专利名称：含有人生长激素的药物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有分子量大约为20,000的人生长激素(下文称作20k hGH)的药物制剂，尤其涉及含有20k hGH的溶液冻干制剂，所述制剂具有极好的贮存稳定性并且当再配制时不产生任何外来物或不溶物，本发明还涉及所述制剂的生产方法。
有两种已知类型的人生长激素一种分子量大约为22,000(22khGH)，另一种分子量大约为20,000(20k hGH)。22khGH可通过重组DNA技术的方法来生产并可用于治疗儿科垂体性侏儒。20k hGH尚未在工业规模生产并且它尚未用于医学治疗中。
20k hGH是单链多肽，其分子量大约为20,000并且其等电点大约为5.5。因此，它在中性PH的水溶液中是稳定的，但在酸性和碱性PH范围是不稳定的。在弱酸至弱碱PH范围的水溶液中，20k hGH的溶解度小于大约1mg/ml并且当它从冷冻溶液中解冻时产生不溶性物质。因此，可认为20k hGH是具有很低溶解度的蛋白质。此外，在弱酸至弱碱PH范围的水溶液中，20k hGH容易聚合成二聚物。据报道，由人类垂体产生的20k hGH通常与22k hGH，即分子量大约为22,000的人生长激素共聚或聚合成二聚物(chapman等，J.Biol.chem.，Vol.256，2395-2401，1981)。这些事实表明20k hGH的溶解度低是由蛋白质分子的疏水性相互作用引起的。
为了改善高度疏水蛋白质的溶解性，通常使用十二烷基硫酸钠(它是一种极强的表面活性剂)或变性剂(如尿素和盐酸胍)等。然而，这些试剂破坏蛋白质的结构并且将失去或减弱蛋白质的主要功能。所以，如果蛋白质用在药物制剂中时，使用这些常规试剂根本就是不合适的。
另一方面，使用溶解度促进剂来改善蛋白质溶解度的一个已知的例子是，加入等摩尔量的组氨酸和肌酸酐(具有正电荷)和柠檬酸(具有负电荷)来改善修饰形式的组织纤维蛋白溶媒原激活剂(下文称作tPA)(USP4980165)的溶解度。tPA和修饰的tPA是在中性PH范围时极难溶解而在酸性PH范围时易于溶解的蛋白质。换句话说，tPA和修饰的tPA的低溶解度是由该蛋白质的等电沉淀引起的，通过加入组氨酸和肌酸酐(具有正电荷和柠檬酸(具有负电荷)来抑制。
含有分子量约为22000的人生长激素的药物制剂的配方(现在可以购得的)显示在表1中。这些制剂通常通过皮下或肌内给药。
而且，这些22k hGH制剂主要含有甘氨酸或甘露糖醇并可在5℃的储存条件下稳定1年。
表1可购得冻干22k hGH的配方产品名称添加剂 重新配制的溶液Genotropin(Kabi Pharmacia4IU 甘氨酸24mg注射用水1mlSumitomo)Norditropin(Nordisk) 4IU 甘氨酸24mg注射用水1mlD-甘露糖醇2.4mgHumatrope(Lilly) 4IU 甘氨酸1.48mg 盐水2mlD-甘露糖醇7.4mgSaizen(Serono) 4IU D-甘露糖醇20mg盐水1mlGroject(Bio-Tech 4IU D-甘露糖醇40mg盐水1mlGeneral)本发明人的研究表明，当如上制备冻干20k hGH制剂时不能得到稳定的制剂。
如果不能获得用于制备如上所给予制剂的足够浓度的20k hGH稳定水溶液，那么，剂量不得不增加。这对于注射20k hGH制剂来说可能是极为不便的。
一些稳定溶液中22k人生长激素的配合方法是已知的。报告的实例包括加入作为22k hGH水溶液稳定剂的精氨酸和EDTA(EP公开号639984)，加入多元醇或氨基酸以便控制不溶物质的产生并维持22k hGH溶液中可溶物质的活性(EP303746)以及加入作为稳定剂的组氨酸以便抑制22k hGH水溶液中相关物质的增加(EP公开号618807)。然而，所有这些方法都用于使溶液中的22k hGH稳定，而没有涉及使冻干的22k hGH产品稳定。而且，关于稳定20k hGH的冻干制剂是未知的。
本发明人研究了20k hGH的溶解性和稳定性。如表2所示，该结果显示除了分子量比22k hGH低之外，20k hGH在理化特性(如生理活性、稳定性和溶解性)上与22k hGH是十分不同的。特别是，原始20k hGH本体溶液即使在冻干之后也是不稳定的。当其冻干制剂在5℃温度下贮存时，相关物质的量随时间而增加，如脱酰氨基变种(其中20khGH中的Asp134脱酰氨基成Asp134)和亚砜变种(其中Met14转化为ox-Met14)和高分子量聚合物产物。相关的物质如单脱酰氨基变种(其中20k hGH中的Asn134脱酰氨基为Asp134)、二脱氨基变种(其中除Asn134之外，Asn137也被脱去酰氨基)和亚砜变种(其中Met14转化为ox-Met14)。而且，在操作(如吸移)溶有20k hGH的溶液时，蛋白质易于凝集而产生不溶性物质。换句话说，水溶液的稳定性是低的。如下文所述，即使将碱性氨基酸加到20k hGH中，也不能抑制不溶性物质或相关物质的产生。如上文所述，20k hGH是高度疏水的，这可以解释为什么它比22k hGH更易于产生不溶性物质。
表220k hGH与22k hGH在理化性质上的区别理化性质 20k hGH 22k hGH等电点 PH5.51PH5.11二聚物的形成 易于形成2难以形成2疏水性 高3低3水溶性 低3高3冻干hGH的稳定性 低3高3溶解的hGH的稳定性低3高31Endocrine Reviews，第12卷，314-324，1991。2J.Biol.Chem.第256卷，2395-2401，1981。3由本发明人获得的数据。
如上文所述，简单地通过应用常规的22k hGH配合制剂来获得以溶解和稳定形式维持20k hGH生理活性的溶液是非常困难的。因此，十分需要开发新的配合配方，它是稳定的20k hGH药物制剂，并保持合适的注射浓度。
而且，因为仅冻干20k hGH不能防止相关物质和高分子量聚合产物的产生，需要开发含有20k hGH的稳定的冻干药物制剂，它很少产生相关物质或高分子量聚合物。
因此，本发明的一个目的是提供含有20k hGH的且溶于水时很少产生由20k hGH衍生的不溶性物质的药物制剂。本发明的另一目的是提供含有20k hGH的冻干制剂，它抑制重组之后相关物质和高分子量聚合产物的产生。
本发明的另一目的是提供一种方法，该方法可防止含有20k hGH的药物制剂中20k hGH的不溶解化，以便改善其稳定性，而且也提供一种抑制含有20k hGH的冻干制剂中随时间而产生相关物质和高分子量聚合产物的方法。
本发明人进行了广泛的研究来完成上文所述的目的，也就是说，改善了20k hGH的溶解性和稳定性并提供了冻干时稳定的20k hGH制剂的配合配方。其结果是，本发明人成功地制备了含有20k hGH的药物制剂，它具有极好的溶解性和稳定性。
而且，本发明人发现，将碱性氨基酸和非离子表面活性剂加到含有20khGH的冻干制剂中时，可抑制冻干制剂中相关物质的产生改善了稳定性，这样，当在水中进行重新配制时，所述冻干制剂不产生任何不溶性物质，因此完成了本发明。
也就是，本发明包括含有具有大约20000分子量的人生长激素或其衍生物和水溶性杂环化合物的药物制剂；通过加入水溶性杂环化合物来防止分子量约为20000的人生长激素或其衍生物的不溶解化的方法，从而改善了含有所述人生长激素或其衍生物的药物制剂的稳定性；以及通过加入一种或两种碱性氨基酸或其盐和非离子表面活性剂来抑制含有分子量约为20000的人生长激素或其衍生物的冻干制剂中相关物质随时间的产生的方法。
本发明人发现通过将水溶性杂环化合物(如肌酸酐)以一定浓度加到20k hGH制剂中可改善20k hGH的溶解度，所述制剂中所用的常用于生理物质的缓冲溶液不会提供足够浓度的用作药物制剂的20k hGH。
而且，通过控制水性20k hGH的PH值，防止极少量不溶性物质的产生是可能的。也发现，通过加入非离子表面活性剂(如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80*)可改善解冻时溶液的稳定性，而且，通过加入碱性氨基酸和甘露糖醇(一种糖醇)可改善冻干制剂和在重新配制时的稳定性。这些发现能够容易地来大量生产含有冻干20k hGH的药物制剂，该制剂可被重新配制来制成适于注射的水溶液。
本发明的生长激素是具有大约20000分子量的人生长激素(20khGH)并且所述人生长激素可以是一种天然激素或一种通过重组DNA技术的方式获得的激素。
*聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80(Polysorbate 80)在技术字典中译为缩聚山梨醇油酸酯80。以下均同。
本发明20k hGH的实例包括那些具有下文所示氨基酸序列的(即，SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)；然而，在SEQID NO1和SEQ ID NO2的整个氨基酸序列中有一个或几个不同的氨基酸的那些20k hGH也在本发明的范围之内，只要所得20khGH保留其生理特性。SEQ ID NO1Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr35 40 45Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu50 55 60Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val65 70 75Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala80 85 90Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly95 100 105Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr110 115 120Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser125 130 135His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys140 145 150Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val155 160 165Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe170 175SEQ ID NO2Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Ser Leu1 5 10 15Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu20 25 30Phe Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr35 40 45Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu50 55 60Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val65 70 75Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala80 85 90Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly95 100 105Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr110 115 120Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser125 130 135His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Ash Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys140 145 150Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val155 160 165Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe170 175
本发明含20k hGH药物制剂中，在冻干之前，所含20k hGH的浓度为0.5到10.0mg/ml，优选1.0到3.0mg/ml，更优选1.5到2.5mg/ml。而且，在冻干制剂的重新配制溶液中20khGH的有效浓度低于10mg/ml。
本发明含20k hGH的药物制剂含有水溶性杂环化合物，以便改善所制备的溶液中和重新配制的冻干溶液中20k hGH的溶解性。本发明所使用的水溶性杂环化合物为一种或多种选自肌酸酐、乙酰色氨酸的盐(如乙酰色氨酸钠)和烟酰胺的化合物；然而，肌酸酐是优选的。制备的溶液或重新配制冻干制剂的溶液中所述水溶性杂环化合物的浓度为0.1％到10％，优选0.3％到5％。
本发明含20k hGH的药物制剂的PH值为5到8，优选6.0到7.8，更优选6.5到7.6。
当需要调节PH时，可使用简单的PH调节剂，如盐酸、磷酸和硫酸，或使用缓冲溶液如三(羟甲基)氨基甲烷，磷酸，马来酸，琥珀酸，柠檬酸，乙酸，组氨酸或其盐。磷酸或其盐是优选的。所述缓冲剂的浓度为0.1mM到100mM，优选5mM到50mM。
可用于本发明含20k hGH冻干制剂的碱性氨基酸如赖氨酸、组氨酸、精氨酸或其盐。所加入的碱性氨基酸的量为1-20重量份(与1重量份的20k hGH相比)，优选为2-15重量份。
而且，本发明含20k hGH的东干制剂可含有非离子表面活性剂来改善所述冻干制剂重新配制后20k hGH的稳定性。本发明所使用的非离子表面活性剂为聚氧乙烯聚氧丙烯二醇和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇，聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯20*或聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80。聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯20或/和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80是优选的。聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80是更优选的。重新配制冻干制剂的溶液中非离子表面活性剂的浓度为0.02％-1％，优选0.02％-0.2％。
此外，本发明含20k hGH的冻干制剂可与赋形剂配合来改善冻干后块状物的外观。赋形剂的例子是糖醇，如甘露糖醇。在重新配制的冻干制剂的溶液中，所述赋形剂的浓度为0.1％-5％，优选为0.5％-2％。
*聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯20(Polysorbate 20)在技术字典中译为吐温20。以下均同。
在将稀释的20k hGH溶液加到用上述水溶性杂环化合物补充的水溶液中之后，可调节本发明药物制剂的PH值。
而且，优选将本发明药物制剂转化为冻干产物。对产生冻干制剂的方法和条件没有限制。例如，通过将稀释的20k hGH溶液加到用上述水溶性杂环化合物补充的水溶液中，并且可以加入或不加入特定量的碱性氨基酸、非离子表面活性剂和赋形剂，如果需要，调节PH，在-30℃到-80℃下冷冻所得混合物，然后通过常规方法减压干燥来进行冻干。
此外，本发明的药物制剂用于注射时，可用合适的注射用水或含有渗透压调节剂(如氯化钠或葡萄糖或糖醇)的溶液来重新配制冻干溶液。
通过下列实施例将更详细地解释本发明，然而，本发明不受这些实施例的限制。
实施例1加入肌酸酐对20k hGH溶解性的影响通过重组DNA技术制备实施例1-9中使用的20k hGH。更具体来说，按照美国专利5496713所述方法，使用转化细胞菌株MT-10765(根据布达佩斯条约以登记号FERM BP-5020保藏在theNational Institute of Bioscienceand Human-Technology of the Agencyof Industrial Science & Technologyof the Ministry of InternationalTrade and Industry；保藏日期为1995年2月28日)制备。也就是，将载有编码20k hGH的基因的表达和分泌质粒引入大肠杆菌中，并在含有polypeptone、酵母提取物，甘油等的培养基培养所得转化细胞MT-10765。培养完成后，离心收集细菌细胞并通过渗透震荡(osmotic shock)法使细胞外膜破裂来回收胞质部分。按照已知的方法或其改进的方法从胞质中分离和纯化20k hGH。
将尿素加到含有0.2mg/ml-0.4mg/ml的如上获得的20k hGH水溶液中，并将混合物浓缩到约8mg/ml。将所得浓缩溶液分部分分别加到过滤柱上，所述各柱分别是用含有0％，0.3％(27.8mM)，0.6％(55.5mM)，1.25％(11.1mM)，2.5％(221mM)和5％(442mM)浓度肌酸酐的20mM磷酸钠缓冲液(PH6.5)平衡的。通过凝胶过滤除去尿素并通过用含有上文所述各浓度的肌酸酐的20mM磷酸钠缓冲液置换来洗脱纯化部分。测量各纯化部分的蛋白质的浓度并肉眼评价各部分溶液外观的改变。加入肌酸酐的效果显示在表3中。由表3结果可证明，溶液中的肌酸酐改善了20k hGH的溶解性。而且经凝胶过滤获得的纯化部分中20k hGH浓度随肌酸酐浓度的增加而增加。对本发明所使用的其它杂环化合物(即乙酰色氨酸钠和烟酰胺)的评价表明它们具有与肌酸酐相似的效果。
此外，当使用由转化细胞MT-10712(根据布达佩斯条约以登记号FERM BP-4361保藏在the National Insti-tute of Bioscience and Human-Techno-logy of thd Agency of IndustrialScience & Technology of the Ministryof International Trade and Indus-try；保藏日期为1993年7月14)获得的20k hGH按与上文相同的方法进行实验时获得了类似的效果。
这些结果显示未加入等摩尔量的负电荷化合物时，加入肌酸酐是有效的。这表明加入肌酸酐而影响20k hGH的溶解性不是通过防止等电沉淀引起的。
表3加入肌酸酐对20k hGH溶解性的影响溶液中肌酸酐 由凝胶过滤纯化的部分的浓度(％)溶液外观 浓度(mg/ml)0 + 未测量0.3- 2.90.6- 3.11.25 - 4.12.5- 4.55.0- 4.8注+产生沉淀；-澄清。实施例2加入聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80对冷冻/解冻之后20k hGH水溶液的溶液外观的影响将聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80(商品名称吐温80)分别以0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1和0.2％的浓度加到上文表3所示的含有1.25％(111mM)肌酸酐的20k hGH溶液中。在由透明玻璃制造的四面容器中于6000勒克斯荧光灯下肉眼观察各个20k hGH溶液在冷冻前和解冻后的改变。所使用的20k hGH的浓度约为2mg/ml。加入聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80的效果显示在表4中。结果揭示，以大于0.02％的浓度加入聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80可防止因冷冻和解冻所引起的20k hGH产生少量不溶性物质，从而证明了该溶液可保持稳定。
表4加入聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80对冷冻/解冻之后20k hGH溶解性的影响溶液中聚氧乙烯山梨 20k hGH水溶液冷冻前和解冻醇脂肪酸酯80的浓度 后溶液外观的变化冷冻前 解冻后0 - ++0.005 - +0.01 - +0.02 - -0.05 - -0.1 - -0.2 - -注-透明；+略有不溶性物质；++有明显的不溶性物质。实施例3加入甘露糖醇对20k hGH冻干块和重新配制后的溶液的外观的影响将甘露糖醇作为赋形剂以0、1.0和5.0％的浓度加到20k hGH的水溶液中，该溶液分别含有如表4所示的0.05％和0.2％浓度的聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80和1.25％(111mM)浓度的肌酸酐。将混合物分装到各个小瓶中，将其从5℃冷却到-40℃，并在-40℃下冷冻5小时。然后在减压下，将温度从-40℃升高到-25℃，此后，在-25℃下再将小瓶减压干燥60小时。接着，减压下将温度升至15℃，在此温度下，将小瓶干燥6小时。观察所得冻干块的外观之后，将1ml注射用蒸馏水加到各个块中，在6000勒克斯的荧光灯下观察重新配制溶液的外观。加入甘露糖醇的效果显示在表5中。表5结果显示，通过加入甘露糖醇改善了冻干块的外观和易成型性。而且，证明重新配制的溶液是极好的，没有不溶性物质。
表5加入甘露糖醇对20k hGH冻干制剂和重新配制后的溶液的外观的影响溶剂组成物 冻干块的外观重新配制后的浓度(％) 溶液的外观肌酸酐吐温80甘露糖醇1.250 0△ ++1.250.05 0○ -1.250.05 1.0 ◎ -1.250.05 5.0 ◎ -1.250.20○ -1.250.21.0 ◎ -1.250.25.0 ◎ -注-透明；+有少量的不溶物；++有明显可见的不溶物；△稍差；○好；◎极好。实施例4加入碱性氨基酸和/或甘露糖醇对20k hGH冻干制剂重新配制后产生不溶性物质的影响制备含有2mg/ml 20k hGH、特定量碱性氨基酸或其盐酸盐、1.25％(111mM)肌酸酐、2.5％甘露糖醇和0.05％聚氧乙烯山梨醇酯肪酸酯80的水溶液并用磷酸二氢钠和氢氧化钠将PH调节到7.6。然后，按每份1ml，将溶液分装到小瓶中，并从5℃冷却到-40℃，在-40℃下冷冻5小时。然后在减压下，将温度从-40℃升高到-25℃，此后再将小瓶在-25℃下减压干燥60小时。接着，减压下，将温度升高到15℃，并在此温度下将小瓶干燥6小时。用1ml注射用蒸馏水重新配制所得冻干的制剂并在5℃下贮存7天。在6000勒克斯的荧光灯下观察第0天和7天时溶液的状态。结果显示在表6中。
表6碱性氨基酸对溶液中不溶性物质产生的影响碱性氨基酸/甘溶液的状态露糖醇加入的量(mg) pH0天7天氨基酸- 0 6.5 - +- 0 7.6 - -盐酸精氨酸 4.2 7.6 - +盐酸精氨酸 6.0 7.6 - +盐酸精氨酸+甘露糖醇4.2 7.6 - -盐酸精氨酸+甘露糖醇6.0 7.6 - -组氨酸 6.0 7.6 - +盐酸赖氨酸 6.0 7.6 - +注-透明；±很少有不溶性物质；+略有不溶性物质；++明显有不溶性物质。
如表6显示，碱性氨基酸不抑制20k hGH溶液中不溶性物质的产生，相反具有有害的作用。这些结果证明，通过加入甘露糖醇和控制PH可抑制产生不溶性物质。实施例5加入碱性氨基酸对20k hGH冻干制剂重新配制后的溶液中相关物质增加的影响除了将含有20k hGH的水溶液的PH调节到7.6外，按实施例4所述的方法进行实验。通过液相色谱定性测量第0天和7天的相关物质(脱酰氨基变种和亚砜变种)。结果显示在表7中。
表7碱性氨基酸对相关物质产生的影响加入的碱性氨基酸 相似物质(％)氨基酸加入的量pH 0天7天增加(mg)-07.65.15.40.3盐酸精氨酸 4.2 7.65.15.50.4盐酸精氨酸 6.0 7.65.15.50.4组氨酸 6.0 7.65.25.50.3盐酸赖氨酸 6.0 7.65.25.60.4如表7所示，加入碱性氨基酸没有作用，其既不增加也不减少溶液中相关物质的量。实施例6加入精氨酸和盐酸精氨酸对增加20k hGH冻干制剂中相关物质的影响制备各个含有2mg/ml 20k hGH、特定量精氨酸或盐酸精氨酸、1.25％(111mM)肌酸酐、0.05％聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80的水溶液并用磷酸氢二钠和氢氧化钠将PH调节到7.6。然后，按每份1ml，将溶液分装到小瓶中，并从5℃冷却到-40℃，在-40℃下冷冻5小时。然后在减压下，将温度从-40℃升高到-25℃，此后再将小瓶在-25℃下减压干燥60小时。接着，减压下，将温度升高到15℃，并在此温度下将小瓶干燥6小时。将所得冻干制剂在40℃下贮存2周。通过液相色谱测量第0天和2周时相关物质的浓度。结果显示在表8中。
如表8所示，加入精氨酸或盐酸精氨酸可抑制相关物质的产生。
表8加入精氨酸或盐酸精氨酸对冻干制剂中相关物质产生的影响碱性氨基酸类似物(％)氨基酸 加入量(mg) 0天2周后增加- 03.910.7 6.8盐酸精氨酸1.05 3.77.0 3.3盐酸精氨酸4.20 3.85.6 2.2盐酸精氨酸6.00 3.75.5 1.8盐酸精氨酸26.7 7.68.2 0.6精氨酸4.96 3.97.0 3.1实施例7加入盐酸赖氨酸和组氨酸对20k hGH冻干制剂中相关物质增加的影响制备各个含有2mg/ml 20k hGH、特定量盐酸赖氨酸或组氨酸、1.25％肌酸酐、0.05％聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80的水溶液并用磷酸氢二钠和氢氧化钠将PH调节到7.6。然后，按每份1ml，将溶液分装到小瓶中，并从5℃冷却到-40℃，在-40℃下冷冻5小时。然后在减压下，将温度从-40℃升高到-25℃，此后再将小瓶在-25℃下减压干燥60小时。接着，减压下，将温度升高到15℃，并在此温度下将小瓶干燥6小时。将所得冻干制剂在40℃下贮存2周。通过液相色谱测量第0天和2周时相关物质的浓度。结果显示在表9中。
如表9所示，加入碱性氨基酸及其盐(即组氨酸和盐酸赖氨酸)倾向于以上述精氨酸和盐酸精氨酸的相同方式抑制相关物质的产生。
表9加入碱性氨基酸对冻干制剂中相关物质产生的影响碱性氨基酸 相关物质(％)氨基酸 加入量(％)0天2周后增加- 0 3.910.7 6.8组氨酸 4.43.85.8 2.0盐酸精氨酸 5.23.95.6 1.8实施例8加入碱性氨基酸对20k hGH冻干制剂中高分子量聚合物产生增加的影响制备各个含有2mg/ml 20k hGH、特定量碱性氨基酸、1.25％肌酸酐、0.05％聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80的水溶液并用磷酸氢二钠和氢氧化钠将PH调节到7.6。然后，按每份1ml，将溶液分装到小瓶中，并从5℃冷却到-40℃，在-40℃下冷冻5小时。然后在减压下，将温度从-40℃升高到-25℃，此后再将小瓶在-25℃下减压干燥60小时。接着，减压下，将温度升高到15℃，并在此温度下将小瓶干燥6小时。将所得冻干制剂在40℃下贮存2周。通过电泳(SDS-PAGE)测量0天和2周后高分子量聚合物的浓度。也就是，用注射用水溶解小瓶中的冻干制剂并在沸水浴上，在有或没有还原剂(巯基乙醇)下加热3分钟。将各个样品溶液加到(每孔10μl)电泳用聚丙烯酰胺梯度凝胶中，以恒电流进行后续银染色。结果显示在表10中。
如表10所示，加入碱性氨基酸可抑制高分子量聚合物产物的产生。
表10加入碱性氨基酸对冻干制剂中高分子量聚合物产生的影响碱性氨基酸 高分子量聚合产物(2周后)氨基酸 加入量(mg) 未还原 还原无 0+++ ++盐酸精氨酸 2.1 ++ +盐酸精氨酸 4.20 +±盐酸精氨酸 6.00 ± -盐酸精氨酸 26.7 --精氨酸 6.0 +±盐酸赖氨酸 5.2 +±组氨酸 4.4 +±在SDS-PAGE上高分子量聚合产物的色带+++浓色；++清晰的颜色；+有色；±略有颜色；-无色。实施例920k hGH冻干制剂将含有20k hGH(2mg/ml)、肌酸酐(1.25％，111mM)和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80(0.05％)的溶液(560ml)(保持冷冻)在流动水中解冻并滤过0.22μm滤器。将15g D-甘露糖醇和5.52g盐酸精氨酸加到510ml的该滤液中，并用搅棒在冰上溶解。等大约14ml的0.5N的氢氧化钠溶液加到在冰上的溶液中来调节PH到7.6，此后加入纯水使总量精确到600ml。使用注射小瓶分装器，按每份1ml，将该溶液分装到2ml玻璃小瓶中，然后冻干。为此，将瓶架温度迅速从5℃降到-40℃，并在-40℃下初步冷冻5小时，此后，将小瓶在-25℃的瓶架温度下减压干燥50小时。接着，减压下将瓶架温度保持在15℃，然后将小瓶干燥6小时来获得冻干制剂。所得冻干制剂的块状物具有好的特性，并且用注射用蒸馏水重新配制时获得透明溶液。将冻干制剂在40℃温度下贮存2个月。贮存期间，评价块状物和重新配制后溶液在外观上的变化，并测量相关物质的量。结果显示在表11中。
结果证明，该冻干制剂具有好的外观，不产生不溶性物质，可抑制相关物质的产生并含有稳定的20k hGH，甚至在长期贮存之后。
表11冻干制剂的稳定性试验外观 重新配制溶液的外观和相关物质(％)0天 好透明3.94周后好透明5.68周后好透明6.权利要求
1.一种药物制剂，含有分子量约为20000的人生长激素或其衍生物和水溶性杂环化合物。
2.权利要求1的药物制剂，其中水溶性杂环化合物为至少一种选自肌酸酐、乙酰色氨酸的盐和烟酰胺的化合物。
3.权利要求1或2的药物制剂，其中制剂水溶液的PH值为5到8。
4.权利要求3的药物制剂，其中通过PH调节剂或缓冲剂来控制水溶液的PH值。
5.权利要求3的药物制剂，其中制剂为含有1或2种碱性氨基酸或其盐和非离子表面活性剂的冻干制剂。
6.权利要求5的药物制剂，其中该制剂每重量份的分子量约为20000的人生长激素含有1到20重量份的碱性氨基酸或其盐。
7.权利要求6的药物制剂，其中非离子表面活性剂为聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯20和/或聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80。
8.权利要求5的药物制剂，其中该制剂含有赋形剂。
9.权利要求8的药物制剂，其中赋形剂为糖醇。
10.一种通过将水溶性杂环化合物加到含有所述人生长激素或其衍生物制剂中来防止分子量约为20000的人生长激素或其衍生物不溶解化并改善稳定性的方法。
11.权利要求10的方法，其中水溶性杂环化合物为至少一种选自肌酸酐、乙酰色氨酸的盐和烟酰胺的化合物。
12.权利要求10或11的方法，其中制剂水溶液的PH值为5-8。
13.一种通过加入1或2种碱性氨基酸或其盐和非离子表面活性剂来抑制含有分子量约为20000的人生长激素或其衍生物冻干制剂随时间产生相关物质的方法。
14.权利要求13的方法，其中制剂含有赋形剂。
全文摘要
通过加入水溶性杂环化合物(如肌酸酐、乙酰色氨酸的盐和烟酰胺)来防止水溶液中的人生长激素或其衍生物不溶解化可配制含有分子量约为20000的人生长激素或其衍生物的稳定的药物制剂。
文档编号A61K47/18GK1165034SQ9710496
公开日1997年11月19日 申请日期1997年2月2日 优先权日1996年2月2日
发明者小林英树, 青木美穗子, 内田博司, 楠原信海, 深山裕喜雄, 伊藤照夫, 福原彰, 佐藤勉 申请人:三井东压化学株式会社