专利名称：杜仲化学成分作为肾脏保护剂的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及传统中药材杜仲及其若干化学成分的新用途，特别是杜仲、杜仲提取物以及京尼平和京尼平苷作为肾脏保护剂的制药用途。
背景技术：
中毒性肾病是指由外源性或内源性肾毒性物质异常引起的肾脏病(方国祥.中毒性肾病.人民卫生出版社，2006年7月)。随着工业发展，化工原料、医药及各种农药的出现，增加了环境污染，使人群接触肾毒物的机会增加，中毒性肾病的发病率亦随之增长，严重的可引起急和/或慢性肾功能衰竭，后期病死率高，是危害人类健康的主要疾病之一。外源性肾毒物质，以职业上接触的重金属、化学毒物等为主；日常生活中接触洗涤剂、食品添加齐IJ、化妆品、家用杀虫剂，生活嗜好如烟、酒、麻醉齐 、致幻剂等化学物质，也可引起中毒性肾病；大部分药物也有肾毒性，包括抗生素、解热镇痛药、金属制剂、造影剂、利尿剂，部分中草药如关木通雷公藤等。常见的具有肾毒性的重金属元素有汞、铅、金、镉、银、锰、铬、镍、铊、锌、钒、锑、锡、 铜、钼、铋、锗、铁等。长期接触(吸入)汽车排放的尾气，导致铅中毒的危险性增加，食用重金属污染过的饮用水、蔬菜、粮食等，或在环境污染区生活工作引起中毒性肾病的机率大大增加。日本的水俣病，就是由于食用了汞污染的水产品所致，我国和日本、德国、瑞典等国， 均有由于镉污染而引起的肾小管损害与终末期肾衰的报道。镉被美国毒物管理委员会列为第六位危害人体健康的有毒物质，环境中的镉不能生物降解，随着工农业生产的发展，受污染量逐年上升。肾损伤是镉对人体的主要危害，镉诱导的中毒性肾病会引起肾小球和肾小管尤其是肾小管近端的严重损害。目前重金属中毒治疗的关键只能是预防，出现症状后立即停止接触。急性中毒者洗胃，应用解毒剂(根据重金属的种类可应用依地酸钙钠、二巯丙磺钠、二巯丁二钠等静脉滴注)及紧急透析治疗，临床尚没有特效治疗药物，抗氧化剂和金属鏊合剂近年有所应用。天然产物尤其是中药在重金属中毒性肾病中的预防和治疗作用也受到越来越广泛的重视和研究，如人们发现柚皮苷对于镉诱导的肾损伤有保护作用，这种保护作用包括通过自由基清除，抗氧化和螯合的作用途径起效(Renugadevi，J. and Prabu, S. Μ.， 2009.Naringenin protects against cadmium-induced oxidative renal dysfunction in rats. Toxicology 256,128-134) 0洋葱和大蒜油也具有强的对镉诱导的肾脏氧化应激损伤的保护作用，并呈剂量依赖关系，研究表明是通过减少脂质过氧化和提高了抗氧化的能力的途径发挥的作用(Suru，S. M.，2008. Onion and garlic extracts lessen cadmium-induced nephrotoxicity in rats. Biometals 21,623-633)。此夕卜，据说复方冬虫夏草对镉致大鼠肾毒性有明显的改善作用，联合核酸和V。效果更佳，机制可能与促进镉排出有关(朱萍萍，廖惠珍，尤夏洪等.复方冬虫夏草对大鼠镉致肾毒性的改善作用，福建医科大学学报，2007 (6) :11)。采用大鼠亚急性镉暴露损伤模型，观察花粉与枸杞联合使用对镉性损伤的拮抗作用，结果表明花粉枸杞可拮抗镉所致脂质过氧化，增强抗氧化功能，花粉枸杞干预后，染镉大鼠肾镉明显降低，尿镉排出差值有增高趋势，提示花粉枸杞可能具有一定的促排镉作用 [朱萍萍，王文祥，廖惠珍等.花粉枸杞对亚急性镉中毒拮抗作用.中国公共卫生，2008， 24(3) :354-355] 肿瘤治疗药物顺钼可明显升高肾组织氧化应激水平并严重损伤肾脏的结构和功能引起中毒性肾病，研究表明姜黄素有较弱的直接抗顺钼肾毒性作用，并且用姜黄素预处理上调HO-I蛋白表达及活力能显著增强其抗顺钼肾毒性作用[张英，黄维义，王顺蓉等·姜黄素抗顺钼肾毒性作用及其机制研究.时珍国医国药，2007，18(7) :1673-167 。银杏叶提取物能显著诱导肾内HO-I的表达并减轻HgCl2所致的急性肾损伤，其作用机制与 HO-I增强肾组织抗氧化能力有关[张英，曾维诚，陈蓉等.银杏叶提取物抗氯化汞急性肾损伤的实验研究.中国现代医学杂志，2006，16 (8) :1167-1170]。王飞等观察了沙棘油和五味子乙素对大鼠染镉致肾损伤的影响，结果表明二者对镉染毒致大鼠肾损伤的恢复有一定的促进作用[王飞，徐兆发，冯雪英.沙棘油和五味子乙素对镉致大鼠肾损伤的影响.中国毒理学会第五次全国学术大会论文集.2009 :165-169] 0重金属引起的肾脏损害的可能机制有以下3方面1)直接细胞毒性作用。多数重金属有直接毒性作用，当含有重金属的原尿流经近曲小管时，使肾小管上皮细胞发生空泡、 变性甚至坏死。2)免疫损伤。某些重金属如汞、金等，可损伤肾组织，使其抗原性发生改变， 产生自身抗体，引起肾小球免疫性损伤。3)肾缺血。重金属的直接毒性作用造成肾小管功能障碍或急性肾小管坏死，或其溶血作用引起溶血尿毒症综合征，使流经致密斑的尿流减慢，尿钠增高，激活肾素、血管紧张素系统，导致肾血管痉挛，肾缺血，并通过细胞内钙离子积聚、磷酸酯酶激活、花生四烯酸产物生成、氧自由基产生等环节造成肾损伤。重金属对肾细胞的直接毒性作用是肾损伤的主要原因且研究较多。重金属进入人体后，血液中肾毒性物质经肾小球滤过到达肾小管，首先抵达近曲小管，蓄积于细胞内的有毒药物及其代谢产物可通过降低线粒体功能和ATP的合成、增加氧化应激反应、降低谷胱甘肽和其他抗氧化物质的排出、抑制磷脂代谢以及炎性介质肿瘤坏死因子TNF-α的升高增加i-NOS表达，启动N0/i-N0S途径、破坏蛋白质合成等途径损伤肾小管细胞，肾小管细胞坏死主要在近曲小管。氧化损伤是重金属直接细胞毒性的重要机制之一。研究表明肾损伤与重金属引起的氧自由基生成有关[Wat jen, W. and Beyersmann，D.，2004. Cadmium-induced apoptosis in C6glioma cells :influence of oxidative stress. Biometals 17，65-78]，已证明在重金属中毒时有氧自由基的生成过多和脂质的过氧化反应存在。例如大鼠染镉后可使肾脏的SOD的活性受到抑制并可增加肝肾的脂质过氧化反应。染镉后2h，大鼠肾皮质的镉含量达到峰值，开始出现超微结构改变，氧自由基的生成及丙二醛均较对照组升高[Joseph， Pius. Cadmium-Induced Cell Transformation and Tumori2 genesis Are Associated with Transcriptional Activation of c_fos，c_jun，and c-myc Proto-Oncogenes :Role of Cellular Calcium and Reactive Oxygen Species[J]. Toxicological sciences， 2001,16(2) J95-303;杨光，仲来福.镉所致肾毒性及氧化性损害机制.毒理学杂志， 2005，19(3) :233]。SOD和GSH、CAT的活力降低，使细胞抗氧化的能力减弱，从而细胞膜的稳定性明显降低细胞更易受损[Singhal, R. K.，Anderson, Μ. Ε. and Meister，Α.，1987.Glutathione, a first line of defense against cadmium toxicity. FASEB J 1， 220-223 ；Chelikani, P. , Fita, I.and Loewen, P. C. ,2004.Diversity of structures and properties among catalases. Cellular and Molecular Life Sciences 61，192-208]。因此提高抗氧化能力和减少脂质过氧化是减小细胞损伤的两个重要途径。能量障碍是细胞损伤的重要病理环节，重金属中毒时肾细胞内ATP水平下降使 Na+-K+-ATP 酶活性降低[Wilson, P. D.，Devuyst, 0.，Li，X.，Gatti, L，Falkenstein, D.，Robinson，S.，Fambrough, D.and Burrow, C. R. , 2000.Apical plasma membrane mispoIariζation of NaK-ATPase in polycystic kidney disease epithelia is associated with aberrant expression of the beta2 isoform. Am J Pathol 156， 253468]，导致细胞膜功能和通透性改变，细胞容量调节功能受损，细胞内钠、氯积聚， 摄入水增多致细胞水肿，甚至坏死[Dobrota, D.，Matejovicova, M.，Kurella, E. G. and Boldyrev, Α. Α. ,1999. Na/K-ATPase under oxidative stress :molecular mechanisms of injury. Cell Mol Neurobiol 19，141-149]。ATP合成减少和离子泵失灵对于重金属对肾细胞损伤甚至坏死的发生发展过程中扮演着重要的角色。具有两个或两个以上配位原子的多齿配体化合物和同一个金属离子可以形成螯合反应，具有多齿配体的化合物为螯合剂，产物为金属螯合物(或螯合物)。配体多具有氮、 氧、硫等强给电子基团，化合物的金属鏊合作用可以用于重金属解毒，例如乙二胺四乙酸可以与重金属形成胺羧络合物促进重金属排出，半胱氨酸、二巯基丙醇和D-青霉胺等可以竞争性的和重金属结合减小机体蛋白的解毒压力，从而减小重金属对机体的损害。TNF- α被认为是激活细胞因子级联反应的初级因子，具有广泛的生物效应，是重金属肾组织损伤中重要的介质，TNF-α可进一步激活磷脂酶Α2，诱发IL_1、IL_8等多种细胞因子和炎症介质的大量释放，促进白细胞粘附、聚集在微血管床，导致肾小管内皮细胞和微循环的一系列炎症改变，在肾组织局部可出现“无再灌流”现象，加重肾细胞的能量障碍， 使Na+-K+-ATP酶活性进一下降。此外TNF- α还可在分子水平使iNOSmRNA转录并翻译为 iNOS，进一步产生高浓度的N0，通过NO与超氧阴离子的作用，破坏DNA结构及抑制细胞呼吸和DNA复制有关酶的活性而直接造成肾细胞毒性损伤。重金属中毒后，肾组织TNF-α和NO 均升高，且二者呈显著正相关关系，而与反映机体能量代谢的指标——Na+-K+-ATP酶活性呈显著负相关关系，证明了炎症介质和能量障碍相互交织参与重金属中毒后肾损伤的发生。此外，重金属导致肾细胞凋亡的主要原因是大量自由基产生造成氧化损伤。镉引起的中毒性肾病动物模型是一种典型的中毒性肾病动物模型，该模型不但可以用于评价其它重金属引起的中毒性肾病动物模型，而且可以用于评价其它有机或无机化学物质引起的中毒性肾病动物模型。杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的树皮，又名思仙(《本经》)， 木绵、思仲(《别录》)，石思仙(《本草衍义补遗》)。味甘微辛，性温入肝、肾经。具有补肝肾，强筋骨，安胎的功效。用于治疗腰脊酸疼，足膝痿弱，小便余浙，阴下湿痒，胎漏欲堕，胎动不安，高血压。鉴于杜仲良好的效果，药物学家对其化学成分进行了广泛的研究。目前从杜仲中分离的生物活性成分主要有三类，木质素类，环烯醚萜类和黄酮类等化学成分。现代药理研究表明，杜仲的降压作用与松脂醇二葡萄糖苷、生物碱、绿原酸、桃叶珊瑚苷和糖类有关。抗肿瘤作用与木质素、苯丙素和环烯醚萜有关。其水煎液和醇提液均有补肾、增强免疫作用。 杜仲药材还有抗氧化、抗衰老、抗肌肉骨骼老化、抗菌、抗病毒的作用。现有技术尚未见有关于杜仲特别是其提取物，更特别地是其单体化学成分具有例如肾脏保护剂的作用。因此，对杜仲化学基础进行进一步的研究，探寻具有生理活性的组成，这对于为临床上相关疾病的治疗提供新的途径而言具有重要意义。

发明内容
本发明的目的是对杜仲化学基础进行进一步的研究，探寻具有生理活性的组成， 为临床上相关疾病的治疗提供新的途径。本发明人对杜仲进行系统的植物化学分离，令人意外地发现，中药材杜仲，特别是其提取物，更特别地是从杜仲中提取的某些单体化学成分具有有效的肾脏保护剂的作用。本发明基于上述发现而得以完成。为此，本发明第一方面提供了杜仲在制备用于治疗和/或预防中毒性肾病的药物中的用途。根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的中毒性肾病选自急和/或慢性中毒性肾病、急和/或慢性肾功能衰竭、重金属引起的中毒性肾病、化学物质引起的中毒性肾病、镉引起的中毒性肾病、肾病综合征及其并发症。根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物给予哺乳动物，其给药剂量为所述哺乳动物每天每kg体重服用量相当于杜仲药材l_40g，优选2-20g，更优选5-10g。本发明第二方面提供了杜仲提取物在制备用于治疗和/或预防中毒性肾病的药物中的用途。根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的中毒性肾病选自急和/或慢性中毒性肾病、急和/或慢性肾功能衰竭、重金属引起的中毒性肾病、化学物质引起的中毒性肾病、镉引起的中毒性肾病、肾病综合征及其并发症。根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的杜仲提取物中包含至少一种选自以下的成分京尼平、京尼平苷。根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的杜仲提取物中包含京尼平和京尼平苷。在一个实施方案中，所述杜仲提取物中的京尼平与京尼平苷的重量比为0. 1 10 1，优选0.5 2 1，优选1 2 1。根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的药物的剂量为所述哺乳动物每天每kg体重服用量相当于杜仲药材l_40g，优选2-20g，更优选5-10g。根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的杜仲提取物是经如下步骤制备的将杜仲用含水乙醇溶液提取得提取物；或者进一步使所得醇提取物用乙酸乙酯或正丁醇萃取，将萃取物分别回收溶剂后得固形物，即为提取物；或者将杜仲用含水乙醇溶液提取得提取物后，回收溶剂所得提取浓缩液上大孔吸附树脂，20-80 %乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥得提取物。根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的杜仲提取物是经如下步骤制备的a)将杜仲用2 20倍量(优选5 15倍量，更优选8 12倍量，例如10倍量) 的60 98% (优选70 98%，更优选80 98%，例如80%、85%、90%、95%或98%)乙醇浸泡1 M小时(优选1 18小时，更优选8 15小时)；b)回流提取0.5 10小时(优选0.5 8小时，更优选0.5 6小时，更优选
0.5 4小时，更优选1 4小时，例如1小时、2小时、3小时、4小时)，倾出提取液；c)任选地使步骤b)的药渣重复进行步骤a)和步骤b) 1 3次(例如1次、2次、 3次)；d)合并步骤b)和步骤C)的提取液，过滤，滤液回收乙醇至在室温下的密度约为
1.15-1. 20的浓缩液，即可作为本发明的杜仲提取物，其可进一步进行干燥。在一个实施方案中，以上步骤d)的杜仲提取物可进一步用乙酸乙酯或正丁醇萃取，将萃取物分别回收溶剂后得固形物，即为提取物。或者，在一个实施方案中，以上步骤d) 的杜仲提取物可以进一步上大孔吸附树脂(例如D101)，用20-80%乙醇洗脱，将洗脱液浓缩干燥得提取物。上述方法所得的提取物的化学组成可通过本发明下文所述的纯化步骤知晓，或者直接进行色谱分析测得该提取物中包含至少一种选自以下的成分京尼平、京尼平苷。优选的是包含京尼平、京尼平苷两者。本发明第三方面提供了京尼平和/或京尼平苷在制备用于治疗和/或预防中毒性肾病的药物中的用途。根据本发明第三方面任一项的用途，其中所述的中毒性肾病选自急和/或慢性中毒性肾病、急和/或慢性肾功能衰竭、重金属引起的中毒性肾病、化学物质引起的中毒性肾病、镉引起的中毒性肾病、肾病综合征及其并发症。根据本发明第三方面任一项的用途，其中所述药物给予哺乳动物，以所述哺乳动物每天每kg体重计，其中所述各成分单独或任意组合时的剂量可以相互独立地分别为
成分剂量(mg/kg体重/天)京尼平0. OOl-IOOmg(优选 I-IOmg)京尼平苷0. OOl-IOOmg(优选 I-IOmg)根据本发明第三方面任一项的用途，其中所述京尼平和/或京尼平苷各自独立地是化学合成获得的或者是植物提取获得的。在一个实施方案中，所述京尼平和/或京尼平苷各自独立地是植物提取获得的。在一个实施方案中，所述京尼平和/或京尼平苷各自独立地是植物提取获得的，所述植物选自杜仲、桅子。在一个实施方案中，所述京尼平和/或京尼平苷各自独立地是从杜仲提取获得的，并且所述药物的剂量为所述哺乳动物每天每kg 体重服用量相当于杜仲药材l_40g，优选2-20g，更优选5-10g。根据本发明第三方面任一项的用途，其中从杜仲中提取京尼平和/或京尼平苷的步骤如下将杜仲用含水乙醇溶液提取；使所得醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将各萃取物分别回收溶剂后得各萃取溶剂部分的固形物；氯仿部分经过硅胶柱层析(石油醚-丙酮洗脱)后，33 36馏分经反复硅胶柱层析后分别得到白桦脂酸，43 56馏分以氯仿-丙酮进行硅胶柱层析，所得馏分经聚酰胺柱层析后分别得到汉黄芩素和千叶素A ；乙酸乙酯部分通过硅胶柱层析，采取氯仿甲醇溶剂系统梯度洗脱，所得49 55 馏分通过乙酸乙酯-甲醇、氯仿-甲醇溶剂系统反复硅胶柱层析后，得到粉末状物质为京尼平(EUE-3)；正丁醇部分经过DlOl大孔吸附树脂后，30%乙醇水溶剂洗脱部分过硅胶柱层析 (乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱)，18 20流分以氯仿甲醇H2O系统进行硅胶柱层析，所得 8 14流分中析出白色粉末为京尼平苷(EUB30-1)。本发明第四方面提供了一种用于治疗和/或预防哺乳动物(特别是人)中毒性肾病的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的杜仲提取物以及任选的药学可接受的赋形剂。根据本发明第四方面任一项的药物组合物，其中所述的杜仲提取物中包含至少一种选自以下的成分京尼平、京尼平苷。在一个实施方案中，所述的杜仲提取物包含京尼平和京尼平苷，并且京尼平与京尼平苷的重量比为0.1 10 1，优选0.5 2 1，优选1 2 I0根据本发明第四方面任一项的药物组合物，其中所述京尼平、京尼平苷的总量占所述提取物总重量的50-90% (w/w，即重量百分数，下同)，优选10 80% (w/w)，更优选 10 60% (w/w)。根据本发明第四方面任一项的药物组合物，其中所述的药物组合物给予所述哺乳动物的剂量为所述哺乳动物每天每kg体重服用量相当于杜仲药材l_40g，优选2-20g，更优选 5-10g。根据本发明第四方面任一项的药物组合物，其中所述的杜仲提取物是经如下步骤制备的将杜仲用含水乙醇溶液提取得提取物；或者进一步使所得醇提取物用乙酸乙酯或正丁醇萃取，将萃取物分别回收溶剂后得固形物，即为提取物；或者将杜仲用含水乙醇溶液提取得提取物后，回收溶剂所得提取浓缩液上大孔吸附树脂，20-80%乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥得提取物。制备所述提取物的进一步优选的步骤参见本发明第二方面所提及的。本发明第五方面提供了一种用于治疗和/或预防哺乳动物(特别是人)中毒性肾病的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的京尼平和/或京尼平苷，以及任选的药学可接受的赋形剂。根据本发明第五方面任一项的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的京尼平和京尼平苷，以及任选的药学可接受的赋形剂。本发明第六方面提供了一种在有需要的哺乳动物(特别是人)中治疗和/或预防中毒性肾病的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗和/或预防有效量的杜仲，或者施用治疗和/或预防有效量的杜仲提取物，或者施用治疗和/或预防有效量的至少一种选自下列的成分京尼平、京尼平苷。根据本发明第六方面任一项的方法，其中所述的中毒性肾病选自急和/或慢性中毒性肾病、急和/或慢性肾功能衰竭、重金属引起的中毒性肾病、化学物质引起的中毒性肾病、镉引起的中毒性肾病、肾病综合征及其并发症。本发明任一方面或该任一方面的任一项或任一实施方案所具有的特征同样适用于其它任一方面或该其它任一方面的任一项或任一实施方案，只要它们不会相互矛盾；当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。在本发明中，例如，提及“本发明第一方面任一项”时，该“任一项”是指本发明第一方面的任一子方面或者任一实施方案；在其它方面以类似方式提及时，亦具有相同含义。发明详述下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。如本文所述的，术语“杜仲”符合2005年版《中华人民共和国药典一部》“杜仲 (Cortex Eucommiae)，，项下的规定。本文中使用的术语“约”，例如在修饰制备产物的产率时，其通常是指本领域允许的误差范围，例如士 10%，例如士5%，例如士2%。本文中使用的短语“中毒性肾病”具有本领域技术人员公知的一类疾病或症状，并且通常包括但不限于急和/或慢性中毒性肾病、急和/或慢性肾功能衰竭、重金属引起的中毒性肾病、化学物质引起的中毒性肾病、镉引起的中毒性肾病、肾病综合征及其并发症， 等等，还包括这些病症的。术语“并发症”，例如在指中毒性肾病的并发症时，是指随各种原因所致中毒性肾病而同时产生的其它临床病理和/或症状，例如疲乏、腰痛、水肿、蛋白尿、 血尿、尿量减少或增力卩、尿比重降低、尿钠增多、血尿素氮、肌酐升高、轻度肾功能不全、重度肾功能衰竭、尿毒症。术语“肾变病综合征”(nephrotic syndrome,NS)简称肾综，是指由多种病因引起的，以肾小球基膜通透性增加伴肾小球滤过率降低等肾小球病变为主的一组综合征。肾病综合征不是一独立性疾病，而是肾小球疾病中的一组症候群。肾病综合征典型表现为大量蛋白尿、低白蛋白血症、高度水肿、高脂血症。本文中使用的术语“剂量”，例如在指杜仲提取物给予哺乳动物以治疗和/或预防中毒性肾病的剂量，是指足以达到有效的治疗和/或预防的剂量。在本发明的一个实施方案中，达到有效的治疗和/或预防的剂量，不论给予的是杜仲，还是杜仲提取物，或者是京尼平和/或京尼平苷(这两种化学单体不论是否是从植物杜仲提取获得)，此剂量折算成杜仲药材，相当于杜仲药材l_40g/kg体重/天，优选2-20g/kg体重/天，更优选5-10g/kg体重/天。在本发明的一个实施方案中，达到有效的治疗和/或预防的剂量，当以化学单体京尼平和/或京尼平苷(这两种化学单体不论是否是从植物杜仲提取获得)，此剂量对于京尼平和京尼平苷可以各自独立地是0. OOl-lOOmg/kg体重/天，优选0. Ol-lOOmg/kg体重/天， 或者优选0. l-100mg/kg体重/天，或者优选0. 001-10mg/kg体重/天，或者优选0. 001-lmg/ kg体重/天，或者优选0. Ol-lOmg/kg体重/天，或者优选0. 1-lmg/kg体重/天，或者优选 l-10mg/kg体重/天。此外，临床医生会根据诸多因素来确定具体的使用剂量，这些因素例如年龄、性别、一般健康状况、疾病的种类和严重程度等。无论如何，本领域技术人员根据本发明公开可以容易地确定具体情况下的使用剂量。本文中使用的术语“杜仲提取物”，是指由植物药材杜仲经提取而得到的提取物，
9其中至少包含京尼平和京尼平苷中的一种化学成分，特别地，该杜仲提取物中包含京尼平和京尼平苷两者。需要说明的是，该杜仲提取物中还可以包含杜仲中原本存在的其它物质， 例如但不限于白桦脂酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、丁香脂素单葡萄糖苷、汉黄芩素、千叶素A、黄芩素、二氢查耳酮3-0-β-D-葡萄糖苷、α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4，2'，4'-三羟基二氢查耳酮。然而，在特别优选的实施方案中，本发明杜仲提取物中包含京尼平和京尼平苷，并且京尼平与京尼平苷的重量比为0.1 10 1，优选0.5 2 1，优选1 2 1。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中基本上不包含白桦脂酸。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中基本上不包含桃叶珊瑚苷。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中基本上不包含松脂醇二葡萄糖苷。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中基本上不包含丁香脂素二葡萄糖苷。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中基本上不包含松脂醇单葡萄糖苷。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中基本上不包含丁香脂素单葡萄糖苷。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中基本上不包含汉黄芩素。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中基本上不包含千叶素Α。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中基本上不包含黄芩素。在本发明的一个实施方案中， 本发明杜仲提取物中基本上不包含二氢查耳酮3-0-β-D-葡萄糖苷。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中基本上不包含α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基_4，2' ,4'-三羟基二氢查耳酮。在本发明中，术语“基本上不包含”，例如在提及“在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中基本上不包含白桦脂酸”时，是指白桦脂酸的重量占该杜仲提取物重量10%以下，特别是7. 5%以下，特别是5%以下，特别是2. 5%以下，特别是2%以下。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中任选含有下列成分的一种或多种白桦脂酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、丁香脂素单葡萄糖苷、汉黄芩素、千叶素Α、黄芩素、二氢查耳酮3-0-β-D-葡萄糖苷、 α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基-4，2' ,4'-三羟基二氢查耳酮；并且在该杜仲提取物中，这些成分任一种比京尼平的重量百分比小于20%，优选小于15%，优选小于10%，优选小于 5%，优选小于2.5%。在本发明的一个实施方案中，本发明杜仲提取物中任选含有下列成分的一种或多种白桦脂酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷、丁香脂素单葡萄糖苷、汉黄芩素、千叶素Α、黄芩素、二氢查耳酮3-0-β-D-葡萄糖苷、 α-氧-β-D-葡萄吡喃糖基_4，2' ,4'-三羟基二氢查耳酮；并且在该杜仲提取物中，这些成分任一种比京尼平苷的重量百分比小于20%，优选小于15%，优选小于10%，优选小于5%，优选小于2. 5%。本文中使用的术语“重金属引起的中毒性肾病”是指由包括但不限于下列的一种或多种重金属引起的中中毒性肾病汞、铅、金、镉、银、锰、铬、镍、铊、锌、钒、锑、锡、铜、钼、 铋、锗、铁等。本文中使用的术语“化学物质”是指有机或无机的化学物质以及包含它们的组合物、配制品等。本文中使用的术语“化学物质引起的中毒性肾病”是指由包括但不限于下列的一种(类)或多种(类)化学物质引起的中毒性肾病洗涤剂、食品添加剂、化妆品、家用杀虫剂、吸烟、酒精、麻醉剂、致幻剂、药物、抗生素、解热镇痛药、金属制剂、造影剂、利尿剂、中草药、关木通雷公藤等。本领域技术人员已知，测定杜仲药材、杜仲提取物中的京尼平和/或京尼平苷含量，以及测定京尼平产品或京尼平苷产品中主成份的纯度，这些测定方法是容易获得的，例如可以参考文献(例如参见曹晶萍等，反相高效液相色谱法测定桅子中京尼平甙和京尼平的含量，大连医科大学学报，2001(1) :24;特别是例如参考该论文中的液相色谱条件)中的方法或者作些调整。上述方法所得的提取物的化学组成可通过本发明下文所述的纯化步骤知晓，或者直接进行色谱分析测得该提取物中包含至少一种选自以下的成分京尼平、京尼平苷。优选的是包含京尼平、京尼平苷两者。尽管本发明对所涉及的活性成分作了详细描述，本发明人仍然愿意在此强调，这些活性成分(其包括，但不限于，京尼平(genipin)、京尼平苷(geniposide))具有本领域技术人员已知的化学结构、物理化学性质。如本文所述的，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。如本文所述的，术语“药物组合物”，是指可用于在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病、病症、症状的物质。如本文所述的，术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明组合物和提取物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病、病症、症状的动物，特别是哺乳动物，例如人、 狗、猴、牛、马等。如本文所述的，术语“疾病或症状”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病或症状有关。如本文所述的，“ % ”，如未特别指明，对于总物料是固体时一般是指重量/重量的百分比，对于总物料是液体时一般是指重量/体积的百分比。当然，对于总物料是液体并且溶质是液体时，表征该液态溶质的百分比一般是指体积/体积的百分比。本发明药物组合物中使用的“药学可接受的赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的赋形剂。特定赋形剂的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的赋形剂包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合齐U、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、注射乳剂(注射用无菌粉针)等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。本发明人发现，含有京尼平和/或京尼平苷的杜仲提取物有显著的缓解镉诱导的中毒性肾损伤的作用，杜仲提取物给药组大鼠血浆中血清尿素氮(BUN)、肌苷(CRE)指标明显降低，且呈剂量关系。


图1描绘了杜仲提取物对镉诱导的大鼠血浆中肌苷的影响，纵坐标表示肌苷浓度(mg/dl)。图中，N 空白组；Cd 镉模型组；VE 维生素E(500mg/kg) +镉处理组；L :125mg/kg 杜仲提取物+镉处理组；M :250mg/kg杜仲提取物+镉处理组；H :500mg/kg杜仲提取物+镉处理组。各棒表示均值士SD。*，P <0.05 ;m，P< 0.01(与镉模型组比较)。以下各图均具有类似含义。图2描绘了杜仲提取物对镉诱导的大鼠血浆中血清尿素氮量的影响，纵坐标表示尿素氮量浓度(mmol/1)。图3描绘了杜仲提取物对镉诱导的大鼠肾组织谷胱甘肽的影响，纵坐标表示肾组织中的蛋白(protein)浓度(mg/g)。图4描绘了杜仲提取物对镉诱导的大鼠肾组织过氧化氢酶的影响，图中纵坐标为肾过氧化氢酶活性，其以每mg蛋白质(protein)每分钟内消耗的(consumed) H2O2量 (μ mol)计。图5描绘了杜仲提取物对镉诱导的大鼠肾组织中Na+-K+-ATP酶的影响。
具体实施例方式通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。实施例1 杜仲提取物的制备和含量测定杜仲药材500g，加入5000ml 70%乙醇回流提取两次，每次2小时，合并提取液过
滤后浓缩至尽，真空干燥得杜仲提取物。经检测，该提取物中京尼平和京尼平苷的量分别为0. 214%,0. 488%。另外经检测，发现该提取物中下列物质的量为京尼平苷酸0.925%，绿原酸 0. 302 %，松脂醇二葡萄糖苷0. 99 %，丁香质素二葡萄糖苷0. 34 %。^MM 2 从ti仲泡丨备iM平禾PiM平苷化合4勿并对 表征将31. 5千克杜仲药材(购自河南信阳药材公司)剪成小块，加入315升95%乙醇浸泡过夜，回流提取2小时，倾出提取液，药渣再加入315升95%乙醇回流提取2小时，提取液合并后过滤，续滤液回收乙醇，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别回收溶剂后得固形物。结果石油醚部分固形物153g，氯仿部分固形物384g，乙酸乙酯部分固形物 126g,正丁醇部分固形物520g。杜仲乙酸乙酯萃取部分，通过硅胶柱层析，采取氯仿甲醇溶剂系统梯度洗脱， 19 27馏分再利用硅胶柱层析，通过石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱，得到粉末状物质，经鉴定为京尼平。杜仲正丁醇部分500g过DlOl大孔吸附树脂后，30 %部分130g进行硅胶柱色谱分离，KOAc CH30H溶剂系统梯度洗脱，18 20流分以CHC13 CH30H H20系统进行硅胶柱层析，所得8 14流分中有白色粉末析出，标记为EUB30-1，跟文献值比对后，确定 EUB30-1为京尼平苷。京尼平，白色粉末。1H-WR(CD3ODjOOMHz) δ 4. 18 (1Η, d, J = 8. OHz, H-1)，7. 53 (1H, s, H-3)，3. 14 (1H, m, H-5)，2. 83 (1H, m, H-6)，2. 03 (1H, m, H-6)，5. 83 (1H, s, H-7)， 2. 47 (1H, t, J = 8. 5Hz, Η_9)，4· 25 (2Η, dd, J = 14. 5Hz, Η-10)，3· 71 (3H, s, -0CH3)。京尼平苷，白色针状结晶(甲醇)，mp为159 160°C，Molish反应显阳性，酸水解后糖部分经薄层色谱检识证明仅含有D-葡萄糖。IH-NMR(OT3OD) :7.51(1H，s, H-3), 5. 79(lH,br. s，H_7)，5. 16(lH，d，J = 7. 8Hz，H_l)，4. 70(lH，d，J = 8. 0Hz，H_l' )，4. 19 (2H, q, H-10)，3. 70 (3H, s, H-12)，2. 70 (2H, t, J = 16. OHz, H-6)，2. 10 (1H, q, H-5)。13C-NMR (CD3OD) :98. 2 (C-I), 153. 4 (C_3) ,112. 5 (C_4)，39. 7 (C_5)，36. 6 (C_6)， 128. 3 (C-7) , 144. 8 (C_8) , 47. 0 (C_9) , 6 1. 4 (C-l0) , 169. 5 (C-l 1) , 51. 7 (C-12), 100. 3 (C-I' ) ,74. 8(C-2' )，78.4(C_3' )，71.5(C_4' )，77.8(C_5' )，62.6(C_6')。以上理化数据及波谱数据与文献一致，鉴定化合物为京尼平苷。实施例3 杜仲提取物拮抗重金属诱导的中毒件肾病研究在本文中，如未另外特别说明，进行生物学试验所使用的杜仲提取物是实施例1 获得的提取物。大鼠48只，EXCEL随机分成6组，分别为空白组(N)，镉模型组(Cd)，阳性药组 (VE)，杜仲提取物低剂量组(L)，杜仲提取物中剂量组(M)，杜仲提取物高剂量组(H)。称取2. 5g维生素E (犯)置25ml锥形瓶中，25ml 5%阿拉伯胶水溶液溶解，维生素 E 浓度 100mg/ml。高浓度杜仲提取物样品(100. Omg/ml)称取杜仲提取物20. Og充分溶解于200ml 5 %阿拉伯胶水溶液中，得高浓度杜仲提取物样品，浓度100mg/ml。中浓度杜仲提取物样品(50mg/ml)精密量取高浓度杜仲提取物样品(IOOmg/ ml) 50ml，5%阿拉伯胶水溶液稀释1倍，得中浓度杜仲提取物样品，浓度50mg/ml。低浓度杜仲提取物样品(25mg/ml)精密量取中浓度杜仲提取物样品(50mg/ ml) 50ml，5%阿拉伯胶水溶液稀释1倍，得低浓度杜仲提取物样品，浓度25mg/ml。CdCl2溶液的配置精密称取CdCl2 ·5/2Η20固体25mg置于IOml容量瓶中，生理盐水溶解并定容到刻度，得CdCl2溶液样品，浓度2. 5mg/ml。模型组大鼠灌胃5%阿拉伯胶水溶液lml/100g(即每IOOg大鼠体重灌胃Iml试药，下同)，阳性对照组大鼠灌胃维生素E溶液lml/100g，低剂量组大鼠灌胃低剂量杜仲提取物溶液lml/100g，中剂量组大鼠灌胃中浓度杜仲提取物溶液lml/100g，高剂量组大鼠灌胃高浓度杜仲提取物溶液lml/100g。分别灌胃给药5天。第五天时给药后lh，腹腔注射CdCl2溶液lml/kg大鼠，造模型。造模后2h，取血1ml，离心后取上清液得血浆样品待检；造模后4h，处死动物，取右肾组织置固定液中，左肾组织称重后生理盐水制成 10%的勻浆液，4000转/分钟离心lOmin，取上清液得肾组织勻浆液样品待检。血浆样品检测肌苷(CRE)、血清尿素氮(BUN)指标；肾组织勻浆液检测谷胱胺肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)和Na-K-ATP酶(Na-K-ATP)指标。结果见图1至图5。由结果可以看出，染隔后模型组实体肾损伤明显，CRE和BUN升高，而给与抗氧化剂维生素E和杜仲提取物可以明显减低CRE和BUN的升高，显现对大鼠实体肾损伤的保护作用。肾组织中GSH、CAT和Na+-K+-ATP酶的检测结果也支持了杜仲提取物对镉诱导的急性肾损伤的保护作用。棚列4擺Φ雜成/诚尼啊晾尼平■射嫌使用实施例2获得的京尼平和京尼平苷进行试验。按实施例3所述方法，大鼠40只，分成5组。分别时空白组、模型组、阳性药组、京尼平组、京尼平苷组。称取2. 5g维生素E (犯)置25ml锥形瓶中，25ml 5%阿拉伯胶水溶液溶解，维生素 E浓度100mg/ml。称取Ig京尼平、Ig京尼平苷分别置25ml锥形瓶中，25ml 5%阿拉伯胶水溶液溶解，京尼平和京尼平苷的浓度分别为40mg/ml。CdCl2溶液的配置精密称取CdCl2*5/2H20固体25mg置于IOml容量瓶中，生理盐水溶解并定容到刻度，得CdCl2溶液样品，浓度2. 5mg/ml。模型组大鼠灌胃5%阿拉伯胶水溶液lml/100g(即每IOOg大鼠体重灌胃Iml试药，下同)，阳性对照组大鼠灌胃维生素E溶液lml/100g，京尼平组大鼠灌胃京尼平溶液 lml/100g，京尼平苷组大鼠灌胃京尼平苷溶液lml/100g。分别灌胃给药5天。第五天时给药后lh，腹腔注射CdCl2溶液lml/kg大鼠，造模型。造模后2h，取血1ml，离心后取上清液得血浆样品待检；造模后4h，处死动物，取右肾组织置固定液中，左肾组织称重后生理盐水制成 10%的勻浆液，4000转/分钟离心lOmin，取上清液得肾组织勻浆液样品待检。血浆样品检测肌苷(CRE)、血清尿素氮(BUN)指标；结果如下
CRE(mg/dl)BUN(mmol/1)空白组0. 66±0. 06 *5. 38±0. 20*模型组0. 88 ±0. 096. 30±0. 25阳性组0. 79±0. 02 *5. 85±0. 43京尼平组0. 66±0. 02 *4. 72±0. 15*京尼平苷组0. 69±0. 03 *5. 57±0. 17其中*表示和模型组对比P < 0. 05，有显著性差异。肾组织勻浆液检测谷胱胺肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)和 Na-K-ATP 酶(Na-K-ATP)指标。
权利要求
1.杜仲在制备用于治疗和/或预防中毒性肾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述的中毒性肾病选自急和/或慢性中毒性肾病、急和/或慢性肾功能衰竭、重金属引起的中毒性肾病、化学物质引起的中毒性肾病、镉引起的中毒性肾病、肾病综合征及其并发症。
3.杜仲提取物在制备用于治疗和/或预防中毒性肾病的药物中的用途。
4.根据权利要求3的用途，其中所述的中毒性肾病选自急和/或慢性中毒性肾病、急和/或慢性肾功能衰竭、重金属引起的中毒性肾病、化学物质引起的中毒性肾病、镉引起的中毒性肾病、肾病综合征及其并发症。
5.根据权利要求3至4任一项的用途，其中所述的杜仲提取物中包含至少一种选自以下的成分京尼平、京尼平苷。
6.根据权利要求3至5任一项的用途，其中所述的杜仲提取物中包含京尼平和京尼平苷。在一个实施方案中，所述杜仲提取物中的京尼平与京尼平苷的重量比为0.1 10 1， 优选0. 5 2 1，优选1 2 1。
7.京尼平和/或京尼平苷在制备用于治疗和/或预防中毒性肾病的药物中的用途。
8.根据权利要求7的用途，其中所述的中毒性肾病选自急和/或慢性中毒性肾病、急和/或慢性肾功能衰竭、重金属引起的中毒性肾病、化学物质引起的中毒性肾病、镉引起的中毒性肾病、肾病综合征及其并发症。
9.用于治疗和/或预防哺乳动物(特别是人)中毒性肾病的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的杜仲提取物以及任选的药学可接受的赋形剂。在一个实施方案中， 所述的杜仲提取物中包含至少一种选自以下的成分京尼平、京尼平苷。在一个实施方案中，所述的杜仲提取物包含京尼平和京尼平苷，并且京尼平与京尼平苷的重量比为0. 1 10 1，优选0.5 2 1，优选1 2 1。
10.用于治疗和/或预防哺乳动物(特别是人)中毒性肾病的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的京尼平和/或京尼平苷，以及任选的药学可接受的赋形剂。
全文摘要
本发明涉及杜仲化学成分作为肾脏保护剂的新用途。具体地说，本发明涉及杜仲或杜仲提取物在制备用于治疗和/或预防中毒性肾病的药物中的用途。本发明还涉及京尼平和/或京尼平苷在制备用于治疗和/或预防中毒性肾病的药物中的用途。本发明发现杜仲提取物及其中的一些化学成分可以用作有效的肾脏保护剂，用于治疗和/或预防肾脏疾病。
文档编号A61K31/7048GK102198166SQ20111013393
公开日2011年9月28日 申请日期2011年5月23日 优先权日2011年5月23日
发明者刘二伟, 樊官伟, 王涛, 胡利民, 韩立峰, 高秀梅 申请人:天津中医药大学