专利名称：一种复合高分子纳米颗粒及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种复合高分子材料的纳米颗粒，作为口服药物的缓释载体，以满足解决各种难于用于口服途径的药物的包裹、运输和缓释的运用。
背景技术：
大部分药物是通过口服和注射进入人体的，与注射途径相比较，口服途径更加安全，省时有效。但因胃部酸性环境、胃肠道蛋白水解酶的降解作用和胃肠黏膜的多重作用因素，一些药物特别是酸敏性药物和蛋白类药物在达到肠道之前已经被胃酸和胃蛋白酶基本破坏，导致药物最终的吸收能力极差，生物利用度低。此外，蛋白类药物的半衰期也很短，通常只有几分钟。所以，将上述药物包裹在其他的组分中可以避免药物吸收能力差，利用度低的问题。所以寻找并制备出可用于负载口服药物的载体或缓释载体显得尤为重要。目前，已经用于负载口服药物的载体主要有:⑴微球⑵微囊⑶无机纳米颗粒高分子纳米颗粒(5)脂质体(6)乳剂和和(7)凝胶剂。多年的研究表明，上述的口服药物的载体各有利弊，在运用中也暴露出很多问题，如:微球的粒径过大，难以快速释放内部包裹的药物；微囊和脂质体容易在消化系统的运输过程中破裂，导致药物的损失，其制备工艺较复杂；大部分无机纳米颗粒自身不能降解，却能透过肠道上皮细胞进入血液循环系统，导致肝脏、肾脏等脏器的无机纳米颗粒积累，具有潜在的安全隐患；乳剂和凝胶剂也存在运输过程中破裂，导致药物的损失的缺陷，同时部分组成(如聚氧乙烯蓖麻油)使用过量后可导致人体内组织胺大量释放，引起过敏反应。目前，高分子制备的口服用的纳米颗粒的研究较少，主要存在的原因在于:(I)成分单一，由于高分子纳米颗粒的成分为一种或两种材料，其载体的药物释放的控制难以有效掌握，如聚乳酸(PLA)纳米颗粒。(2)肠道细胞吞噬率低，大部分高分子纳米颗粒的肠道细胞吞噬率均较低。(3)表面活性剂残留，如果高分子纳米颗粒制备过程中使用表面活性剂，必然导致表面活性剂的残留，如油酸钠等。所以急需一种能克服上述问题的复合型高分子材料的纳米颗粒，作为口服药物的缓释载体，以满足解决各种难于用于口服途径的药物的包裹、运输和缓释的运用。

发明内容
本发明涉及的是一种复合高分子纳米颗粒，用于口服药物的潜在载体，以满足解决各种难于用于口服途径的药物载体的运用。本发明提供一种复合高分子纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为50-2000nm，包含聚羟基丁酸(PHB)、乳酸- 乙醇酸共聚物(PLGA)、聚羟基丁酸己酸(PHBHHx)三种组分，其中聚羟基丁酸为10% _25%，乳酸-乙醇酸共聚物为占10% -25%，聚羟基丁酸己酸为50% -80%。所述的复合高分子纳米颗粒的药物包封率大于70%。
所述的复合高分子纳米颗粒可以被Caco2肠道上皮细胞所吞噬。所述的复合高分子纳米颗粒生物相容性好，其细胞存活率大于80%。本发明提供一种复合高分子纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤:(I)聚乙烯醇溶解于水，作为水相；(2)乳酸-乙醇酸共聚物\聚羟基丁酸\聚羟基丁酸己酸溶解于氯仿中，作为油相；(3)水相和油相混合并进行乳化处理形成初乳；(4)初乳倒入旋转蒸发仪中，除去有机溶剂；(5)经过离心或过滤处理得到除去聚乙烯醇的用于口服药物载体的复合高分子纳米颗粒悬浮液。所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷中的一种及其组合。

所述水相中聚乙烯醇的含量为10g_30g/1000ml。所述乳化处理为匀浆机处理，或超声机处理。所述水相和油相的体积比为10: I 30: I。所述纳米颗粒进行初步的粒径分离通过静置、调节离心速度和离心时间及过滤来实现；其中静置时间为0.5-48小时，离心速度为6000-120000转每秒，离心时间为10-25分钟。本发明提供一种复合高分子纳米颗粒作为口服药物载体的应用。以红色染料罗丹明异硫氰为药物模型，添加入反应体系中。并用于人直肠细胞Caco2的吞噬实验。三种材料混合后，被上皮细胞吞噬的能力最佳，这为上述的复合材料纳米颗粒作为口服药物载体最重要的提供依据。该纳米颗粒没有其他杂质和有机溶剂的残留。工艺制备十分简单，成分较低，有利于工业化大规模生产。


图1为本发明中IOOOnm级纳米颗粒的扫描电子显微镜图片。图2为本发明中400nm级纳米颗粒的扫描电子显微镜图片。图3为本发明中纳米颗粒被Caco2细胞图示的激光共聚焦显微镜图片。I为被细胞吞噬后的负载了罗丹明异硫氰的纳米颗粒，2为被染料标记的细胞。
具体实施例方式PLGA\PHB\PHBHHx 材料的纯化。将PLGA、PHB和PHBHHx是三种材料分别按照1:1: 8，1:1: 5和1:1: 2的质量比混合后，称取2g混合材料溶解于80ml的三氯甲烷中，40-60°C加热至完全溶解，用布氏漏斗抽滤除去不溶于三氯甲烷的杂质。将上述有机溶剂缓慢导入2000ml的无水乙醇中。轻度搅拌，静置24-72小时。用布氏漏斗除去大部分无水乙醇，冷冻干燥机处理最终除去残余的无水乙醇。即可得到纯化后的PLGA\PHB\PHBHHx材料。实施例1:
粒径为IOOOnm级纳米颗粒的制备。具体步骤如下:(I)将Ig的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作为水相(W)；(2)将Ig的PLGA\PHB\PHBHHx溶解于20ml的氯仿中作为油相(O)；(3)将水相和油相按10:1的比例混合，并匀浆机6000转每分钟搅拌2分钟形成初乳(W1/0):(4)将初乳倒入旋转蒸发仪中，除去有机溶剂；(5) 7000转每分钟离心处理10分钟，上清为分离残余的聚乙烯醇溶液，纳米颗粒集中在沉淀中；(6)将沉淀用超纯水悬浮，再次离心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重复步骤5)和步骤6)的操作4次，静置2小时，大于IOOOnm的颗粒将沉淀与底部，保留上清悬浮液；(8)继续静置48小时，小于IOOOnm的纳米颗粒将悬浮于上清中，保留沉淀即为粒径为IOOOnm纳米颗粒。利用扫描电子显微镜和粒径仪检测所制备的纳米颗粒的粒径大小和分布，数据见表1，扫描电子显微镜图见图1。实施例2:粒径为400-10000nm级纳米颗`粒的制备。具体步骤如下:(I)将1.5g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作为水相；(2)将Ig的PLGA\PHB\PHBHHx溶解于20ml的氯仿中作为油相；(3)将水相和油相按照15: I的比例混合，并匀浆机24000转每分钟搅拌2分钟形成初乳；(4)将初乳倒入旋转蒸发仪中，除去有机溶剂；(5) 10000转每分钟离心处理10分钟，上清为分离残余的聚乙烯醇溶液，纳米颗粒集中在沉淀中；(6)将沉淀用超纯水悬浮，再次离心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重复步骤5)和步骤6)的操作4次，静置2小时，大于IOOOnm的颗粒将沉淀与底部，保留上清悬浮液；(8) 10000转每分钟离心处理10分钟，大于IOOOnm的纳米颗粒将沉淀，小于IOOOnm的纳米颗粒将悬浮于上清中。利用扫描电子显微镜和粒径仪检测所制备的纳米颗粒的粒径大小和分布，数据见表I。实施例3:粒径小于400nm级纳米颗粒的制备。具体步骤如下:(I)将2g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作为水相；(2)将Ig的PLGA\PHB\PHBHHx溶解于20ml的氯仿中作为油相；(3)将水相和油相按照20:1的比例混合，并超声机240瓦的功率处理10分钟形成初乳；(4)将初乳倒入旋转蒸发仪中，除去有机溶剂；(5) 11000转每分钟离心处理10分钟，上清为分离残余的聚乙烯醇溶液，纳米颗粒集中在沉淀中；(6)将沉淀用超纯水悬浮，再次离心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重复步骤5)和步骤6)的操作4次，静置2小时，大于IOOOnm的颗粒将沉淀与底部，保留上清悬浮液；(8) 11000转每分钟离心处理15分钟,大于800nm的纳米颗粒将沉淀,小于800nm
的纳米颗粒将悬浮于上清中。(9)利用PALLs 450nm的过滤头(PALL，美国)过滤上述上清液，最终得到的过滤液即为小于400nm纳米颗粒。利用扫描电子显微镜和粒径仪检测所制备的纳米颗粒的粒径大小和分布，数据见表1，扫描电子显微镜图见图2。实施例4:粒径为IOOOnm级负载了突光染料罗丹明异硫氰的纳米颗粒的制备。具体步骤与实施例2的步骤类似，具体如下:(I)将Ig的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作为水相；(2)将Ig的PLGA\PHB\PHBHHx和20mg的罗丹明异硫氰溶解于20ml的氯仿中作为油相；(3)将水相和油 相按照20:1的比例混合，并匀浆机6000转每分钟搅拌2分钟形成初乳；(4)将初乳倒入旋转蒸发仪中，除去有机溶剂；(5)7000转每分钟离心处理10分钟，上清为分离残余的含有大量罗丹明异硫氰的聚乙烯醇溶液，纳米颗粒集中在沉淀中；(6)将沉淀用超纯水悬浮，再次离心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重复步骤5)和步骤6)的操作4次，静置2小时，大于IOOOnm的颗粒将沉淀与底部，保留上清悬浮液；(8)继续静置48小时，小于IOOOnm的纳米颗粒将悬浮于上清中，保留沉淀即为粒径为IOOOnm纳米颗粒。利用扫描电子显微镜和粒径仪检测所制备的纳米颗粒的粒径大小和分布，数据见表I。将步骤5)中所述的含有大量罗丹明异硫氰的聚乙烯醇溶液进行分光光度计检测，确定没有包封的罗丹明异硫氰含量，并计算成样品的包封率。包封率的计算公式见下:包封率(％ )=(总罗丹明异硫氰含量-没有包封的罗丹明异硫氰含量)/总罗丹明异硫氰含量包封率结果见表2。实施例5:粒径为400-1000nm级负载了突光染料罗丹明异硫氰的纳米颗粒的制备。具体步骤与实施例2的步骤类似，具体如下:(I)将1.5g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作为水相；(2)将Ig的PLGA\PHB\PHBHHx和20mg的罗丹明异硫氰溶解于20ml的氯仿中作为油相；
(3)将水相和油相按照20: I的比例混合，并匀浆机24000转每分钟搅拌2分钟形成初乳；(4)将初乳倒入旋转蒸发仪中，除去有机溶剂；(5) 10000转每分钟离心处理10分钟，上清为分离残余的聚乙烯醇溶液，纳米颗粒集中在沉淀中；(6)将沉淀用超纯水悬浮，再次离心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重复步骤5)和步骤6)的操作4次，静置2小时，大于IOOOnm的颗粒将沉淀与底部，保留上清悬浮液；(8) 10000转每分钟离心处理10分钟，大于IOOOnm的纳米颗粒将沉淀，小于IOOOnm的纳米颗粒将悬浮于上清中。利用扫描电子显微镜和粒径仪检测所制备的纳米颗粒的粒径大小和分布，数据见表I。将步骤5)中所述的含有大量罗丹明异硫氰的聚乙烯醇溶液进行分光光度计检测，确定没有包封的罗丹明异硫氰含量，并计算成样品的包封率。包封率的计算公式见下:包封率(％ )=(总罗丹明异硫氰含量-没有包封的罗丹明异硫氰含量)/总罗丹明异硫氰含量包封率结果见表2。实施例6: 粒径为400-1000nm级负载了突光染料罗丹明异硫氰的纳米颗粒的制备。(I)将2g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作为水相；(2)将Ig的PLGA\PHB\PHBHHx和20mg的罗丹明异硫氰溶解于20ml的氯仿中作为油相；(3)将水相和油相按照20: I的比例混合，并超声机240W的功率处理10分钟形成初乳；(4)将初乳倒入旋转蒸发仪中，除去有机溶剂；(5) 11000转每分钟离心处理10分钟，上清为分离残余的聚乙烯醇溶液，纳米颗粒集中在沉淀中；(6)将沉淀用超纯水悬浮，再次离心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重复步骤5)和步骤6)的操作4次，静置2小时，大于IOOOnm的颗粒将沉淀与底部，保留上清悬浮液；(8) 11000转每分钟离心处理15分钟,大于800nm的纳米颗粒将沉淀,小于800nm
的纳米颗粒将悬浮于上清中。(9)利用MLLs 450nm的过滤头(PALL，美国)过滤上述上清液，最终得到的过滤液即为小于400nm纳米颗粒。利用扫描电子显微镜和粒径仪检测所制备的纳米颗粒的粒径大小和分布，数据见表I。将步骤5)中所述的含有大量罗丹明异硫氰的聚乙烯醇溶液进行分光光度计检测，确定没有包封的罗丹明异硫氰含量，并计算成样品的包封率。包封率的计算公式见下:包封率)=(总罗丹明异硫氰含量-没有包封的罗丹明异硫氰含量)
/总罗丹明异硫氰含量包封率结果见表2。纳米颗粒的Caco2细胞吞噬实验:分解将实施例4-6中所制备的负载了荧光染料罗丹明异硫氰的纳米颗粒精确称量后分散在DMEM细胞培养基中，配置成不同浓度的颗粒悬浮液。用人直肠上皮细胞Caco2作为试验用的细胞株。分别接种10万个细胞于48孔板中，待细胞生长完全覆盖细胞培养板后，依次加入不同的上述颗粒悬浮液Iml。分别培养I小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时和24小时后，移去原先的DMEM细胞培养基(Gibc o，美国)，再用磷酸缓冲溶液洗3次取出没有吞噬的纳米颗粒，再加入含有绿色荧光染料FDA的DMEM细胞培养基染色5分钟。用激光共聚焦显微镜观察没400个细胞中，含有红色颗粒的细胞的数量并计算出所占总细胞的比率为纳米颗粒吞噬率(个/400个细胞)，数据见表3和图3。通过纳米颗粒吞曬率可以发现,颗粒粒径越小的纳米颗粒,越容易被Caco2细胞所吞噬。纳米颗粒的细胞毒性实验:分解将实施例1-3中所制备的没有负载了荧光染料罗丹明异硫氰的纳米颗粒精确称量后分散在DMEM细胞培养基中，配置成不同浓度的颗粒悬浮液。分别用人直肠上皮细胞Caco2和小鼠成纤维细胞L929作为试验用的细胞株。分别接种I万个细胞于96孔板中，待细胞生长24小时后，依次加入不同的上述颗粒悬浮液100 μ I。分别培养24后，利用细胞活性试剂盒进行细胞活性检测，450nm的波长下收集吸光值，并计算细胞存活率，公式如下:细胞存活率)=样品的吸光值/对照的吸光值*100%数据见表4和表5。通过纳米颗粒吞噬率可以发现，用PLGA\PHB\PHBHHx制备的纳米颗粒的生物相容性均较好。表1.所制备的不同级别的纳米颗粒的粒径大小
权利要求
1.一种复合高分子纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为50-2000nm,包含聚羟基丁酸(PHB)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚羟基丁酸己酸(PHBHHx)三种组分，其中聚羟基丁酸为10% _25%，乳酸-乙醇酸共聚物为占10% -25%，聚羟基丁酸己酸为50% -80%。
2.根据权利要求1所述一种复合高分子纳米颗粒，其特征在于，所述的复合高分子纳米颗粒的药物包封率大于70%。
3.根据权利要求1，或2所述一种复合高分子纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)聚乙烯醇溶解于水，作为水相； (2)乳酸-乙醇酸共聚物\聚羟基丁酸\聚羟基丁酸己酸溶解于氯仿中，作为油相； (3)水相和油相混合并进行乳化处理形成初乳； (4)初乳倒入旋转蒸发仪中，除去有机溶剂； (5)经过离心或过滤处理得到除去聚乙烯醇的用于口服药物载体的复合高分子纳米颗粒悬浮液。
4.根据权利要求5所述一种复合高分子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷中的一种及其组合。
5.根据权利要求5所述一种复合高分子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述水相中聚乙烯醇的含量为10g-30g/1000ml。
6.根据权利要求5所述一种复合高分子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述乳化处理为匀浆机处理，或超声机处理。
7.根据权利要求5所述一种复合高分子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述水相和油相的体积比为10: I 30:1。
8.根据权利要求5所述一种复合高分子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述纳米颗粒进行初步的粒径分离通过静置、调节离心速度和离心时间及过滤来实现；其中静置时间为0.5-48小时，离心速度为6000-120000转每秒，离心时间为10-25分钟。
9.根据权利要求1，或2所述一种复合高分子纳米颗粒作为口服药物载体的应用。
全文摘要
本发明涉及一种复合高分子纳米颗粒，作为口服药物载体，以满足解决各种难于用于口服途径的药物载体的运用。该复合高分子纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为50-2000nm，包含聚羟基丁酸(PHB)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚羟基丁酸己酸(PHBHHx)三种组分，其中聚羟基丁酸为10％-25％，乳酸-乙醇酸共聚物为占10％-25％，聚羟基丁酸己酸为50％-80％。本发明还涉及一种复合高分子纳米颗粒得制备方法。该纳米颗粒没有其他杂质和有机溶剂的残留。工艺制备十分简单，成分较低，有利于工业化大规模生产。
文档编号A61K47/34GK103169975SQ20111043663
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者魏岱旭, 闫志强, 钟建, 何丹农 申请人:上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司