专利名称：一种活性多糖产品加工工艺优化方法
技术领域：
本发明属于天然产物制备方法领域，更具体涉及一种活性多糖产品加工工艺的优化方法。
背景技术：
长期以来，人们认为糖类在生物体内的作用主要是作为能量源或作为结构材料， 但大量实验证明，多糖及其缀合物与细胞各种生命现象的调节有着密切的联系。从植物、动物和微生物等不同生物体所获得的活性多糖具有各自不同的多种药用生物活性，活性多糖能提高人体免疫力和治疗多种疾病，具有良好的应用前景，活性多糖基础研究及产品开发已越来越引起人们的广泛关注。目前对多糖药用生理活性的基础研究、多糖加工工艺条件的探讨虽有很多报道，但相关药用生理活性研究缺乏对供试材料制备条件与活性试验结果联系的探讨；加工工艺的探讨仅限于以多糖得率为评价指标优化其提取工艺，以多糖保存率和蛋白脱除率为评价指标优化脱蛋白工艺。部分脱蛋白研究虽引入了活性评价指标，但对脱蛋白前粗多糖适宜获取条件、活性多糖的组成等缺乏系统研究，在实际工作中，往往因为提取和脱蛋白工艺选择不当，导致制备的多糖活性大大降低。因此，由于不同的工艺会影响多糖生物活性的保持，从活性多糖质量可控和经济、高效开发产品的角度，建立科学合理的多糖提取、加工工艺综合评价体系，成为促进多糖活性组分利用产品开发和广泛应用的关键因素。

发明内容
为改善目前活性多糖产品开发加工工艺评价和选择缺乏合理科学的方法，导致活性多糖产品质量管理混乱，产品开发和广泛应用受到制约的现状，本发明通过引入活性跟踪技术，将多糖得率和活性保持综合评价应用于活性多糖提取工艺的条件试验过程；将多糖保存率、蛋白脱除率和活性保持综合评价应用于活性多糖的脱蛋白纯化条件试验过程， 提出科学合理的活性多糖生产工艺优化方法。该方法简单易行，能够最大程度的保留制备出来的多糖的活性，并使具有活性的多糖样品的提取率达到最大化，保证多糖的提取率和生物活性保持率均在一个较高的水平。本发明是通过如下技术方案实施的
一种活性多糖产品加工工艺优化方法包括如下步骤
1)、根据多糖产品最主要的标示生物活性选择生物活性试验方法；
2)、对原料进行预处理；
3)、以常用的水提醇沉工艺为基础，选择增效提取手段，对温度、时间、功率、pH进行单因素试验和正交试验，以步骤1)所选择的生物活性试验方法，测定设计试验所得各多糖样品的生物活性，以提取物得率、生物活性检测值综合评分得分高的工艺条件，作为活性多糖的优化提取条件；
4)、依步骤3)选择的优化提取条件提取的多糖样品进行脱蛋白工艺条件试验；以步骤1)所选择的生物活性试验方法，测定各脱蛋白工艺条件试验所得多糖样品的生物活性，以多糖保持率、蛋白脱除率和生物活性检测值综合评分得分高的工艺条件，作为活性多糖的优化脱蛋白工艺条件；
所述步骤3)的提取物得率、生物活性检测值综合评分得分高是指评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重，提取物得率的权重系数为0. 4，生物活性检测值的权重系数为0. 6，加权求和计算得分，得最高分；
所述步骤4)的多糖保持率、蛋白脱除率和生物活性检测值综合评分得分高是指评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重，多糖保存率的权重系数为0. 3，生物活性检测值的权重系数设为0. 3、蛋白脱除率的权重系数设为0. 4，加权求和计算得分，得最高分。所述步骤1)的标示生物活性包括抗肿瘤活性、抗病毒活性、抗氧化活性。所述步骤1)的生物活性试验方法包括采用TBA法测定多糖抗小鼠肝组织脂质过氧化作用、根据Griess反应测定细胞培养上清液的NO2—量，间接反映巨噬细胞的NO生成量，判断多糖抗脂质过氧化、细胞免疫及抗肿瘤活性的高低。所述步骤2)的预处理步骤选自冻融破壁工艺、乙醇浸提除去脂溶性成分工艺。所述步骤3)的增效提取手段选自微波、超声波。所述步骤4)脱蛋白的方法选自Sevag法、酶法、三氯乙酸法和等电点法。除蛋白后的多糖样品可进一步进行纯化，所述纯化方法选自纤维素柱层析、葡聚糖凝胶柱层析和膜透析。选择纤维素柱层析、葡聚糖凝胶柱层析，分析层析洗脱液的蛋白洗脱曲线和糖洗脱曲线，结合各洗脱峰活性多糖活性跟踪试验，解析生物活性检测值高且含量较高之分离部多糖的组成特征，测定主要活性组分多糖的分子量，为工艺评价和产品质量控制方法的提出提供依据。本发明的优点为采用本发明提出的技术方法，可以方便、快速、合理的实施活性多糖提取工艺条件和脱蛋白纯化工艺条件的探索，评价和选择活性多糖的加工工艺，实现高质、高效开发生产出具有不同原料活性的多糖产品，在能很好保持多糖生物活性的基础上，又使制备的茶树菇多糖的得率在一个较高的水平，与现有技术以多糖得率为指标优选提取工艺并获得多糖后，将多糖样品进行活性认定试验的工艺研究方法想比较，本发明可以有效的避免由于加工工艺不当，造成加工过程中活性成分的大量丢失。


图1为一种活性多糖产品加工工艺优化方法技术路线图； 图2为螺旋藻活性多糖微波提取正交试验因素水平表；
图3为螺旋藻活性多糖L9 (34)正交试验设计表及结果；
图4为螺旋藻活性多糖综合评分方差分析表，注=Fatl5(2. 2) =19.0；
图5为不同脱蛋白处理工艺对螺旋藻活性提取物多糖保存率、蛋白脱除率及活性的影响。
具体实施方式
①确定多糖产品主要标示活性不同种类的生物体材料，其活性多糖产品特征药理活性存在差异，应根据材料的特点和现有基础药理研究已明确的药用生物活性，定位产品的主要标示活性(如抗肿瘤、提高免疫力、抗氧化等)。②选择适宜的活性试验方法根据产品主要标示活性，选择可靠、方便的活性试验方法(如采用TBA法测定多糖抗小鼠肝组织脂质过氧化作用、根据Griess反应测定细胞培养上清液的NO2—量，间接反映巨噬细胞的NO生成量等，考察多糖抗脂质过氧化、细胞免疫及抗肿瘤活性)。③原材料提取物主要标示活性的认定将原材料在中性、50°C温度条件下，经水提醇沉获得活性粗多糖样品，通过活性试验明确活性提取物的生物活性。④原料预处理不同活性多糖产品其共存组分具有不同的特点，应根据活性多糖产品生产原材料的不同特点及多糖组成、生产工艺的不同，选择差异化的预处理工艺(如冻融破壁、采用乙醇等溶剂除去脂溶性成分等)，在保证材料活性多糖生物活性的前提下，为高效率的提取、纯化并得到活性多糖创造有利条件。⑤提取工艺条件的单因素试验和正交试验以常用的水提醇沉工艺为基础，根据材料的特点，选择微波、超声波作为高效提取的手段，通过单因素试验分别考察温度、时间、 功率、PH等对提取过程的影响，确定正交试验的因素和水平，以多糖提取率和活性试验值综合评分，以得分最高着为适宜的提取工艺，以选择的适宜提取工艺条件加工获得活性多糖
工业产品。⑥脱蛋白纯化试验采用不同脱蛋白工艺(如kvag法、酶法法联用、三氯乙酸法、三氯乙酸法与Sevag法联用、等电点法)对活性多糖工业产品进行脱蛋白处理，以多糖保持率、蛋白脱除率和生物活性指标值进行综合评价，以得分最高者为适宜的脱蛋白工艺，以试验确定的脱蛋白工艺对活性多糖工业产品进行脱蛋白处理，形成脱蛋白活性多糖工业产品。⑦解析主要质量指标成分，实现生产过程控制活性试验跟踪条件下，将优选工艺条件制备的脱蛋白活性多糖样品透析出去小分子，纤维素、葡聚糖凝胶柱层析纯化，通过解析柱层析洗脱液蛋白洗脱曲线和糖洗脱曲线，明确产品主要质量指标成分的组成、分子量， 通过分析不同批次产品主要质量指标成分，实现生产过程控制。实施例1
以螺旋藻活性多糖为例
1)、称取螺旋藻鲜藻500g，加IOOOmL水搅勻，于_20°C冻融处理2次，加鲜藻3倍量的水后，依正交试验设计的因素和水平，分别调节溶液PH 8-10,400-1000w微波提取4-8min 后(见图2)，4000rpm离心15min，弃沉淀，取上清液；
2)、取1)所得正交试验各上清液样，减压浓缩至1/3体积，加入3倍量95%乙醇，4°C静置M!，4(KK)rpm离心15min，得各沉淀分离样，测定各沉淀分离样活性提取物得率和抗肝组织脂质过氧化活性，综合评价确定优化提取条件，相关试验结果见图3、图4 ；以优化条件提取制备活性提取物，冷冻干燥即得螺旋藻活性多糖；该螺旋藻活性多糖其主要活性成分是分子量分别为100000和9500的结合蛋白多糖，其中100000多糖含量> 9. 38%，分子量为 9500的多糖含量彡22. 12%ο3)、取2)优化条件下制备所得螺旋藻上清液，快速搅拌下缓慢加入粉末状固体硫酸铵，使硫酸铵浓度达10%，沉淀部分蛋白，4000rpm离心15min，弃沉淀(去除的蛋白可复性利用)，取上清液；
4)、取3)所得上清液，分别以Sevag法一次、Sevag法四次、三氯乙酸法、酶法进行脱蛋白处理，4000rpm离心15min后，测定各脱蛋白样多糖保存率、蛋白脱除率和抗肝组织脂质过氧化活性，综合评价确定优化脱蛋白工艺条件；以优化工艺条件对3)所得上清液进行脱蛋白处理经试验后所选择的最终条件为将3)所得上清液减压浓缩至1/3体积，与氯仿-正丁醇混合液(氯仿正丁醇=4:1)等体积混合后，剧烈震荡5min，静置浊后，4000rpm 离心15min，离心液加3倍体积95%乙醇，醇析Mh，4000rpm离心15min，丙酮洗涤沉淀， 沉淀冷冻干燥即得脱蛋白螺旋藻活性多糖。该脱蛋白螺旋藻活性多糖主要活性成分是的分子量分别为100000和9500的结合蛋白多糖，其中分子量100000的结合蛋白多糖含量彡19. 51%，分子量为9500结合蛋白多糖含量彡46. 02%。相关结果见图4。分别测定螺旋藻活性提取物总量和提取物抗肝组织脂质过氧化活性，计算螺旋藻活性提取物得率和抑制率，进行多指标综合评分。评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重。提取物得率的权重系数设为0. 4，抑制率的权重系数设为 0. 6，以综合分进行统计分析，结果见图3、图4。其中综合评分Y=O. 4 X 100 / 0. 2037 + 0. 6 X 100 / 0. 4189，公式 1); 综合比较三种工艺，确定微波提取提取溶液pH10、400w、处理4 min为优选工艺。对于脱蛋白的工艺选择，见图5，参考公式1的计算方式，由计算结果可知，脱蛋白方法选择Sevag法1次操作具有较高的多糖保存率和很好的蛋白脱除率，且抗肝组织脂质过氧化活性能得到很好的保持，故选择kvag法1次操作作为脱蛋白螺旋藻活性提取物的脱蛋白加工工艺。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.一种活性多糖产品加工工艺优化方法，其特征在于所述优化方法包括如下步骤1)、根据多糖产品最主要的标示生物活性选择生物活性试验方法；2)、对原料进行预处理；3)、以常用的水提醇沉工艺为基础，选择增效提取手段，对温度、时间、功率、pH进行单因素试验和正交试验，以步骤1)所选择的生物活性试验方法，测定设计试验所得各多糖样品的生物活性，以提取物得率、生物活性检测值综合评分得分高的工艺条件，作为活性多糖的优化提取条件；4)、依步骤3)选择的优化提取条件提取的多糖样品进行脱蛋白工艺条件试验；以步骤 1)所选择的生物活性试验方法，测定各脱蛋白工艺条件试验所得多糖样品的生物活性，以多糖保持率、蛋白脱除率和生物活性检测值综合评分得分高的工艺条件，作为活性多糖的优化脱蛋白工艺条件。
2.根据权利要求1所述的一种活性多糖产品加工工艺优化方法，其特征在于所述步骤3)的提取物得率、生物活性检测值综合评分得分高是指评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重，提取物得率的权重系数为0.4，生物活性检测值的权重系数为0. 6，加权求和计算得分，得最高分。
3.根据权利要求1所述的一种活性多糖产品加工工艺优化方法，其特征在于所述步骤4)的多糖保持率、蛋白脱除率和生物活性检测值综合评分得分高是指评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重，多糖保存率的权重系数为0. 3，生物活性检测值的权重系数为0. 3、蛋白脱除率的权重系数为0. 4，加权求和计算得分，得最高分。
4.根据权利要求1所述的一种活性多糖产品加工工艺优化方法，其特征在于所述步骤1)的标示生物活性包括抗肿瘤活性、抗病毒活性、抗氧化活性。
5.根据权利要求1所述的一种活性多糖产品加工工艺优化方法，其特征在于所述步骤1)的生物活性试验方法包括采用TBA法测定多糖抗小鼠肝组织脂质过氧化作用、根据 Griess反应测定细胞培养上清液的NO2—量，间接反映巨噬细胞的NO生成量，判断多糖抗脂质过氧化、细胞免疫及抗肿瘤活性的高低。
6.根据权利要求1所述的一种活性多糖产品加工工艺优化方法，其特征在于所述步骤2)的预处理步骤选自冻融破壁工艺、乙醇浸提除去脂溶性成分工艺。
7.根据权利要求1所述的一种活性多糖产品加工工艺优化方法，其特征在于所述步骤3)的增效提取手段选自微波、超声波。
8.根据权利要求1所述的一种活性多糖产品加工工艺优化方法，其特征在于所述步骤4)脱蛋白的方法选自Sevag法、酶法、三氯乙酸法和等电点法。
全文摘要
本发明涉及一种活性多糖产品加工工艺优化方法，该方法通过引入活性跟踪技术，将多糖得率和活性保持综合评价应用于活性多糖提取工艺的条件试验过程；将多糖保存率、蛋白脱除率和活性保持综合评价应用于活性多糖的脱蛋白纯化条件试验过程；通过纤维素、葡聚糖凝胶柱层析，对脱蛋白活性多糖产品进行纯化分离过程研究，活性试验跟踪，了解主要活性分离部各峰的组成、多糖分子量，实现生产过程质量控制，提出科学合理的活性多糖生产工艺优化方法。采用本发明提出的技术方法，可以方便、快速、合理的实施活性多糖提取工艺条件和脱蛋白纯化工艺条件的探索，评价和选择活性多糖的加工工艺，实现高质、高效开发生产不同原料活性多糖产品。
文档编号A61P35/00GK102295708SQ20111016378
公开日2011年12月28日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者俞白楠, 叶舟, 吕千, 吕杨兰, 康彦斌, 汪世华, 黄碧芳 申请人:福建农林大学