专利名称：一种检测肿瘤纳米探针的制备方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤检测技术领域，更具体涉及一种检测肿瘤纳米探针的制备方法， 通过在铁蛋白笼型结构表面展示荧光蛋白和RGD肿瘤靶向短肽，并在其内腔合成Fe3O4纳米颗粒，制备出具有肿瘤靶向、磁性、荧光三种功能的纳米颗粒探针。这种三功能纳米探针能够用于肿瘤细胞或活体的肿瘤靶向的磁共振成像(MRI)和荧光成像等检测。
背景技术：
癌症是人类死亡主要原因之一。尽管肿瘤生物学和肿瘤医学有了很大的发展，比如肿瘤生物标记物的发现，简便的手术流程，放疗和化疗的发展，但是总癌症存活率在过去的二十年中都没有显著的提高。为了提高肿瘤患者的存活率，我们急需发展新的肿瘤早期诊断方法和治疗方法。纳米科学和技术的发展带动了用于分子细胞成像和癌症治疗的纳米材料的发展， 也带动了用于癌症检测和筛查的纳米器件的开发。纳米颗粒不仅能提供癌症病人的高灵敏和特异性成像信息，而且还能运输抗癌药物到肿瘤的位置。当前，我们在以下这三个方面的认识还是有限的一是适合用来成像的生物标记物；二是成像靶标和反差增强材料的选择；三是用来使成像探针生物化的化学方法。我们在发展癌症特异性成像试剂上同样遇到很多困难，比如1)靶向组织或肿瘤的探针的运输；2)生物相容性和生物毒性；3)探针的稳定性和体内信号增强的有效性；4)足够多的成像方法和策略。当今，肿瘤靶向性的纳米探针的发展也存在很大的挑战。磁共振成像 (Magneticresonance imaging,MRI)是一种很好的成像方式，提供了细腻的软组织对比度， 能够揭示组织形态学和解剖学上的细节，甚至可以用于动物和人的全身成像。磁性造影剂常被用来增强反差和放大信号。虽然钆-二乙烯三胺五乙酸(Gd-DTPA)有很强的缩短Tl值的效应而且在临床上被广泛接受，但是它反差效应相对较低且体内存留时间过短。细胞内吞钆时和内吞钆后的毒性和生物相容性还是未知的。最近，磁性氧化铁纳米颗粒成为新一代的靶向特异性的MRI T2造影剂。磁性氧化铁纳米颗粒比Gd-DTPA在促进弛豫方面更有效。磁性氧化铁纳米颗粒的磁学性质可以通过控制核心的大小和表面修饰物来操控。更重要的是，磁性氧化铁纳米颗粒具有很长的血液存留时间，生物降解性和低生物毒性等特性。尽管我们在发展基于磁性氧化铁纳米颗粒的MRI造影剂方面做出了很多努力， 但是很多难题依然存在。主要的难题是发展一种表面修饰材料，该材料不仅可以稳定纳米颗粒还可以提供用于探针分子可控生物交联的活性功能基团。传统的用于稳定磁性氧化铁纳米颗粒的分子(如葡聚糖)由于与纳米颗粒间的相互作用力弱，所以很容易从纳米颗粒的表面脱落下来而导致纳米颗粒在生理条件下和储存期间的团聚、沉淀。同时，虽然MRI是肿瘤学的一种主要成像方法，但是用于分子和细胞成像时它的分辨率很有限。而且，单独的MRI造影剂如磁性氧化铁纳米颗粒难以靶向肿瘤细胞或组织。铁蛋白是一个由24个结构相同的亚基自组装形成的八面体对称的球状蛋白笼形结构。铁蛋白的外部直径是12nm，内部是一个6-8nm的空腔。铁蛋白同SV40—样也是一种典型的蛋白笼形结构。内源性人类铁蛋白有两种不同的亚基组成，H链和L链，H链和L 链的分子量大小不同，分别是21kDa和19kDa。H链含有一个保守的亚铁氧化酶的酶活性位点，可以催化两个Fe2+氧化；L链内部带有大量的负电荷，参与铁氧化物核心的形成。在哺乳动物铁蛋白的H链内有一个能催化Fe2+氧化成Fe3+的亚铁氧化酶。哺乳动物铁蛋白的H 链单独也能自组装成24聚体球状蛋白笼形结构。铁蛋白的氨基端伸向外表面，非常易于基因操作，融合各种蛋白和短肽。所以，尝试基于铁蛋白笼型结构发展一种具有肿瘤靶向、磁性、荧光等三种功能的纳米颗粒，用于肿瘤靶向的磁共振成像和荧光成像。

发明内容
本发明的目的是在于提供了一种检测肿瘤纳米探针的制备方法，在铁蛋白H链的氨基端融合一个绿色荧光蛋白(GFP)，然后再融合一段RGD肿瘤靶向短肽。纯化好的带有肿瘤靶向肽和GFP的铁蛋白，再在其内腔合成Fe3O4纳米颗粒，从而发展具有肿瘤靶向、磁性、 荧光等三种功能的纳米颗粒探针一种的三功能纳米颗粒。这种三功能纳米探针能够用于肿瘤的活细胞或活体的肿瘤靶向的磁共振成像(MRI)和荧光成像等肿瘤的方便检测。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种检测肿瘤纳米探针的制备方法，其步骤是(1)、构建表达铁蛋白重链的表达质粒(pET-rHF)，大肠杆菌(E. coli BL21)(购自 promega)表达、纯化铁蛋白，电子显微镜验证表征其笼型结构。(2)、在铁蛋白氨基端融合一个绿色荧光蛋白，表达纯化制备表面展示了荧光蛋白的铁蛋白笼型结构，进行结构和荧光性能表征。(3)、在氨基端融合有绿色荧光蛋白铁蛋白H链的氨基端再融合一段肿瘤靶向短肽RGD(购自上海生工)，制备出表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构。(4)、基于表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构、在其内腔合成Fe3O4纳米颗粒，制备成具有肿瘤靶向、荧光、磁性的铁蛋白多功能探针。一种纳米探针检测肿瘤，其步骤是(1)、利用A549 (购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)、U87MG(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)等肿瘤细胞验证探针用于肿瘤的靶向识别功能。(2)、显微成像检测该三功能探针用于肿瘤的荧光成像功能。(3)、核磁共振成像验证三功能探针用于肿瘤的磁共振成像功能。(4)、三功能探针检测能够特异性地鉴定肿瘤细胞，并实现肿瘤细胞的荧光成像及磁共振成像本发明与现有技术相比，具体以下优点和效果本研究利用基因操纵技术，在铁蛋白H链的氨基端融合了肿瘤靶向肽和绿色荧光蛋白，并基于铁蛋白原有的亚铁氧化酶的功能，对铁蛋白能进行体外生物矿化、在其内腔合成Fe3O4纳米颗粒，从而制备出一种有机/无机杂合的三功能肿瘤检测纳米探针。铁蛋白本身具有优良的生物相容性、作为Fe3O4纳米颗粒的表面保护基团还可以稳定内腔的Fe3O4纳米颗粒。该纳米探针把肿瘤靶向、荧光成像、磁共振成像多功能融为一体，使用方便并能够实现多模式的同步检测，可望应用于特异的肿瘤细胞研究、肿瘤临床诊断的多功能适时成像及肿瘤的载药靶向治疗等。


图1为一种检测肿瘤纳米探针的制备方法示意图。肿瘤靶向肽和绿色荧光蛋白展示于铁蛋白笼型颗粒表面，在其内腔合成Fe3O4纳米颗粒。图2A_a为一种纯化的铁蛋白电泳表征2A_b 2B为一种纯化的铁蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白的电泳表征2A-c为一种纯化的铁蛋白、绿色荧光蛋白及肿瘤靶向肽RGD的融合蛋白的电泳表征2B_a为一种铁蛋白笼型颗粒结构的电镜表征2B_b为一种表面展示了绿色荧光蛋白的铁蛋白笼型颗粒电镜表征2B-c为一种表面展示了绿色荧光蛋白和肿瘤靶向肽RGD的铁蛋白笼型颗粒的电镜表征3A为一种铁蛋白笼型颗粒内腔合成Fe3O4纳米颗粒的电镜表征3B为一种表面展示了绿色荧光蛋白、内腔合成了 Fe3O4纳米颗粒的铁蛋白笼型颗粒电镜表征3C为一种表面展示有荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构，既完整的三功能纳米探针表电镜表征图。图4A为一种三功能纳米探针用于肿瘤细胞A549特异的荧光成像。图4B为一种与图4A中荧光成像的A549肿瘤细胞的明场图像。图4C为一种三功能纳米探针用于肿瘤细胞U87MG特异的荧光成像。图4D为与图4A中荧光成像的U87MG肿瘤细胞的明场图像。图5A为不同浓度(0，2，6，20，60，200nM)的三功能探针T2磁共振成像结果5B为不同浓度(0，2，6，20，60，200nM)的三功能探针磁共振成像对应的T2弛豫时间图5C_a为未处理的A549细胞的T2磁共振成像结果5C_b为无靶向功能铁蛋白颗粒处理的A549细胞的T2磁共振成像结果5C-c为具有靶向、荧光、磁性的三功能铁蛋白颗粒探针处理的A549细胞的T2 磁共振成像结果5C_d为未处理的U87MG细胞的T2磁共振成像结果5C_e为无靶向功能铁蛋白颗粒处理的U87MG细胞的T2磁共振成像结果5C_f为具有靶向、荧光、磁性的三功能铁蛋白颗粒探针处理的U87MG细胞的T2 磁共振成像结果图。
具体实施例方式铁蛋白是直径为12纳米的中空蛋白球，具有三个不同界面外表面和亚基界面和内腔，这三个界面通过人工设计可被赋予新的功能。在铁蛋白的氨基端融合了 RGD肿瘤靶向短肽和绿色荧光蛋白，制备笼型铁蛋白颗粒，使其表面展示肿瘤靶向短肽和绿色荧光蛋白，然后基于铁蛋白原有的亚铁氧化酶的功能，在其内腔合成Fe3O4纳米颗粒，从而制造成一种肿瘤靶向的磁共振成像和荧光成像的多功能纳米颗粒，可望应用于特异的肿瘤细胞研究、肿瘤临床诊断的多功能适时成像和肿瘤的载药靶向治疗等。实施例1 一种检测肿瘤纳米探针的制备方法，其步骤是(1)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增合成人铁蛋白重链基因rHF，插入到表达载体pET-28a(购自promega公司)上，构建出表达铁蛋白重链的表达质粒ρΕΤ-rHF，转化入大肠杆菌E. coli BL21UDE3)(购自promega公司)，37°C恒温、200r/min振荡培养培养至 0D600在0. 4 0. 6之间，向培养物加IPTG至终浓度lmmol/L，培养物均在25°C继续诱导培养8h后，4°C、6000g离心收集细胞，细胞沉淀以Tris-HCl缓冲液(20mM Tris-HCl, 50mM NaCl,pH 8. 0)清洗菌体一次，然后重悬于30mLTris-HCl缓冲液中，超声破碎后，以12000r/ min离心30min，收集上清液置于60°C水浴中反应lOmin，然后12000r/min离心20min，收集上清液用Amicon Ultral5超滤管(IOOKDa MW cut-off)(购自millipore公司)浓缩。浓缩的蛋白样品用分子筛柱Superdex 20010/300GL或Superose 610/300GL(购自GE公司) 纯化，收集洗脱峰，获得纯化的笼型结构的铁蛋。(2)质粒pET-rHF中插入绿色荧光蛋白基因(PCR扩增合成)，构建表达铁蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白的表达质粒pET-GFP-rHF，大肠杆菌E. coli BL21(ADE3)表达、 纯化融合蛋白(具体试验方法同上)，制备出表面展示了荧光蛋白的铁蛋白笼型结构。(3)在质粒pET-GFP-rHF中插入RGD短肽表达基因(购自上海生工)，构建表达铁蛋白-绿色荧光蛋白-肿瘤靶向肽RGD的融合蛋白的表达质粒pET28a-RGF，大肠杆菌 E. coli BL21(ADE3)表达、纯化融合蛋白(具体试验方法同上)，制备出表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构。(4)基于表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构，在其内腔合成Fe3O4纳米颗粒，具体方法为30mL 0. 4 μ M rHF蛋白(或GFP-rHF蛋白或RGF蛋白)的 NaCl (0. 1M)溶液脱气后加到滴定仪的反应杯中，通入高纯氮气，置于65°C恒温水浴中。采用滴定仪恒滴定模式，整个反应过程反应液的PH值用50mM的NaOH滴定控制在8. 5。12. 5mM 的硫酸亚铁铵((NH4)2Fe(SO4)2 · 6H20)和4. 17mM的H2O2新鲜配制溶液同时以0. 16mL/min 的速度加入到上述反应液中，30分钟后停止滴加，使反应液中每个蛋白笼形结构的理论铁原子载量达到5000。反应液在停止滴加后继续反应5分钟，然后加入0. 6mL 0. 3M的柠檬酸钠溶液螯合掉多余的铁离子，接着降温到室温，即成功获得内腔合成Fe3O4纳米颗粒的铁蛋白探针，铁蛋白笼型结构表面展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽，由于其表面已具有了荧光蛋白和肿瘤靶向肽，再加上内腔的Fe3O4纳米颗粒，即为完整的具有肿瘤靶向、荧光、磁性的铁蛋白多功能探针。实施例2 三功能肿瘤检测探针用于肿瘤细胞的特异性荧光成像，其步骤是(1)选择人恶性胶质母细胞瘤细胞株U87MG(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)和人非小细胞肺癌细胞株A549细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)，其细胞表面都具有肿瘤标志物α νβ 3整合素特异的上调表达。细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养液，在37°C，5%的二氧化碳环境中传代培养。传代比例1 2。(2)U87MG和A549细胞铺在中央粘好盖玻片的培养皿中，在37°C，5%的二氧化碳环境中24-36小时，达到50%细胞汇合度后，PBS缓冲液洗3遍，换为结合缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl,lmM Ca2+，ImM Mg2+, 1 % BSA,pH 7. 4)，把制备好的三功能铁蛋白纳米探针加入细胞至终浓度为50nM，37°C孵育1个小时，在荧光显微镜下检测其荧光，并用没有融合肿瘤靶向肽的铁蛋白颗粒作为对照。(3)荧光检测发现在U87MG和A549细胞的表面，具有很明显的绿色荧光信号(图 4)，而没有携带肿瘤靶向肽的铁蛋白颗粒不能在U87MG和A549细胞上产生荧光信号，说明上述制备的多功能探针可以用于肿瘤细胞的特异性靶向识别和荧光成像。实施例3 三功能肿瘤检测探针作为造影剂用于肿瘤细胞的磁共振成像。其步骤是(1)选择人恶性胶质母细胞瘤细胞株U87MG(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)和人非小细胞肺癌细胞株A549细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)，其细胞表面都具有肿瘤标志物α νβ 3整合素特异的上调表达。细胞用含有10%胎牛血清的 DMEM培养液，在37°C，5%的二氧化碳环境中传代培养。传代比例1 2。(2)106个现71^和々549细胞(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)PBS缓冲液洗 3 遍，换为结合缓冲液(20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, ImMCa2+, ImM Mg2+, 1% BSA, pH 7. 4)，把制备好的三功能铁蛋白纳米探针或是没有融合肿瘤靶向肽、但融合有荧光蛋白并含有Fe3O4纳米颗粒铁蛋白颗粒加入细胞中使其探针终浓度为50nM，37°C孵育30分钟。(3)三功能纳米探针处理的细胞利用4. 7T成像仪进行T2成像，U87MG和A549细胞的T2弛豫时间分别为283. 8ms和314. Oms0而用没有融合肿瘤靶向肽的铁蛋白颗粒处理的U87MG和A549细胞的T2弛豫时间分别为457. 3ms和451. 3ms。没有用任何造影剂处理的U87MG和A549细胞的T2弛豫时间分别为454. 4ms和447. 6ms。说明上述制备的三功能纳米探针用于肿瘤细胞磁共振成像时可以引起T2弛豫时间的显著降低。所以该三功能纳米探针可以用于肿瘤细胞的特异性靶向识别和磁共振成像。
权利要求
1. 一种检测肿瘤纳米探针的制备方法，其步骤是A、通过聚合酶链式反应扩增合成人铁蛋白重链基因r/F，插入到表达载体pET-28a上， 构建出表达铁蛋白重链的表达质粒pET-rfF，转化入大肠杆菌五coli BL21 (ADE3),37 °C恒温、200 r/min振荡培养培养至0D600在0.4 0. 6之间，向培养物加IPTG至终浓度 1 mmol/L，培养物均在25 °C继续诱导培养8 h后，4 6000 g离心收集细胞，细胞沉淀以Tris-HCl缓冲液20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8. 0，清洗菌体一次，然后重悬于30 mLTris-HCl缓冲液中，超声破碎后，以12000 r/min离心30 min，收集上清液置于60 ！水浴中反应10 min，然后12000 r/min离心20 min，收集上清液用Amicon Ultral5超滤管浓缩，浓缩的蛋白样品用分子筛柱Superdex 200 10/300 GL或Superose 6 10/300 GL纯化，收集洗脱峰，获得纯化的笼型结构的铁蛋；B、质粒pET-r/F中插入绿色荧光蛋白基因，构建表达铁蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白的表达质粒pET-ff^-rfF，大肠杆菌五coli BL21 ( λ DE3)表达、纯化融合蛋白，制备出表面展示了荧光蛋白的铁蛋白笼型结构；C、在质粒pET-ff^-rl中插入RGD短肽表达基因，构建表达铁蛋白-绿色荧光蛋白-肿瘤靶向肽RGD的融合蛋白的表达质粒pET28a-/ 6F，大肠杆菌五coli BL21 (XDE3)表达、 纯化融合蛋白，制备出表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构；D、基于表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构，在其内腔合成Fe3O4 纳米颗粒，方法为30 mL 0.4 μ M rHF蛋白或GFP-rHF蛋白或RGF蛋白的NaCl溶液脱气后加到滴定仪的反应杯中，通入高纯氮气，置于65 °C恒温水浴中，采用滴定仪恒滴定模式， 整个反应过程反应液的PH值用50 mM的NaOH滴定控制在8. 5，12. 5 mM的硫酸亚铁铵和 4.17 mM的H202新鲜配制溶液同时以0. 16 mL/min的速度加入到上述反应液中，30分钟后停止滴加，使反应液中每个蛋白笼形结构的理论铁原子载量达到5000，反应液在停止滴加后继续反应5分钟，然后加入0.6 mL 0. 3 M的柠檬酸钠溶液螯合掉多余的铁离子，接着降温到室温，成功获得内腔合成Fe3O4纳米颗粒的铁蛋白探针，铁蛋白笼型结构表面展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽，再加上内腔的Fe3O4纳米颗粒，为完整的肿瘤靶向、荧光、磁性的铁蛋白多功能探针。
全文摘要
本发明公开了一种检测肿瘤纳米探针的制备方法，其步骤(1)、构建表达铁蛋白重链的表达质粒，大肠杆菌表达、纯化铁蛋白，电子显微镜验证表征其笼型结构。(2)、在铁蛋白氨基端融合一个绿色荧光蛋白，表达纯化制备表面展示了荧光蛋白的铁蛋白笼型结构。(3)、在氨基端融合有绿色荧光蛋白铁蛋白H链的氨基端再融合一段肿瘤靶向短肽RGD，制备出表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构。(4)、基于表面同时展示了荧光蛋白和肿瘤靶向肽的铁蛋白笼型结构、在其内腔合成Fe3O4纳米颗粒，制备成具有肿瘤靶向、荧光、磁性的铁蛋白多功能探针。该纳米探针把肿瘤靶向、荧光成像、磁共振成像多功能融为一体，能够实现多模式的同步检测。
文档编号A61K49/14GK102234679SQ20111020353
公开日2011年11月9日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者危宏平, 崔宗强, 张先恩, 张治平, 李可 申请人:中国科学院武汉病毒研究所