专利名称：L－苏糖酸钙在治疗骨折中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及L-苏糖酸钙的一种新用途，具体说是L-苏糖酸钙在预防和治疗骨折中的用途。
背景技术：
骨折是指骨的结构连续性的中断，它是一种常见的外科疾病。骨折分为外伤性骨折和病理性骨折，外伤性骨折是由暴力作用造成的骨折，而病理性骨折是由于骨本身有病理变化如老年性骨质疏松等再加上遭受一定程度的外力造成的骨折。
传统上将骨折愈合分为四个阶段(1)炎性阶段；(2)软骨痂阶段；(3)硬骨痂阶段；(4)再塑形阶段。炎性阶段是骨折后的立即反应。骨端与邻近组织出现血肿，迅速发生急性炎症反应，表现为血管扩张、血浆与白细胞渗出。软骨痂阶段是自肿痛消失到骨断端纤维或软骨组织连接的阶段，此时血肿机化，破骨细胞清除残留死骨，骨膜下骨开始形成。其特征是血管大量增加，骨痂内有毛细血管长入，细胞极其丰富。硬骨痂阶段是从骨端有软骨痂粘着到新骨形成。这阶段相当于临床和X线表现的骨折愈合，一般需3—4个月，骨痂从纤维软骨性组织变为纤维骨，在骨端间出现膜性骨形成。再塑形阶段是骨折端被新生骨连接后，逐渐适应新的功能的过程。
骨折愈合是组织修复程序极为独特的过程。它与其它组织的修复不同，其它组织修复的结局是瘢痕形成，而骨的修复不是瘢痕形成，是通过骨的再生来实现的。因此成骨细胞的增殖在骨折愈合中起着决定性的作用。
另外，Lane从生物化学角度进行骨折愈合的分类(1)间充质阶段，这阶段合成I、II、III型胶原；(2)软骨样阶段，以II型胶原为主；(3)软骨类骨阶段，以I、II型胶原为主；(4)成骨阶段，以I型胶原为主。因此可见，胶原合成在骨折愈合中也起着非常重要的作用。
目前普遍认为，普通的钙制剂对促进骨折的愈合没有明显的作用，而且也没有发现明显促进骨折愈合的其它药物。治疗骨折主要还是结合采取以下三种传统手段1、骨折的整复；2、固定；3、功能锻炼。

发明内容
因此，本发明的目的是提供一种L-苏糖酸钙的用途，具体说是在预防和治疗骨折中的用途。
针对上述促进骨折愈合的因素，发明人研究了L-苏糖酸钙对成骨细胞的增殖、分化和骨形成功能的刺激作用，以及L-苏糖酸钙对促进I型骨胶原合成的作用。结果令人惊奇地发现，L-苏糖酸钙既能促进成骨细胞的增殖、分化及矿化功能，同时又能促进体外培养成骨细胞I型原胶原mRNA的表达，从而能够促进骨折的愈合，起到治疗骨折的作用，并由此完成了本发明。
同时通过上述作用，L-苏糖酸钙能够增加骨的密度和力学性能，起到预防骨折，尤其病理性骨折，如由老年性骨质疏松引起的骨折的作用。本发明的详细描述本发明的L-苏糖酸钙为白色颗粒，无味，能溶于水，不溶于醇、醚及氯仿，它的分子式为C8H14O10Ca，化学结构式为 它的制备方法描述在中国专利96106507.9及美国专利No.6,077,872中，当然也可以用现有技术中已知的其它方法来制备。
本发明的L-苏糖酸钙可以采用口服的给药方法。
本发明的L-苏糖酸钙能以各种药物制剂如片剂、胶囊和药学可接受组合物的形式使用。
根据本发明的药物组合物，可以含有一定量的L-苏糖酸钙作为活性成分，也可含有药学可接受的载体，这些药学可接受的载体可以是在现有技术中广泛用于药物中的各种载体，如赋形剂。本发明的药物组合物可以按现有技术中已知的方法如混合、制粒、压片来制备。
本发明的L-苏糖酸钙药物组合物还可以包括各种药学使用的任选组分，如香味剂、着色剂、甜味剂等。本发明优选L-苏糖酸钙药物组合物包括高达60wt％，优选80wt％，更优选90wt％的L-苏糖酸钙，其余为赋形剂和其它任选组分。
L-苏糖酸钙的用量可以根据病人的体重和年龄来变化。作为指导，L-苏糖酸钙的用量一般是在0.5—12克/天，优选3—7克/天。对于儿童，可以按其体重比例相应减少。
L-苏糖酸钙在动物体内的药代动力学试验表明L-苏糖酸钙在大鼠体内吸收代谢为一室模型，与其它钙剂如葡萄糖酸钙、醋酸钙、碳酸钙相比，吸收较为缓慢，血钙达峰时间较晚，Tmax＝0.79h，但吸收较为完全，半衰期T1/2＝4.45h，在体内能长时间维持在较高水平，曲线下面积AUC＝191.75μg/mL.hr。
一、L-苏糖酸钙对体外培养成骨细胞的增殖、分化和骨形成功能的刺激作用为提供L-苏糖酸钙对成骨细胞增殖、增加骨量的细胞学基础，本试验应用体外培养成骨细胞方法，观察该药对细胞骨形成功能的刺激作用。取新生SD大鼠头盖骨、分离培养成骨细胞1×104的密度接种于含10wt％NCS-MEM培养液，取第二继代细胞进行药效试验。结果表明10-9—10-3mol/L的L-苏糖酸钙对成骨细胞有增殖作用，10-3mol/L对细胞活性、矿化结节形成能力均有明显刺激作用，对ALP活性和矿化结节形成能力有一定提高作用。
材料和方法1、取材新生(24小时内)SD大鼠消毒后，在灭菌条件下取头盖骨，先经0.25％胰蛋白酶预消化10—15分钟，随后以0.1％II型胶原酶，37℃振荡消化60分钟，以1000rpm离心收集细胞。
2、细胞培养将分离的细胞以1×104/cm2的密度接种于培养瓶中，培养液为10％NCS-MEM，置37℃，5％CO2培养箱中培养，至半汇合时传代，取第二代继代细胞(OB2)进行药效试验。
3、药物各待试药物均配制成0.1mol/L浓度，经高压灭菌备用。
L-苏糖酸钙1.55g，50ml去离子水，加热溶解；葡萄糖酸钙2.24g，50ml去离子水，常温溶解；对照组为去离子水。
4、观察指标(1)细胞增殖OB2以6×103/孔密度接种于24孔COSTOR培养板，24小时后换入含不同浓度药物(10-9—10-3mol/L)的培养液，于加药后72小时用MTT方法在Labsystems Multiskan MS(芬兰)酶标仪上进行测试，以波长570nm处的OD值表示细胞增殖情况，结果与对照组比较。
(2)ALP活性测定OB2以2×104/孔密度接种24孔上述培养板，24小时后换入含药培养液，以后每48小时换液一次，待汇合后用对硝基苯磷酸盐法测细胞溶解液中的ALP活性，用考马斯兰法测定蛋白含量，以U/mg蛋白表示ALP活性，结果与对照组比较。
(3)矿化功能测定OB2以5×104/孔密度接种6孔上述培养板，24小时后换入含药培养液，48小时换液一次，14天后固定，茜素红染色，光镜下矿化结节计数，结果与对照组比较。
结果表1—3给出的是药物对增殖的实验结果。表中的结果显示，三批实验中10-9—10-3mol/L L-苏糖酸钙组OB2增殖率均显著高于对照组，并且以10-3mol/L的OD值为最高；多数浓度组OB2的OD值显著高于葡萄糖酸钙组和氯化钙组。L-苏糖酸钙组中实验一、二的OB2OD值显著高于对照组，实验三未见明显改变，与葡萄糖酸钙和氯化钙组比较多数无明显差别。
表1 L-苏糖酸钙等药物对成骨细胞的影响实验一(浓度单位mol/L)A570(X±SD)

注n＝4，与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
与同浓度L-苏糖酸钙组比较&P＜0.05，#P＜0.01表2 L-苏糖酸钙等药物对成骨细胞的影响实验二(浓度单位mol/L)A570(X±SD)

注n＝4，与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与同浓度L-苏糖酸钙组比较&P＜0.05，#P＜0.01表3 L-苏糖酸钙等药物对成骨细胞增殖的影响实验三(浓度单位mol/L)A570(X±SD)

注n＝4，与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01与同浓度L-苏糖酸钙组比较&P＜0.05，#P＜0.01，$P＜0.0012、L-苏糖酸钙对OB2ALP活性的影响参照OB2增殖的结果，以10-3mol/L浓度进行药物OB2ALP活性刺激作用实验，结果见表4。
在相同浓度下，L-苏糖酸钙OB2ALP活性高于对照组，实验一、二的增高有显著意义(P＜0.05)。与葡萄糖酸钙和氯化钙组比较，L-苏糖酸钙OB2ALP活性均有增高，但无显著性。
表4 L-苏糖酸钙等药物对成骨细胞ALP活性的影响

注n＝4与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，3、L-苏糖酸钙对OB2矿化功能的刺激作用由表5可见，成骨细胞2周形成的矿化结节数以L-苏糖酸钙组为高，L-苏糖酸钙组的增高有显著意义(P＜0.05)。
表5 L-苏糖酸钙等药物对成骨细胞矿化功能的影响

n＝5与对照组比较*P＜0.05，与L-苏糖酸钙比较&P＜0.05成骨细胞是骨形成细胞，在骨重建中增殖、分化，合成、分泌与骨形成有关的胶原和非胶原蛋白质，生成类骨质和促进类骨质矿化。形成的新骨质修补破骨细胞骨吸收形成的骨陷窝。成骨细胞功能减退致新骨形成量减少，对骨吸收陷窝的修复能力减弱，造成骨小梁变细、薄弱、穿孔，皮质骨呈多孔性改变。在骨形成促进药物的成骨细胞药效学评价中，常以增殖率、碱性磷酸酶的活性(ALP)和矿化结节为指标，这些指标分别代表成骨细胞的增殖、分化和矿化能力，可较全面地评价药物对成骨细胞形成功能的刺激作用。
以上结果显示1、L-苏糖酸钙对体外培养成骨细胞的增殖率、ALP活性和矿化结节形成有明显的刺激作用。2、L-苏糖酸钙对体外培养成骨细胞的增殖率、ALP活性和矿化结节形成的刺激作用均高于葡萄糖酸钙、氯化钙。
二、L-苏糖酸钙对促进I型骨胶原合成的作用研究本项研究将深入讨论L-苏糖酸钙对体外培养成骨细胞I型胶原(α-COLI)基因表达的影响。
材料与方法1、细胞培养原代成骨细胞的培养方法同前，第2代OB按1×104cell/cm接种。传代第2天，按相同浓度(10-3mol/L)在不同培养瓶中分别加入L-苏糖酸钙、葡萄糖酸钙，对照组加相同体积的去离子水。每48小时换培养液并加药，一周后提取细胞总RNA。
2、RNA的提取将细胞用0.25％胰酶消化，1000rpm×5min离心收集细胞沉淀，用TRIzol试剂(Gibco公司)法提取细胞总RNA。经琼脂糖甲醛变性电泳见18s与28s条带，用紫外分光光度计测RNA的浓度与纯度(A260/A280值在1.7—2.0之间)。
3、RT-PCR反应本次实验采用Access RT-PCR System试剂盒(Promega)。按说明进行操作。反应混合液在PCR仪(Bio-Rad公司)中48℃45min条件下进行逆转录反应，94℃2分钟灭活酶，然后进行30个循环的PCR反应，94℃30min变性，54℃1min退火，72℃2min延长，末次循环后72℃延伸7min。取9μL PCR产物进行1.5％琼脂凝胶电泳，电泳条带图象分析系统(ImageMaster VDS)分析，光密度值经内参照-Actin校正，校正值进行统计分析。
表6引物序列

4、药物各待试药物均配成0.1mol/L浓度，经高压灭菌后备用。
L-苏糖酸钙由北京巨能亚太生命科学研究中心提供，1.55g＋50ml去离子水，加热溶解。
葡萄糖酸钙，上海黄海制药厂，2.24g＋50ml，2.24g＋50ml去离子水配制。
结果应用定量RT-PCR技术检测成骨细胞中α-COLI的mRNA表达时发现，在相同给药浓度(10-3mol/L)条件下，L-苏糖酸钙组的mRNA水平较对照组有显著升高(P＜0.05)。说明L-苏糖酸钙可以促进成骨细胞α-COLI mRNA的表达。葡萄糖酸钙组的α-COLI mRNA水平与对照组间无显著差异。
表7

注X±SD，n＝3，与对照组比较*P＜0.05，成骨细胞在骨折时的增殖、分化、成熟的过程中，在胞浆内合成大量的I型原胶原，并分泌到基质中，构成了骨质的主要成分—胶原，从而促进骨折的愈合。同时骨质的含量又是决定骨骼强度的重要因素，在临床中常将I型胶原蛋白降解片段的测定作为反映成骨功能的指标之一。因此说明，L-苏糖酸钙在预防和治疗骨折中具有非常重要的意义。本研究采用定量RT—PCR方法，检测α-COLI mRNA水平，较蛋白分子的检测更能反映OB内基因的表达情况。
在过去的药效学各试验中发现L-苏糖酸钙明显增加去势大鼠的骨密度、骨钙含量与生物力学参数。细胞药效试验表明该药能促进OB增殖、分化与矿化功能。本项试验研究观察发现L-苏糖酸钙上调体外培养OB的α-COLImRNA水平。这与以往细胞药效所反映其增强成骨细胞骨形成功能的作用是相关的，提示L-苏糖酸钙可能是通过增强OB内某些基因的表达、从而提高OB的成骨功能。胶原蛋白水平的检测可进一步证实。
上述试验表明，L-苏糖酸钙既能促进成骨细胞的增殖、分化及矿化功能，同时又促进体外培养成骨细胞I型原胶原mRNA的表达。通过这些作用，L-苏糖酸钙能够起到促进骨折愈合的作用，并能够增加骨的密度和力学性能，起到预防骨折，尤其病理性骨折(如老年性骨质疏松症)的作用。
权利要求
1.L-苏糖酸钙在预防骨折中的用途。
2.L-苏糖酸钙在治疗骨折中的用途。
3.用于预防和/或治疗骨折的药物组合物，它含有有效量的L-苏糖酸钙。
全文摘要
本发明涉及一种L－苏糖酸钙的新用途,具体说是用于预防和治疗骨折的用途。经试验发现L－苏糖酸钙既能促进成骨细胞的增殖、分化及矿化功能,同时又能促进体外培养成骨细胞Ⅰ型原胶原mRNA的表达,从而能够促进骨折愈合,增加骨的密度和力学性能,起到预防和治疗骨折的作用。
文档编号A61K31/191GK1328820SQ01119870
公开日2002年1月2日 申请日期2001年7月3日 优先权日2001年7月3日
发明者于凯, 王志文, 戴向国 申请人:北京巨能亚太生命科学研究中心