_11或OM_10鼠hnRNA多核苷酸序列的ds RNA分子，(7)与部分UP_11或OM_10启动子的上链同源的ss鼠RNA多核苷酸序列，(8)与部分UP_11或OM_10启动子的下链同源的ss鼠RNA多核苷酸序列，以及(9)包含与UP_11或OM_10启动子的上下两条链同源的鼠多核苷酸序列的ds RNA分子。
通过对在一个末端携带T7启动子的PCR产物进行的T7 RNA聚合酶转录，可以产生以上(1)-(9)的不同RNA分子。在需要有义RNA的情况下，将T7启动子置于PCR正向引物的5′端。在需要反义RNA的情况下，将T7启动子置于PCR反向引物的5′端。当需要dsRNA时，在T7转录反应中可以包括这两种类型的PCR产物。或者，可以将有义RNA和反义RNA在转录后在退火条件下混合在一起，形成ds RNA。
编码折回类型RNA的表达质粒的构建可以使用本申请中公开的信息，构建编码部分UP_11或OM_10基因反向重复的表达质粒。可以通过PCR扩增制备编码UP_11或OM_10折回转录物的DNA片段，将其导入载体的合适限制位点，所述载体包括转录所述UP_11或OM_10折回转录物所需的元件。所述DNA片段将编码包含长至少约600核苷酸的UP_11或OM_10基因片段，其后是至少长10bp但不超过200bp的间隔区序列，然后是所选UP_11或OM_10序列的反向互补序列。用所述构建体转染的CHO细胞将仅产生折回RNA，其中互补靶基因序列形成双螺旋。
测定给Balb/c小鼠(5只小鼠/组)按范围10μg-500μg的剂量颅内注射上述鼠UP_11或OM_10链特异性RNA或对照。在三周时间内，每四天从所述小鼠的样品收获脑组织，使用本文公开的抗体测定UP_11或OM_10水平，或者通过RNA印迹分析检测降低的RNA水平。
根据本发明，接受源于UP_11或OM_10mRNA、UP_11或OM_10hnRNA的ds RNA分子以及源于UP_11或OM_10启动子的ds RNA的小鼠证明UP_11或OM_10产生的降低或抑制。除非所述RNA分子具有形成一定水平双链性的能力，否则在接受单链UP_11或OM_10衍生的RNA分子的小鼠血清中，观察到中度抑制效应(如果有的话)。
实施例14本发明预防疾病的方法体内测定用实施例10中描述的没有产生UP_11或OM_10蛋白的能力的UP_11或OM_10R特异性RNA分子和UP_11或OM_10特异性RNA分子作为对照，可以评价小鼠通过利用本发明注射的UP_11或OM_10特异性RNA分子对UP_11或OM_10相关疾病的保护。
通过给Balb/c小鼠(5只小鼠/组)按10-500μg RNA剂量范围颅内注射所述RNA分子，对所述小鼠进行免疫。在注射RNA后第1、2、4和7天，观察所述小鼠UP_11或OM_10相关表型改变的体征。
根据本发明，因为接受本发明包含UP_11或OM_10序列的dsRNA分子的小鼠可能显示保护所述小鼠免患UP_11或OM_10相关疾病。接受对照RNA分子的小鼠可能不受保护。预期接受包含UP_11或OM_10序列的ss RNA分子的小鼠可能受到最小保护(如果有的话)，除非这些分子具有在体内至少部分变成双链化的能力。
根据本发明，因为本发明的dsRNA分子没有产生UP_11或OM_10蛋白的能力，因此通过将所述RNA分子传递到动物体内而提供的保护是由于基因特异性的非免疫介导机制所致。
实施例15果蝇和中国仓鼠培养细胞内的RNA干涉为观察RNA干涉的效应，可以鉴定并使用天然表达UP_11或OM_10的细胞系，或者通过众所周知的方法(如本文概述)构建表达UP_11或OM_10转基因的细胞系。例如，描述果蝇细胞和CHO细胞的应用。将果蝇S2细胞和中国仓鼠CHO-K1细胞分别在Schneider培养基(Gibco BRL)中于25℃进行培养，或者在Eagle氏培养基(GibcoBRL)中于37℃进行培养。这两种培养基中都可以补充10％热失活胎牛血清(Mitsubishi Kasei)和抗生素(10单位/ml青霉素(Meiji)和50μg/ml链霉素(Meiji))。
转染和RNAi活性测定将S2细胞和CHO-K1细胞分别以1×106和3×105细胞/ml接种到24孔板各孔内。1天后，使用磷酸钙沉淀法，用UP_11或OM_10dsRNA(80pg到3μg)转染细胞。转染后20小时收获细胞，测量UP_11或OM_10基因表达。
实施例16脊椎动物细胞系内的反义抑制可以使用标准技术进行反义，其中包括应用试剂盒如Sequitur Inc.(Natick，MA)的试剂盒。以下程序利用硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸和阳离子脂质。选择与所述mRNA 5′端互补的寡聚物，以便包括翻译起始位点。
1)在接种所述细胞前，通过将0.2％过滤除菌的明胶温育30分钟，然后用PBS洗涤一次，用所述明胶包被所述板壁，以促进贴壁。让细胞生长至40-80％汇合。用Hela细胞作为阳性对照。
2)用无血清培养基(例如Opti-MEMA，得自Gibco-BRL)洗涤所述细胞。
3)与合适的阳离子脂质(例如Oligofectibn A，得自Sequitur，Inc.)混合，然后加入到聚苯乙烯管内不含抗生素的无血清培养基中。根据所述脂质的来源，其浓度可以变化。将100μM贮液(2μl/ml)的寡聚体加入到盛有无血清培养基/阳离子脂质的管内，至终浓度约为200nM(范围50-400nM)，然后颠倒混合。
4)将所述寡聚体/培养基/阳离子脂质溶液加入到所述细胞中(在24孔板上，每孔约0.5mL)，然后于37℃温育4小时。
5)用培养基温和洗涤所述细胞，然后加入完全生长培养基。让所述细胞生长24小时。一定百分比的所述细胞可能会脱离该板，或者裂解。
收获细胞，然后测量UP_11或OM_10基因表达。
实施例17通过基因打靶产生转染细胞株当转染DNA通过同源重组事件或者整合到染色体DNA序列中或者部分取代染色体DNA序列时，发生基因打靶。虽然所述事件可能出现在任何给定转染实验中，但是当它们通常被大量质粒DNA通过非同源或非法重组而整合的事件所屏蔽。
在人类细胞中产生用于选择基因打靶事件的构建体一种选择中靶事件的方法是根据由于转染DNA整合而引起的基因功能损失进行遗传选择。人类HPRT基因座编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶。根据Hprt细胞在含核苷类似物6-硫代鸟嘌呤(6-TG)的培养基中的生长情况进行选择携带野生型(HPRT+)等位基因的细胞被6-TG杀死，而携带突变型(hprt-)等位基因的细胞可以存活。因此，在6-TG培养基中可以选择携带破环HPRT基因功能的中靶事件的细胞。
为构建用于打靶HPRT基因座的质粒，可以将从HPRT序列(Genebank名称HUMHPRTB；Edwards等，1990)的位置11,960-18,869延伸并且包括所述HPRT基因外显子2和3的6.9kb HindIII片段亚克隆到pUC12的HindIII位点中。在所述HPRT基因片段外显子3内的单一XhoI位点切割所得克隆，插入包含来自pMClNeo(Stratagene)的neo基因并且外显子3编码序列被破环的1.1kb SalI-XhoI片段。选择一个取向，即neo转录的方向与HPRT转录方向相反，命名为pE3Neo。用neo被破环的形式取代正常HPRT外显子3将产生hprt-，6-TG抗性表型。所述细胞也抗G418。
将有治疗意义的基因定向插入到人类基因组中的构建体的产生及其在基因打靶中的应用可以用pE3Neo的变异体打靶UP_11或OM_10基因至受体原代或二代细胞基因组内的特定位置，所述pE3Neo的变异体中，在HPRT编码区内、邻近neo基因或其附近插入UP_11或OM_10基因。可以构建所述pE3Neo的变异体，打靶UP_11或OM_10基因至HPRT基因座。
构建包含UP_11或OM_10基因并连接小鼠金属硫蛋白(mMT)启动子的DNA片段。用在neo片段和HPRT外显子3的接头部位(所述插入片段的3′连接到外显子3)进行切割的酶消化pE3Neo。可以将线性化pE3Neo片段连接到所述UP_11或OM_10-mMT片段。
通过限制酶分析，筛选用所述连接混合物转染产生的细菌菌落中所述UP_11或OM_10-mMT片段的单拷贝插入。选择其中UP_11或OM_10DNA与neo基因以相同方向转录的插入突变体，命名为pE3Neo/UP_11或OM_10。消化pE3Neo/UP_11或OM_10，释放包含HPRT、neo和mMT-UP_11或OM_10序列的片段。处理经消化的DNA，转染到原代或二代人成纤维细胞中。选择G418rTGr菌落，分析所述mMT-UP_11或OM_10和neo序列定向插入到所述HPRT基因中。可以使用本文别处描述的抗体，测定各个菌落的UP_11或OM_10表达。
可以用pE3Neo/UP_11或OM_10转染二代人成纤维细胞，分析硫代鸟嘌呤抗性菌落的稳定UP_11或OM_10表达，以及进行限制酶分析和DNA印迹杂交分析。
可以扩充利用同源重组打靶UP_11或OM_10基因至细胞基因组DNA内的特定位置，使其对于通过插入基因而产生具有药用目的的产物(例如药物，基因治疗)更加有用，由此通过将细胞暴露于合适的药物选择方案，可以选择包含所述基因扩增拷贝的细胞。例如，可以在紧接pE3neo/UP_11或OM_10内的UP_11或OM_10或neo基因位置插入dhfr、ada或CAD基因，修饰pE3neo/UP_11或OM_10。用所述质粒转染原代细胞、二代细胞或无限增殖化细胞，然后鉴定正确的中靶事件。用适于选择包含扩增基因的细胞的浓度逐渐增加的药物进一步处理这些细胞(对于dhfr，选择剂是氨甲蝶呤，对于CAD，选择剂是N-(磷酸乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)，而对于ada，选择剂是腺嘌呤核苷(例如亚硝基羟基丙氨酸)。用这种方式，有治疗意义的基因的整合将与选择扩增拷贝的基因一起共扩增。因此，对于产生有治疗用途的基因的细胞的基因工程，通过预先选择所述打靶构建体整合的位点和所述扩增拷贝在扩增细胞内的位点，可以容易地进行控制。
在原代、二代和无限增殖化人成纤维细胞中，构建用于使UP_11或OM_10基因置于小鼠金属硫蛋白启动子控制之下的打靶质粒下面用于举例说明本发明的一个实施方案，其中改变UP_11或OM_10基因上游的正常正调节序列和负调节序列，允许在原代、二代或无限增殖化人成纤维细胞或不以显著量表达UP_11或OM_10的其它细胞内表达UP_11或OM_10。
选择位于UP_11或OM_10编码区上游的单一SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10序列，然后连接到小鼠金属硫蛋白启动子，作为打靶序列。通常，通过已知方法将来自mMT-I基因的1.8kb EcoRI-BglII(不包含mMT编码序列；Hamer和Walling，1982；也可以通过已知方法，使用根据对Genbank得到的mXT序列(即MUSMTI、MUSMTIP、MUSMTIPRM)的分析而设计的PCR引物，从小鼠基因组DNA分离该片段)平端化，与5′UP_11或OM_10序列连接。分析所得克隆的取向，使用合适DNA打靶原代和二代人成纤维细胞或其它不以显著量表达UP_11或OM_10的细胞。
当需要修饰、缺失和/或取代在所述起始靶序列上游的负调节元件或增强子时，可以使用其它上游序列。
上述克隆策略允许体外修饰UP_11或OM_10上游的序列，以随后定向转染原代、二代或无限增殖化人成纤维细胞或不以显著量表达UP_11或OM_10的其它细胞。所述策略描述简单地插入mMT启动子，允许缺失负调节区，以及允许缺失负调节区并用具有宽宿主细胞活性的增强子取代所述负调节区。
对邻接UP_11或OM_10基因的序列进行打靶并通过筛选分离被击中靶的原代、二代和无限增殖化人成纤维细胞可以通过苯酚抽提和乙醇沉淀，纯化包含mMT启动子和UP_11或OM_10上游序列的打靶序列，然后转染到原代或二代人成纤维细胞中。将转染细胞接种到150mm培养皿内的人成纤维细胞营养培养基中。48小时后，将细胞以10,000个细胞/cm2(约20,000个细胞/孔)的密度接种到24孔板内，以致于当打靶以每106个可克隆细胞出现1个事件的频率发生时，分离一个表达集落将需要约50孔细胞。转染DNA已经打靶至UP_11或OM_10上游同源区的DNA将表达处于mMT启动子控制之下的UP_11或OM_10。10天后，测定全孔上清液中UP_11或OM_10的表达。使用已知方法，从表现UP_11或OM_10合成的孔分离克隆，通常通过测定分离到各个孔或板的不均一细胞群体的级分，测定这些阳性孔的组分，然后根据需要重复，最后通过筛选以每孔一个细胞接种的96孔微量滴定板，分离中靶集落。也可以使用特异性针对所述打靶序列的引物，通过PCR分析扩增片段的来自整个板裂解物的DNA。用胰蛋白酶消化阳性平板，以顺序降低的稀释度再次接种，根据需要重复DNA制备和PCR步骤，分离中靶细胞。
对邻接人UP_11或OM_10基因的序列进行打靶并通过正选择系统或正/负混合选择系统分离被击中靶的原代、二代和无限增殖化人成纤维细胞构建5′UP_11或OM_10-mMT打靶序列和用其它上游序列衍生所述序列而获得的衍生物可以包括邻近mMT启动子插入neo基因的额外步骤。此外，可以插入负选择标记，例如gpt(来自PMSG(Pharmacia)或其它合适来源)。在前一种情况下，分离G418r克隆，通过PCR扩增进行筛选，或者通过对从克隆库制备的DNA的限制酶分析和DNA印迹杂交分析，鉴定中靶克隆。在后一种情况下，将G418rU克隆接种在含6-硫代黄嘌呤的培养基上，针对gpt基因的整合进行选择(Besnard等，1987)。此外，可以将HSV-TK基因置于与gpt相反方向的插入片段内，通过让细胞在含400μg/ml G418、100μM 6-硫代黄嘌呤和25μg/ml更昔洛韦的人成纤维细胞营养培养基内生长，允许对neo以及gpt和TK进行选择。所述双负选择将为真正的中靶事件提供接近绝对的选择，而DNA印迹分析提供最后确认。
本文描述的打靶方法也可以用于激活无限增殖化人类细胞(例如HT1080成纤维细胞、HeLa细胞、MCF-7乳腺癌细胞、K-562白血病细胞、KB癌细胞或2780AD卵巢癌细胞)中的UP_11或OM_10表达，以产生UP_11或OM_10，用于常规递药。
可以修饰在本实施例中描述和使用的打靶构建体，以包括用于选择细胞的可扩增选择标记(例如ada、dhfr或CAD)，其中扩增所述活化内源基因和所述可扩增选择标记。所述表达或能够表达编码UP_11或OM_10产物的内源基因的细胞可以用于产生蛋白，以用于常规递药或用于基因治疗。
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<400>1gtcgacccac gcgtccgagt gggtcaggct cctgcacctc tcacgtctcc tgcttcttag60cagtcaccaa ggcagaccct gcagctacct ccggccagaa aggggatgag cttctgatcc120ttcagctgcc tggcctggcg ctctgtacgc agacaaacct gcccaagagg ctccagtggg180aggtgccccc tacgaaacca ggaagcctgg gcctgggctc gccatcccag ggtcgctgga240ctaggatggg ggatgggcct gtgacaggag gtaccctggg tgccctcttt cggcccc 297atg gag tcc tca ccc atc ccc cag tca tca ggg aac tct tcc act ttg 345Met Glu Ser Ser Pro Ile Pro Gln Ser Ser Gly Asn Ser Ser Thr Leu1 5 10 15ggg agg gtc cct caa acc cca ggt ccc tct act gcc agt ggg gtc ccg 393Gly Arg Val Pro Gln Thr Pro Gly Pro Ser Thr Ala Ser Gly Val Pro
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<221>外显子
<222>(671)..(2026)<223>
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Phe Gly Glu Val Ala Cys Arg Leu Tyr Leu Phe Leu Ser Val Cys Phe110 115 120 125gtc agc ctg gcc atc ctc tcg gtg tca gcc atc aat gtg gag cgc tac1093Val Ser Leu Ala Ile Leu Ser Val Ser Ala Ile Asn Val Glu Arg Tyr130 135 140tat tac gta gtc cac ccc atg cgc tac gag gtg cgc atg acg ctg ggg1141Tyr Tyr Val Val His Pro Met Arg Tyr Glu Val Arg Met Thr Leu Gly145 150 155ctg gtg gcc tct gtg ctg gtg ggt gtg tgg gtg aag gcc ttg gcc atg1189Leu Val Ala Ser Val Leu Val Gly Val Trp Val Lys Ala Leu Ala Met160 165 170gct tct gtg cca gtg ttg gga agg gtc tcc tgg gag gaa gga gct ccc1237Ala Ser Val Pro Val Leu Gly Arg Val Ser Trp Glu Glu Gly Ala Pro175 180 185agt gtc ccc cca ggc tgt tca ctc cag tgg agc cac agt gcc tac tgc1285Ser Val Pro Pro Gly Cys Ser Leu Gln Trp Ser His Ser Ala Tyr Cys190 195 200 205cag ctt ttt gtg gtg gtc ttt gct gtc ctt tac ttt ctg ttg ccc ctg1333Gln Leu Phe Val Val Val Phe Ala Val Leu Tyr Phe Leu Leu Pro Leu210 215 220ctc ctc ata ctt gtg gtc tac tgc agc atg ttc cga gtg gcc cgc gtg1381Leu Leu Ile Leu Val Val Tyr Cys Ser Met Phe Arg Val Ala Arg Val225 230 235gct gcc atg cag cac ggg ccg ctg ccc acg tgg atg gag aca ccc cgg1429Ala Ala Met Gln His Gly Pro Leu Pro Thr Trp Met Glu Thr Pro Arg240 245 250caa cgc tcc gaa tct ctc agc agc cgc tcc acg atg gtc acc agc tca1477Gln Arg Ser Glu Ser Leu Ser Ser Arg Ser Thr Met Val Thr Ser Ser255 260 265ggg gcc ccc cag acc acc cca cac cgg acg ttt ggg gga ggg aaa gca1525Gly Ala Pro Gln Thr Thr Pro His Arg Thr Phe Gly Gly Gly Lys Ala270 275 280 285gca gtg gtt ctc ctg gct gtg ggg gga cag ttc ctg ctc tgt tgg ttg1573Ala Val Val Leu Leu Ala Val Gly Gly Gln Phe Leu Leu Cys Trp Leu290 295 300ccc tac ttc tct ttc cac ctc tat gtt gcc ctg agt gct cag ccc att1621Pro Tyr Phe Ser Phe His Leu Tyr Val Ala Leu Ser Ala Gln Pro Ile
305 310 315tca act ggg cag gtg gag agt gtg gtc acc tgg att ggc tac ttt tgc1669Ser Thr Gly Gln Val Glu Ser Val Val Thr Trp Ile Gly Tyr Phe Cys320 325 330ttc act tcc aac cct ttc ttc tat gga tgt ctc aac cgg cag atc cgg1717Phe Thr Ser Asn Pro Phe Phe Tyr Gly Cys Leu Asn Arg Gln Ile Arg335 340 345ggg gag ctc agc aag cag ttt gtc tgc ttc ttc aag cca gct cca gag1765Gly Glu Leu Ser Lys Gln Phe Val Cys Phe Phe Lys Pro Ala Pro Glu350 355 360 365gag gag ctg agg ctg cct agc cgg gag ggc tcc att gag gag aac ttc1813Glu Glu Leu Arg Leu Pro Ser Arg Glu Gly Ser Ile Glu Glu Asn Phe370 375 380ctg cag ttc ctt cag ggg act ggc tgt cct tct gag tcc tgg gtt tcc1861Leu Gln Phe Leu Gln Gly Thr Gly Cys Pro Ser Glu Ser Trp Val Ser385 390 395cga ccc cta ccc agc ccc aag cag gag cca cct gct gtt gac ttt cga1909Arg Pro Leu Pro Ser Pro Lys Gln Glu Pro Pro Ala Val Asp Phe Arg400 405 410atc cca ggc cag ata gct gag gag acc tct gag ttc ctg gag cag caa1957Ile Pro Gly Gln Ile Ala Glu Glu Thr Ser Glu Phe Leu Glu Gln Gln415 420 425ctc acc agc gac atc atc atg tca gac agc tac ctc cgt cct gcc gcc2005Leu Thr Ser Asp Ile Ile Met Ser Asp Ser Tyr Leu Arg Pro Ala Ala430 435 440 445tca ccc cgg ctg gag tca tga tgggccgctg gacactcgga gggatatggg 2056Ser Pro Arg Leu Glu Ser450gctggggcca gttatgattg caaggaccac cttgtgggat caccttttcc cagctggcta 2116gggctgaggc tggggtctct gcacacagct tttgcttagt gtttcctggg tcaggaacag 2176agccaacagg atgaacgtgt gcaaaagcct tggacttggc tgtgatcttt gactgctagg 2236ggagggaacc tgggtatggt gagacggtga cgagagaaaa gggtcacaaa ggactggcct 2296ccctgatctc tctcctcatg gcagcgaccc acctccagtc ccctggacaa tcgggtacaa 2356gagacttaag gttgggcatg ggaagggtgg ggtttccatg atccattaaa tgccttccta 2416ctcccattca tcgctctcaa aattagcttc agtgacaaag acttaaatct ctctcctatc 2476tgcagcactg ggttggagag agggcacggg agttggtctt ggctgttcat tgattgagac 2536tgtaggaact gtgttggttg gtattggtgg tggtattttc aacaaacagg gaataactgc 2596
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<221>外显子<222>(684)..(2033)<223>
<400>5gtcgacccac gcgtccgccc acgcgtccgg aggcatcagc tgagaagagc tatcacatag60gcgctgggag ctgctcagca aagatgcctt catgaggaaa ctggagtccg gaagagttgc120agagtgagta atacccagac ctggaactag aagctgaatc tcatgctcct tctacttccc180attctgatga gaaaatcaga aatttcacaa aatcaaccct aaagccagag cactgtccta240gagcaaagca ggaccctgga gaggggagac aggaggattt agaattgccc tcagaaggga300agaagaacaa ggagaactag gaaagaacga acatggagaa ctaaaaaaga aagtgagaaa360agaggtgcca gaggtcactc ggaaggccac tgcagagtat gtgaggatcc tacacagtgc420ttcccatcac cgggactgac cccggggcta ccttctgaca gaaactggac atgacctact480gagtttggag cagcctggcc tggcactctg tctacatagg aacccagctt ggaaggctag540tgattagagc ctgccttaca ggctccagaa ggccccccaa caaaattggg aagcctggac600ctgggcttac atcccagggt tgtggagtag gatgggggat gggcctgtaa caggaagtgc660cctgggtgtc ctctttcggc ccc atg gag tcc tca ccc atc ccc cag tca tca713Met Glu Ser Ser Pro Ile Pro Gln Ser Ser1 5 10
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1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下核酸序列所述核酸序列编码包含SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽。
2.权利要求1的多核苷酸，所述多核苷酸还包含编码异源蛋白的核酸序列。
3.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求1的多核苷酸。
4.权利要求3的载体，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核酸序列。
5.一种基因工程宿主细胞，所述基因工程宿主细胞用权利要求3的载体转染、转化或感染。
6.权利要求5的宿主细胞，其中所述宿主细胞是一种哺乳动物宿主细胞。
7.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下核酸序列所述核酸序列编码包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的多肽。
8.权利要求7的多核苷酸，所述多核苷酸还包含编码异源蛋白的核酸序列。
9.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求7的多核苷酸。
10.权利要求9的载体，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的核酸序列。
11.一种基因工程宿主细胞，所述基因工程宿主细胞用权利要求9的载体转染、转化或感染。
12.权利要求11的宿主细胞，其中所述宿主细胞是一种哺乳动物宿主细胞。
13.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下核酸序列所述核酸序列编码包含SEQ ID NO9的氨基酸序列的多肽。
14.权利要求13的多核苷酸，所述多核苷酸还包含编码异源蛋白的核酸序列。
15.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求13的多核苷酸。
16.权利要求15的载体，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO8的核酸序列。
17.一种基因工程宿主细胞，所述基因工程宿主细胞用权利要求15的载体转染、转化或感染。
18.权利要求17的宿主细胞，其中所述宿主细胞是一种哺乳动物宿主细胞。
19.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下核酸序列所述核酸序列编码包含SEQ ID NO11的氨基酸序列的多肽。
20.权利要求19的多核苷酸，所述多核苷酸还包含编码异源蛋白的核酸序列。
21.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求19的多核苷酸。
22.权利要求21的载体，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO10的核酸序列。
23.一种基因工程宿主细胞，所述基因工程宿主细胞用权利要求21的载体转染、转化或感染。
24.权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞是一种哺乳动物宿主细胞。
25.一种分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO4的氨基酸序列。
26.一种分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO7的氨基酸序列。
27.一种分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO9的氨基酸序列。
28.一种分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO11的氨基酸序列。
29.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1的核酸序列或其简并变异体。
30.权利要求41的多核苷酸，其中SEQ ID NO1的编码区包含核苷酸298到1,653。
31.一种RNA分子，所述RNA分子与包含SEQ ID NO1的核酸序列或其简并变异体的多核苷酸反义。
32.权利要求31的RNA，其中所述RNA与SEQ ID NO1从约核苷酸1到约核苷酸297或者从约核苷酸1,654到约核苷酸3,824的多核苷酸反义。
33.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO2的核酸序列或其简并变异体。
34.权利要求33的多核苷酸，其中SEQ ID NO2的编码区包含核苷酸1到1,313。
35.一种RNA分子，所述RNA分子与包含SEQ ID NO2的核酸序列或其简并变异体的多核苷酸反义。
36.权利要求35的RNA，其中所述RNA与SEQ ID NO2从约核苷酸1,314到约核苷酸3,405的多核苷酸反义。
37.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO3的核酸序列或其简并变异体。
38.权利要求37的多核苷酸，其中SEQ ID NO3的编码区包含核苷酸671到2,026。
39.一种RNA分子，所述RNA分子与包含SEQ ID NO3的核酸序列或其简并变异体的多核苷酸反义。
40.权利要求39的RNA，其中所述RNA与SEQ ID NO3从约核苷酸1到约核苷酸670或者从约核苷酸2,027到约核苷酸3,779的多核苷酸反义。
41.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO5的核酸序列或其简并变异体。
42.权利要求41的多核苷酸，其中SEQ ID NO5的编码区包含核苷酸684到2,033。
43.一种RNA分子，所述RNA分子与包含SEQ ID NO5的核酸序列或其简并变异体的多核苷酸反义。
44.权利要求43的RNA，其中所述RNA与SEQ ID NO5从约核苷酸1到约核苷酸683或者从约核苷酸2,034到约核苷酸3,384的多核苷酸反义。
45.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO6的核酸序列或其简并变异体。
46.权利要求45的多核苷酸，其中SEQ ID NO6的编码区包含核苷酸685到2,034。
47.一种RNA分子，所述RNA分子与包含SEQ ID NO6的核酸序列或其简并变异体的多核苷酸反义。
48.权利要求47的RNA，其中所述RNA与SEQ ID NO6从约核苷酸1到约核苷酸684或者从约核苷酸2,034到约核苷酸3,384的多核苷酸反义。
49.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO8的核酸序列或其简并变异体。
50.权利要求49的多核苷酸，其中SEQ ID NO8的编码区包含核苷酸332到1,858。
51.一种RNA分子，所述RNA分子与包含SEQ ID NO8的核酸序列或其简并变异体的多核苷酸反义。
52.权利要求51的RNA，其中所述RNA与SEQ ID NO8从约核苷酸1到约核苷酸331或者从约核苷酸1,859到约核苷酸4,718的多核苷酸反义。
53.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO10的核酸序列或其简并变异体。
54.权利要求53的多核苷酸，其中SEQ ID NO10的编码区包含核苷酸250到1,785。
55.一种RNA分子，所述RNA分子与包含SEQ ID NO10的核酸序列或其简并变异体的多核苷酸反义。
56.权利要求55的RNA，其中所述RNA与SEQ ID NO10从约核苷酸1到约核苷酸249或者从约核苷酸1,786到约核苷酸5,386的多核苷酸反义。
57.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含可以与SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列。
58.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含可以与SEQ ID NO2或SEQ ID NO2的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列。
59.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含可以与SEQ ID NO3或SEQ ID NO3的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列。
60.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含可以与SEQ ID NO5或SEQ ID NO5的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列。
61.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含可以与SEQ ID NO6或SEQ ID NO6的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列。
62.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含可以与SEQ ID NO8或SEQ ID NO8的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列。
63.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含可以与SEQ ID NO10或SEQ ID NO10的互补序列在严格性条件下杂交的核酸序列。
64.一种抗体，所述抗体与依照权利要求25、26、27或28的蛋白选择性结合。
65.一种选择性结合OM_10多肽的抗体，其中所述抗体结合包含SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15或SEQ ID NO16的氨基酸序列。
66.一种选择性结合OM_10多肽片段的抗体，所述OM_10多肽片段选自SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ IDNO15和SEQ ID NO16。
67.一种人OM_10多肽，所述人OM_10多肽包含选自以下的一种或多种表位SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15和SEQ ID NO16。
68.一种选择性结合UP_11多肽的抗体，其中所述抗体结合包含SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20或SEQ ID NO21的氨基酸序列。
69.一种选择性结合UP_11多肽片段的抗体，所述UP_11多肽片段选自SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ IDNO20和SEQ ID NO21。
70.一种人UP_11多肽，所述人UP_11多肽包含选自以下的一种或多种表位SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQID NO20和SEQ ID NO21。
71.一种转基因动物，所述转基因动物包含编码GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。
72.一种抑制细胞中GPCR多核苷酸表达的方法，所述多核苷酸选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10，所述方法包括给所述细胞提供与所述多核苷酸反义的核酸分子。
73.一种测定试验化合物对GPCR多肽活性的影响的方法，所述方法包括下述步骤(a)提供转基因动物，所述转基因动物包含编码GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽具有选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；(b)将一种试验化合物给予所述动物；然后(c)在存在或不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对GPCR活性的影响。
74.一种测定试验化合物对GPCR多肽活性的影响的方法，所述方法包括下述步骤(a)提供包含GPCR多肽的重组细胞，所述GPCR多肽具有选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；(b)使所述细胞与一种试验化合物接触；然后(c)在存在或不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对所述GPCR活性的影响。
75.一种治疗需要增强GPCR活性的受治疗者的方法，所述方法包括(a)给予所述受治疗者治疗有效量的一种所述GPCR受体激动剂；和/或(b)以在体内有效产生GPCR活性的方式，给予所述受治疗者一种编码GPCR多肽的多核苷酸，所述GPCR多肽包含选自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。
76.一种治疗需要抑制GPCR活性的受治疗者的方法，所述方法包括(a)给予所述受治疗者治疗有效量的一种GPCR受体拮抗剂；和/或(b)给予所述受治疗者一种多核苷酸，所述多核苷酸抑制编码GPCR多肽的多核苷酸的表达，所述GPCR多肽包含选自SEQ IDNO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；和/或(c)给予所述受治疗者治疗有效量的一种与GPCR竞争其配体的多肽。
77.一种诊断受治疗者的疾病或对疾病的易感性的方法，所述疾病与所述受治疗者体内的GPCR表达或活性有关，所述方法包括(a)测定在编码GPCR多肽的多核苷酸内是否存在突变，所述GPCR多肽包含选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列；和/或(b)测定来自所述受治疗者的样品中存在GPCR表达，其中所表达的GPCR是编码包含选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列的GPCR多肽的多核苷酸。
78.一种治疗需要抑制GPCR活性的受治疗者的方法，所述治疗包括给予所述患者治疗有效量的一种结合GPCR多肽胞外部分的抗体，所述GPCR多肽包含选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9和SEQ ID NO11的氨基酸序列。
79.一种分离的哺乳动物基因，所述哺乳动物基因包含SEQ IDNO1的核酸序列。
80.权利要求79的基因，其中所述基因编码包含SEQ ID NO4的氨基酸的UP_11蛋白。
81.一种分离的哺乳动物基因，所述哺乳动物基因包含SEQ IDNO2的核酸序列。
82.权利要求81的基因，其中所述基因编码包含SEQ ID NO4的氨基酸的UP_11蛋白。
83.一种分离的哺乳动物基因，所述哺乳动物基因包含SEQ IDNO3的核酸序列。
84.权利要求83的基因，其中所述基因编码包含SEQ ID NO4的氨基酸的UP_11蛋白。
85.一种分离的哺乳动物基因，所述哺乳动物基因包含SEQ IDNO5的核酸序列。
86.权利要求85的基因，其中所述基因编码包含SEQ ID NO7的氨基酸的UP_11蛋白。
87.一种分离的哺乳动物基因，所述哺乳动物基因包含SEQ IDNO6的核酸序列。
88.权利要求87的基因，其中所述基因编码包含SEQ ID NO7的氨基酸的UP_11蛋白。
89.一种分离的哺乳动物基因，所述哺乳动物基因包含SEQ IDNO8的核酸序列。
90.权利要求89的基因，其中所述基因编码包含SEQ ID NO9的氨基酸的OM_10蛋白。
91.一种分离的哺乳动物基因，所述哺乳动物基因包含SEQ IDNO10的核酸序列。
92.权利要求91的基因，其中所述基因编码包含SEQ ID NO11的氨基酸的OM_10蛋白。
93.一种激活哺乳动物细胞基因组DNA中内源OM_10基因表达并扩增所述基因的方法，其中所述OM_10基因在获得的所述细胞中不以显著水平表达，所述方法包括下述步骤(a)用包含以下序列的多核苷酸序列转染细胞(1)通常并不与所获得的细胞中所述内源OM_10基因功能性连接的外源多核苷酸调节序列；(2)与所述细胞中预选位点的OM_10基因序列同源的多核苷酸序列；(3)编码选择标记的可扩增多核苷酸序列，由此产生包含所述多核苷酸序列的细胞；(b)在适于步骤(a)(2)的多核苷酸序列与OM_10基因序列发生同源重组的条件下，维持步骤(a)中产生的细胞，由此产生同源重组哺乳动物细胞，所述同源重组哺乳动物细胞具有整合到所述OM_10基因中的步骤(a)(1)、(a)(2)和(a)(3)的多核苷酸序列和与所述内源基因功能性连接的步骤(a)(1)的外源多核苷酸序列；然后(c)在根据编码选择标记的可扩增多核苷酸序列的扩增进行选择的条件下，培养步骤(b)的细胞，由此共扩增所述可扩增多核苷酸序列以及功能性连接步骤(a)(1)的多核苷酸序列的所述内源OM_10基因，由此产生同源重组细胞，所述同源重组细胞含有编码选择标记的已扩增的多核苷酸序列以及共扩增的功能性连接步骤(a)(1)的多核苷酸序列的内源OM_10基因，所述同源重组细胞表达所述共扩增的OM_10基因。
94.一种同源重组细胞，所述同源重组细胞按照权利要求83的方法产生。
95.一种激活哺乳动物细胞基因组DNA中内源UP_11基因表达并扩增所述基因的方法，其中所述UP_11基因在获得的所述细胞中不以显著水平表达，所述方法包括下述步骤(a)用包含以下序列的多核苷酸序列转染细胞(1)通常并不与所获得的细胞中所述内源UP_11基因功能性连接的外源多核苷酸调节序列；(2)与所述细胞中预选位点的UP_11基因序列同源的多核苷酸序列；(3)编码选择标记的可扩增多核苷酸序列，由此产生包含所述多核苷酸序列的细胞；(b)在适于步骤(a)(2)的多核苷酸序列与UP_11基因序列发生同源重组的条件下，维持步骤(a)中产生的细胞，由此产生同源重组哺乳动物细胞，所述同源重组哺乳动物细胞具有整合到所述UP_11基因中的步骤(a)(1)、(a)(2)和(a)(3)的多核苷酸序列和与所述内源基因功能性连接的步骤(a)(1)的外源多核苷酸序列；然后(c)在根据编码选择标记的可扩增多核苷酸序列的扩增进行选择的条件下，培养步骤(b)的细胞，由此共扩增所述可扩增多核苷酸序列以及有效连接步骤(a)(1)的多核苷酸序列的所述内源UP_11基因，由此产生同源重组细胞，在所述同源重组细胞包含编码选择标记的已扩增的多核苷酸序列以及共扩增的功能性连接步骤(a)(1)的多核苷酸序列的内源UP_11基因，所述同源重组细胞表达所述共扩增的UP_11基因。
96.一种同源重组细胞，所述同源重组细胞按照权利要求96的方法产生。
97.一种为哺乳动物提供OM_10蛋白的方法，所述方法包括将产生所述OM_10蛋白的同源重组细胞引入所述哺乳动物体内，所述同源重组细胞通过包括下述步骤的方法产生(a)提供一种哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞的基因组DNA包含一种内源OM_10基因；(b)提供一种DNA构建体，所述DNA构建体包含所述OM_10基因的一个打靶序列、一个外源调节序列、一个外显子和所述外显子3′末端的未配对剪接供体位点，其中所述打靶序列与内源OM_10基因上游的靶位点同源，所述外源调节序列与所述外显子有效连接；然后(c)用步骤(b)的DNA构建体转染步骤(a)的细胞，由此产生同源重组的细胞，其中所述剪接供体位点与所述内源基因的第二个外显子有效连接，并且所述外源调节序列控制所述构建体衍生的外显子、所述内源OM_10基因和在所述构建体衍生的外显子与所述内源OM_10基因之间任何序列的转录，产生编码OM_10蛋白的RNA转录物。
98.一种为哺乳动物提供UP_11蛋白的方法，所述方法包括将产生所述UP_11蛋白的同源重组细胞引入所述哺乳动物体内，所述同源重组细胞通过包括下述步骤的方法产生(a)提供一种哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞的基因组DNA包含一种内源UP_11基因；(b)提供一种DNA构建体，所述DNA构建体包含所述UP_11基因的一个打靶序列、一个外源调节序列、一个外显子和所述外显子3′末端的未配对剪接供体位点，其中所述打靶序列与内源UP_11基因上游的靶位点同源，所述外源调节序列与所述外显子有效连接；然后(c)用步骤(b)的DNA构建体转染步骤(a)的细胞，由此产生同源重组的细胞，其中所述剪接供体位点与所述内源基因的第二个外显子有效连接，并且所述外源调节序列控制所述构建体衍生的外显子、所述内源UP_11基因和在所述构建体衍生的外显子与所述内源UP_11基因之间任何序列的转录，产生编码UP_11蛋白的RNA转录物。
全文摘要
本发明总的来讲涉及神经科学、生物信息学和分子生物学领域。更具体地讲，本发明涉及新鉴定的编码G蛋白偶联受体(GPCR)的多核苷酸、所述多核苷酸和多肽的应用、以及所述多核苷酸和多肽的生产。本发明还涉及鉴定可以作为GPCR的激动剂、拮抗剂和/或抑制剂、并因此可能用于治疗的化合物。
文档编号A61P25/28GK1615439SQ02827078
公开日2005年5月11日 申请日期2002年11月12日 优先权日2001年11月16日
发明者M·布拉彻尔, J·E·保尔森, B·G·巴特斯 申请人:惠氏公司