专利名称：聚合物-因子viii部分缀合物的制作方法
技术领域：
一般地说，本发明涉及包括因子VIII部分(即具有因子VIII活性的部分)和聚 合物的缀合物(conjugate)。此外，本发明涉及包括所述缀合物的组合物、合成所述缀合物的方法和治疗患者 的方法。
背景技术：
止血是阻止血液从损伤血管流出的过程。就哺乳动物以及许多其它生物而言，止 血过程对继续存活来说具有决定性的重要意义。例如，止血过程中的缺陷可以导致不能有 效形成用于使血管损伤后失血停止的血块。在人体中，患有不能形成血块的个体称作血友 病患者。对血友病患者特别关注的是危及生命的危险，出血一旦开始，它就从不会停止。一般来说，血友病患者缺乏产生形成血块所需的有效量的一种或多种物质的能 力。例如，患有血友病A(也称作典型血友病")的血友病患者不能产生有效水平的因子 VIII (也称作“抗血友病因子A”、“抗血友病球蛋白”和“AHG”)。因子VIII是导致血块形成 的几种“级联”反应之一中的关键成分。对称作“内在途经”的反应级联关键的，因子VIII 最终影响血纤蛋白原转化成血块的主要成分血纤蛋白。尽管血块形成的内在途经相对复杂，但是可以简单描因子VIII的作用。在有相对 少量凝血酶存在下(例如，由破裂的组织细胞释放)，因子VIII被转化成其活化形式，称作 因子Villa。因子VIIIa(与其它物质一起)依次使另一种因子，因子X活化成因子fe。此 后，因子叙(与其它物质一起)将凝血酶原转化成凝血酶，结果随时间内产生相对大量的凝 血酶。相对大量的凝血酶有效地将血纤蛋白原转化成血纤蛋白。血纤蛋白依次形成导致血 块形成的基质或晶格。因子VIII在凝血的内在途经中的作用如说明书附图6所示。在所有群体中，每10，000个生下来活着的婴儿中影响1个或2个男性，所以血友 病A可能因位于X-染色体上的因子VIII基因各种突变中的任意一个所致。随特定突变的 不同，血友病A自身可以表现为重度、中度或轻度。患有最严重形式血友病A的个体完全缺 乏表达因子VIII的活性形式的能力。在临床上，受血友病A侵害的个体遭受肌肉出血、关 节出血、易青肿和从伤口出血延长。患血友病A的未经治疗的个体平均年龄为20岁。目前 对血友病A的治疗包括输注收集自人血浆或通过重组DNA技术制备的外源性因子VIII浓 缩物。因为这些治疗仅用于补充缺乏的有效水平的因子VIII，所以因因子VIII受到损害的 个体需要在其整个生命过程中定期注射因子VIII浓缩物。可以得到因子VIII浓缩物的几种商品形式以提供对患有血友病A的患者的 代替疗法。例如，以 Hemof il M (Baxter, Deerfield, IL)、Koate -DVI (Bayer,Research Tringle Park, NC)、Monarc-M (Ameri can Red Cross, Washington, D. C.) 和 Monoclate-P (Aventis, Bridgewater, NJ)商标销售的血液衍生的因子 VIII 浓缩物产品。就以重组方式制备的因子VIII浓缩物而言，以Helixate FS (Aventis, Bridgewater, NJ)、Kogenate FS (Bayer, Research Triangle Park, NC)、 Recombinate (Baxter, Deerfield, IL)、 Advate (Baxter, Deerfield, IL)和 ReFaCtO (Wyeth/Genetics Institute, Cambridge, MA) Ttf|^il#^lti[ n。一般来说，重组来源的因子VIII浓缩物优于血液衍生来源，因为后者涉及传播病 毒和/或其它与献血相关的疾病的风险。尽管基于重组的制品避免了这些缺陷，但是基于 重组的产品的加工通常需要存在某些蛋白质，诸如清蛋白，它们不可避免地存在于给予患 者的最终制品中。接受这类制品的患者通常发生对这些外来蛋白的过敏反应。在任何情况 下，血液衍生和基于重组的产品均遭受反复给药的缺点。已经将聚乙二醇化或聚(乙二醇)衍生物与蛋白质结合描述为减轻免疫原性的方 式以及延长蛋白质的体内半衰期的方式。然而，就因子VIII而言，先前形成蛋白质-聚合 物共轭物的经验已经证实与聚合物与因子VIII偶联相比较几乎没有预测值。参见美国专 利 No. 4，970，300。尽管存在这些困难，但是已经描述了制备令人满意的某些聚合物与因子VIII的 共轭物的组合物的尝试。例如，上述参照的美国专利No. 4，970，300中描述了使用具有约 500-5，000分子量的特定聚(乙二醇)衍生物使因子VIII聚乙二醇化。另外，美国专利 No. 6，048，720中描述了当4至5个一甲氧基聚(乙二醇)链与因子VIII轭合时有效保护 免受体外环境中的降解。然而，证实这些所述的共轭物中没有一种可以令人满意地解决与目前基于因子 VIII疗法相关的难题。例如，由相对小的聚合物(例如约5，000道尔顿或5，000道尔顿以 下)组成的共轭物可能无法适当提供延长的体内半衰期和/或充分减轻的免疫反应。此外， 带有多种与因子VIII结合的个体聚合物的共轭物因聚合物封闭位点对活性而言必不可少 而更可能具有下降的活性。因此，本领域中仍然存在提供另外的水溶性聚合物与具有因子VIII活性的部分 之间的共轭物的需求。本发明由此涉及这类共轭物以及包括所述共轭物的组合物和本文所 述的相关方法，认为它们是新的且在本领域中完全没有启示。发明概述因此，本发明的主要目的在于提供包括多种共轭物的组合物，尽管不必需地，但是 优选所述的共轭物各自带有1至3种与因子VIII部分共价结合的水溶性聚合物，其中每一 水溶性聚合物优选具有的标称平均分子量在大于5，000道尔顿至约100，000道尔顿的范围 内。本发明的另一个目的在于提供这类共轭物，其中所述每一水溶性聚合物为聚(环 氧烷)。本发明的另一个目的在于提供这类共轭物，其中所述每一水溶性聚合物为聚(乙
二醇)。本发明的另一个目的在于提供包括多种单聚乙二醇化因子VIII部分共轭物的共 轭物。
本发明的还另一个目的在于提供制备聚合物共轭物的方法，该方法包括在足以产 生多种共轭物的条件下使一种或多种活化的水溶性聚合物与因子VIII部分接触的步骤， 尽管不必需地，但是优选所述的共轭物各自带有1至3种与因子VIII部分共价结合的水溶 性聚合物，其中所述的水溶性聚合物优选具有的标称平均分子量在大于5，000道尔顿至约 150,000道尔顿的范围内。本发明的另一个目的在于提供治疗需要因子VIII疗法的患者的方法，该方法包 括对所述患者给予本文所述的组合物的步骤，其中该组合物含有治疗有效量的一种或多种 所述共轭物。本发明的还另一个目的在于提供制备水溶性聚合物-因子VIII部分共轭物的方 法，该方法包括在共轭条件下使因子VIII部分与聚合物试剂接触的步骤。如下的本说明书中将列出本发明的其它目的、优点和新特征且部分对本领域技术 人员而言在阅读下文后将变得显而易见或可以通过实施本发明而得知。然后在一个实施方案中，提供了包括多种共轭物的组合物，尽管不必需地，但是 优选所述的共轭物各自带有1至3种与因子VIII部分共价结合的水溶性聚合物，其中每一 水溶性聚合物优选具有的标称平均分子量在大于5，000道尔顿至约150，000道尔顿的范围 内。尽管可以使用任意的因子VIII部分，但是优选该组合物包括因子VIII本身(例如，如 美国专利No. 4，757，006中所述)、因子VIIIa(即当因子VIII与相对少量凝血酶接触时产 生因子VIII的活化形式)、因子VIII =VffF(即与冯维勒布兰德因子结合的因子VIII)和/ 或因子VIII的截短形式，诸如B-结构域缺失的因子VIII (例如，如美国专利No. 4，868，112 中所述)。聚合物可以为任意的水溶性聚合物且本发明在这方面没有限制。不过，优选共轭 物中存在的各聚合物选自由聚(环氧烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、 聚(丙烯酰吗啉)及其组合组成的组。然而，特别优选将聚(环氧烷)，诸如聚(乙二醇) 衍生物用作本发明中的聚合物。本文所述的共轭物有利地减轻免疫原性，即许多用外源性来源的因子VIII治疗 的血友病患者遇到的问题。此外，本发明的共轭物与不含共轭物的因子VIII组合物相比对 给药频率的需求减少。通过减少给药频率，所述的共轭物有利地减少了血友病患者必须耐 受以提供持续水平的具有因子VIII活性的药剂的疼痛注射次数。在另一个实施方案中，提供了制备共轭物的方法。该方法包括使一种或多种活化 的、水溶性聚合物(即聚合物试剂)与因子VIII部分接触的步骤，其中所述的一种或多种 活化的、水溶性聚合物优选具有的标称平均分子量在大于5，000道尔顿至约150，000道尔 顿的范围内。可以在本领域中任意公知的方法条件下完成所述的水溶性聚合物的活化，只 要所得聚合物在适当PH、温度等条件下将形成共价键，使得因子VIII部分与所述聚合物共 价结合。在活化的、水溶性聚合物在所述部分的所需位置上形成共价结合所要求的那些条 件下进行一种或多种活化的、水溶性聚合物与因子VIII部分的接触。该方法产生多种共轭 物，尽管不必需地，但是优选所述的共轭物各自带有1至3种与因子VIII部分共价结合的 水溶性聚合物。在某些情况中，所述的共轭物可以包括与2、3、4、5、6、7、8或更多因子VIII 部分结合的单一聚合物。任选地，可以将所得组合物进一步加工以除去不需要的种类，诸如 带有不需要数量聚合物的共轭物。为了除去这类不需要的种类，可以使用纯化技术，诸如尺
6寸排阻色谱法。在本发明的还另一个实施方案中，提供了包括与药物上可接受的赋形剂结合的本 发明共轭物的组合物。该组合物包括所有类型的制剂且特别是那些适合于注射的制剂，诸 如可以被重构的粉末和液体(例如混悬液和溶液)。在本发明的另一个实施方案中，提供了给予所述共轭物的方法。这种给药方法包 括对患者给予本文所述的组合物的步骤，其中该组合物含有治疗有效量的所述共轭物。一 般来说，通过注射(例如肌内注射、静脉内注射、皮下注射等)进行含有共轭物的组合物的 给药步骤。附图简述附

图1是对应于如实施例6中所述的用30K的mPEG-SPA使B-结构域缺失的因子 VIII聚乙二醇化时形成的反应混合物的SEC图。附图2是对应于如实施例6中所述的通过使蛋白质与30K的mPEG_SPA轭合制备 的纯化的B-结构域缺失的因子VIII-PEG共轭物的SEC图。附图3是对应于如实施例7中所述的用20K的mPEG_MAL使B-结构域缺失的因子 VIII聚乙二醇化时形成的反应混合物的SEC图。正如可以观察到的，单聚乙二醇化产物的 产率约为33%。附图4是对应于如实施例7中所述的通过使蛋白质与20K的mPEG_MAL轭合制备 的纯化的B-结构域缺失的因子VIII-PEG共轭物的SEC图。附图5是对应于如实施例8中所述的用30K的mPEG_SMB使B-结构域缺失的因子 VIII聚乙二醇化时形成的反应混合物的SEC图。单聚乙二醇化产蛋白质(1-链节)的产率 约为41%。
附图6表示因子VIII在凝血的内在途经中的作用。发明详述在详细描述本发明前，应理解本发明并非限于特定的聚合物、合成技术、因子VIII 部分等，因为它们可以改变。必须注意，除非上下文中另有清楚的说明，作为本说明书和权利要求中所用的单 数形式"一个(a)“、“ 一种(an)“和"所述的(the)“包括复数形式。因此，例如涉及 的"聚合物"包括单一聚合物和两种或更多种相同或不同的聚合物，涉及的"任选的赋形 剂"指的是单一可选的赋形剂和两种或更多种相同或不同的可选赋形剂等。在描述和要求保护本发明中，按照下文所述的定义使用下列术语。本文所用的〃 PEG"、丨‘聚乙二醇〃和〃聚(乙二醇)〃可以互换使用且用以包 括任意水溶性聚(环氧乙烷)。一般来说，用于本发明的PEk包括如下结构"-(OCH2CH2) n_ “，其中(η)为 2 至 4000。本文所用的 PEG 还包括“-CH2CH2-O (CH2CH2O) n_CH2CH2-“ 和"-(OCH2CH2)nO-"，这取决于末端氧是否被取代。在说明书和权利要求的全文中，应记住 术语"PEG"包括带有各种末端或"封端"基团等的结构。术语"PEG"还指含有大多数， 即大于50%的-OCH2CH2-重复亚单位的聚合物。就具体形式而言，PEG可以采用任意数量的 不同分子量以及结构或几何结构，诸如"支化"、“线型"、“叉形"、“多官能"等，在 下文中更详细地描述。术语"封端"和"末端封端"在本文中可以互换使用以指带有封端部分的聚合物末端或端点。一般来说，尽管不必需地，但是封端部分包括羟基或C1J烷氧基，更优选C1, 烷氧基且更优选C"烷氧基。因此，封端部分的实例包括烷氧基(例如甲氧基、乙氧基和苄 氧基)以及芳基、杂芳基、环、杂环等。必须记住封端部分可以包括聚合物上末端单体中的 一个或多个原子[例如在CH3(OCH2CH2)n-上的封端部分"甲氧基"]。此外，设想到上述物 质中每一种的饱和、不饱和、取代和未被取代的形式。此外，封端基还可以为硅烷。封端基还 可以有利地包括可检测标记。当聚合物带有包括可检测标记的封端基时，可以通过使用合 适的检测器测定聚合物和/或聚合物所偶联的部分(例如活性剂)的量或位置。这类标记 包括，但不限于荧光剂、化学发光剂、用于酶标记的部分、比色剂(例如染料)、金属离子、放 射性部分等。合适的检测器包括光度计、薄膜、分光光度计等。封端基还可以有利地包括磷 脂。当聚合物带有包括磷脂的封端基时，独特特性可以被赋予给聚合物和所得共轭物。典 型的磷脂类包括，但不限于那些选自称作磷脂酰胆碱类的磷脂类。具体的磷脂类包括，但不 限于那些选自二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷 脂酰胆碱、山嵛酰磷脂酰胆碱、花生四烯酰磷脂酰胆碱(arachidoylphosphatidylcholine) 和卵磷脂组成的组的磷脂。就本文所述的聚合物，“非天然存在的"指的是其整体在天然中未发现的聚合 物。不过，本发明非天然存在的聚合物可以含有一种或多种天然存在的单体或单体链段，只 要总体聚合物结构在天然中未发现。作为"水溶性聚合物"中的术语"水溶性"聚合物是在室温下溶于水的任意聚 合物。一般来说，水溶性聚合物将透过至少约75%，更优选至少约95%的由过滤后相同溶 液透过的光。以重量为基础，水溶性聚合物将优选至少约35% (按重量计)溶于水，更优选 至少约50% (按重量计)溶于水，更优选至少约70% (按重量计)溶于水且更优选至少约 85% (按重量计)溶于水。不过，最优选水溶性聚合物约95% (按重量计)溶于水或完全 溶于水。就诸如PEG这类水溶性、非天然存在的聚合物而言的“标称平均分子量"指的是 该聚合物的质量平均分子量，一般通过尺寸排阻色谱法、MALDI (基质辅助激光解吸/离子 化)、光散射技术或在1，2，4_三氯苯中内在速度测定来测定。这些聚合物一般为多分散系， 具有的低多分散性值优选小于约1. 2，更优选小于约1. 15，更优选小于约1. 10，更优选小于 约1.05和最优选小于约1.03。与特定官能团结合使用的术语"活性"或"活化的"指的是易于与另一分子上 的亲电体或亲核体反应的反应性官能团。这与需要强催化剂或非常不实际反应条件才能反 应的那些基团(即"非反应性"或"惰性"基团)相反。本文所用的术语"官能团"或其任意的同义词用以包括其被保护形式和未被保 护形式。本文所用的术语"键"或"连接体"指的是任选用于连接互联部分的原子或原 子团，所述的互联部分诸如聚合物链段和因子VIII部分的末端或因子VIII部分的亲电子 体或亲核体。本发明的连接体可以是水解稳定的或可以包括生理上可水解的或酶可降解的 键。“烷基"指的是一般长度约1至15个原子的烃链。优选这类烃链，但不必需是饱 和的且可以为支链或直链，不过一般优选直链。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基等。本文所用的"烷基"包括环烷基以及含有亚 环烷基的烷基。“低级烷基"指的是含有1至6个碳原子的烷基且可以为直链或支链，作为典型 的有甲基、乙基、正丁基、异丁基和叔丁基。“环烷基"指的是饱和或不饱和的环状烃链，包括桥连、稠合或螺环化合物，优选 由3至约12个碳原子，更优选由3至约8个原子构成。“亚环烷基"指的是通过在环系上 的任意两个碳上结合链被插入烷基链的环烷基。“烷氧基"指的是-O-R基团，其中R为烷基或取代的烷基，优选CV6烷基(例如
甲氧基、乙氧基、丙氧基等)。作为例如"取代的烷基"中的术语"取代的"指的是被一个或多个非干扰取代 基取代的部分(例如烷基)，诸如，但不限于烷基；C3_8环烷基，例如环丙基、环丁基等；卤 素，例如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基、低级苯基；取代的苯基等。“取代的芳基"为带有一 个或多个非干扰基团作为取代基的芳基。就苯基环上的取代基而言，取代基可以为任意方 向(即邻位、间位或对位)。“非干扰取代基"是那些当存在于分子上时，一般不与该分子内包含的其它官能 团反应的基团。“芳基"指的是一种或多种各自有5或6个核碳原子的芳族环。芳基包括可以作 为在萘基上稠合或在作为联苯基上未稠合的多个芳基环。芳基环也可以与一种或多种环 烃、杂芳基或杂环稠合或不与它们稠合。本文所用的"芳基"包括杂芳基。“杂芳基"为含有1至4个杂原子，优选硫、氧或氮或其组合的芳基。杂芳基环还 可以与一种或多种环烃、杂环、芳基或杂芳基环稠合。“杂环(heterocycle)“或〃杂环(heterocyclic)“指的是一个或多个5-12 个 原子，优选5-7个原子的环，它们具有或没有不饱和性或芳香性且带有至少一个不为碳的 环原子。优选的杂原子包括硫、氧和氮。“取代的杂芳基"为带有一个或多个非干扰基团作为取代基的杂芳基。“取代的杂环"为带有一个或多个由非干扰取代基形成的侧链的杂环。“亲电子体"和"亲电子基团"指的是可以为离子的、带有亲电中心的离子或原 子或原子团，即所述的亲电中心是寻找电子、能够与亲核体反应的中心。“亲核体"和"亲核基团"指的是可以为离子的带有亲核中心的离子或原子或 原子团，即所述的亲核中心是寻找亲电子中心或带有亲电子体的中心。“生理上可裂解的〃或〃可水解的〃或〃可降解的〃键为在生理条件下与水反 应(即被水解的)键。优选的是在25V、pH 8下具有小于约30分钟的水解半衰期的键。 键在水中水解的趋向将不仅取决于连接两个中心原子的键的一般类型，而且取决于与这些 中心原子连接的取代基。合适的水解不稳定或弱的键包括，但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐 类、缩醛类、酮缩醇类、酰氧基烷基醚、亚胺类、原酸酯类、肽类和寡核苷酸类。“酶可水解的键"指的是易受一种或多种酶降解的键。“水解稳定的"键(linkage)或键(bond)指的是在水中实质上稳定的化学键，一 般为共价键，即在生理条件下在延长时间期限内不会水解至任何可察觉的程度。水解稳定 键的实例包括，但不限于如下碳-碳键(例如在脂族链上)、醚类、酰胺类、尿烷类等。一般来说，水解稳定的键为在生理条件下表现出低于约1-2%/天的水解速率的键。有代表 性的化学键的水解速率可以在大部分标准化学教科书中找到。“药物上可接受的赋形剂或载体"指的是可以任选被包括在本发明组合物中且 不会对患者产生明显不良毒理学作用的赋形剂。“药理有效量"、“生理有效量"和〃治 疗有效量"在本文中可以互换使用以指在血流或靶组织中提供所需水平的共轭物(或相 应的未轭合的因子VIII部分)所需要的聚合物-因子VIII部分共轭物的量。精确量将取 决于许多因素，例如特定的因子VIII部分、治疗组合物中的成分和物理特性、所针对的患 者群体、个体患者的考虑等且易于由本领域技术人员基于本文提供的信息确定。“多官能"指的是带有其中含有的3个或更多官能团的聚合物，其中所述的官能 团可以相同或不同。本发明的多官能团聚合物试剂将一般在聚合物骨架内含有约3-100个 官能团或3-50个官能团或3-25个官能团或3-15个官能团或3_10个官能团或将含有3、4、 5、6、7、8、9或10个官能团。本文所用的术语"因子VIII部分"指的是具有因子VIII活性的部分。因子VIII 部分还将带有至少一个适合于与聚合物试剂反应的亲电子基团或亲核基团。尽管不必需 是，但是因子VIII部分一般为蛋白质。此外，术语"因子VIII部分"包括轭合前的因子 VIII部分和轭合后的因子VIII部分残基。正如下文进一步具体解释的，本领域技术人员可 以确定任意指定的部分是否具有因子VIII活性。术语"患者"指的是患有或易患可以通过给予活性剂(例如共轭物)预防或治疗 的状况的活生物且包括人和动物。“任选"或"任选地"指的是随后所述的情况可以发生，也可以不发生，使得该 描述包括情况发生的实例和情况不发生的实例。将肽类中的氨基酸残基缩写如下苯丙氨酸为Phe或F ；亮氨酸为Leu或L ；异亮 氨酸为Ile或I ；甲硫氨酸为Met或M ；缬氨酸为Val或V ；丝氨酸为Ser或S ；脯氨酸为Pro 或P ；苏氨酸为Thr或T ；丙氨酸为Ala或A ；酪氨酸为Tyr或Y ；组氨酸为His或H ；谷氨酰 胺为Gln或Q ；天冬酰胺为Asn或N ；赖氨酸为Lys或K ；天冬氨酸为Asp或D ；谷氨酸为Glu 或E ；半胱氨酸为Cys或C ；色氨酸为Trp或W ；精氨酸为Arg或R ；且甘氨酸为Gly或G。现在转向本发明的第一个实施方案，该实施方案提供了包括多种共轭物的组合 物，尽管不必需地，但优选所述的共轭物各自带有1至3种与因子VIII部分共价结合的水 溶性聚合物，其中每一水溶性聚合物优选具有的标称平均分子量在大于5，000道尔顿至约 150,000道尔顿的范围内。天然因子VIII为2，351个氨基酸的单链糖蛋白，它在结构上构成为 A1-A2-B-A3-C1-C2。表达的2，351个氨基酸序列作为SEQ. ID. NO :1提供。然而，当表达的多 肽被易位到内质网腔中时，19-氨基酸信号序列被裂解，产生第二序列。研究人员通常将本 文作为SEQ. ID. NO 2提供、缺少引导的19个氨基酸的这第二序列用于给指定的因子VIII 的氨基酸残基指定位置编号(例如Arg372)。因此，除非有特别的说明，本文提供的氨基酸残 基的所有指定的编号位置均基于SEQ. ID. NO :2。在有相对少量凝血酶存在下，因子VIII在Arg372、Arg74°和Arg1689上被凝血酶裂解 而产生因子Villa。因子VIIIa是由与凝血酶-裂解的轻链A3-C1-C2结合(通过铜离子) 的Al亚单位和通过离子相互作用与Al结合的游离A2亚单位组成的异三聚体。将理解因
10子VIII部分并不仅限于因子VIII"活性"形式(例如因子Villa)且术语"因子VIII部 分"包括"前体"形式和具有类似的前凝血剂作用的其它物质。对任何指定的部分而言，测定该部分是否具有因子VIII活性是可能的。例如，已 经有意识地繁殖了存在血友病遗传突变的几种动物品系，使得由这类品系产生的动物具 有极低和不足水平的因子VIII。这类品系可获自各种来源，诸如，但不限于Division of Laboratories and Research, New York Department of Public Health, Albany, NY ；禾口 Department of Pathology, University of North Carolina, Chapel Hill, NC0 例如，这 两种来源提供了患有犬血友病A的犬。为了测试讨论中任何指定部分的因子VIII活性，将 该部分注入患病动物，做小切口并与健康对照比较出血时间。另一种适用于测定因子VIII 活性的方法在于测定辅因子和前凝血剂活性。例如，参见Mertens等(199 《英国血液病 学杂志》(Brit. J.Haematol.)迎133-42。还可以将本领域技术人员公知的其它方法用于 测定指定部分是否具有因子VIIII活性。这类方法适用于测定所述部分自身(且由此可被 用作"因子VIII部分)以及相应的聚合物-部分共轭物的因子VIII活性。因子VIII部分的非限制性实例包括如下因子VIII ；因子VIIIa ；因子VIII =C ； 因子VIII :vWF;B-结构域缺失的因子VIII (和因子VIII的其它截短形式)；杂交蛋白，诸 如那些描述在美国专利No. 6，158，888中的蛋白；具有因子VIII活性的糖基化蛋白，诸如那 些描述在美国专利申请No. 2003/0077752中的蛋白；和具有因子VIII活性的肽模拟物。优 选的截短的因子VIII形式(被术语"B-结构域缺失的因子VIII包括的)对应于具有人 因子VIII的氨基酸序列(SEQ. ID. NO. 1)的蛋白质，所述的人因子VIII的氨基酸序列(SEQ. ID. NO. 1)带有对应于Argra^P kr17°9之间区内至少581个氨基酸的缺失，更优选其中的缺 失对应于和Asp1582之间的区和Thr778和ftV659之间的区和Thr778和Glu1694之间的 区之一。维持至少一定程度因子VIII活性的上述任意的生物活性片段、缺失变体、取代变 体或添加变体也可起因子VIII部分的作用。还可以将具有因子VIII活性的部分有利地修饰成包括一种或多种氨基酸残基， 诸如赖氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸以便提供聚合物与氨基酸侧链内原子的便利结合。用 于添加氨基酸残基的技术对本领域技术人员而言众所周知。参考下列文献J. March，《高级 有机化学反应机制禾口结构》(Advanced Organic Chemistry :Reactions Mechanisms and Structure)，第 4 片反(New York Wi ley-Inter science, 1992)。因子VIII部分可以获自血液衍生的来源。例如，可以使用本领域技术人员公知 的沉淀和离心技术从人血浆中分级分离因子VIII。例如，参见=Wickerhauser(1976)《输 血》(Transfusion) 16(4) 345-350 ；和 Slichter 等(1976)《输血》(Transfusion) 16 (6) 616-626。因子VIII还可以分离自人粒细胞。参见kmitkoski等(1977)《血液病学》 (Haematologia)(Budap.)11(1-2) :177_187。此外，因子VIII部分还可以获自重组方法。简单的说，重组方法包括构建编码所 需多肽或片段的核酸、将该核酸克隆入表达载体、转化宿主细胞(例如细菌、酵母或哺乳动 物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞)并表达该核酸以产生所需多肽或片段。 用于在体外和原核和真核宿主细胞内产生和表达重组多肽类的方法是本领域技术人员公 知的。例如，参见美国专利No. 4，868，122。为了有利于鉴定和纯化重组多肽，可以符合编码序列读框地插入或加入编码表位tag或其它亲和结合序列的核酸序列，由此产生由所需多肽和适合于结合的多肽组成的融 合蛋白。可以通过下列步骤鉴定和纯化融合蛋白首先使含有所述融合蛋白的混合物通过 带有定向于融合蛋白中的表位tag或其它结合序列的结合部分(例如抗体)的亲和柱，由 此结合柱内的融合蛋白。此后，可以通过用合适的溶液(例如酸)洗涤该柱以释放结合的 融合蛋白回收所述的融合蛋白。还可以通过裂解宿主细胞、例如通过尺寸排阻色谱法分离 多肽并收集该多肽来鉴定和纯化重组多肽。这些和其它用于鉴定和纯化重组多肽类的方法 是本领域技术人员公知的。本发明的组合物可以包括多种共轭物，每一共轭物由相同的因子VIII部分组成 (即在完整的组合物内仅发现有一种类型的因子VIII部分)。此外，该组合物可以包括多 种共轭物，其中任何给定的共轭物均由选自由两种或更多种不同因子VIII部分组成的组 的部分组成(即在完整的组合物内发现两种或更多种不同的因子VIII部分)。然而，最佳 情况的是，在该组合物中实质上所有数量的共轭物(例如在该组合物中85%或更多数量的 共轭物)各自由相同的因子VIII部分组成。此外，优选含有所述共轭物的组合物不含或实质上不含清蛋白。还优选该组合物 不含或实质上不含不具有因子VIII活性的蛋白质。因此，优选该组合物85%，更优选95% 且最优选99%不含清蛋白。另外，优选该组合物85%，更优选95%且最优选99%不含不 具有因子VIII活性的任何蛋白质。如上所述，每一共轭物包括与水溶性聚合物结合的因子VIII部分。就所述的水 溶性聚合物而言，该水溶性聚合物是非肽的、无毒性的、非天然存在的和生物相容性的。就 生物相容性而言，将物质视为生物相容性的条件是与单独使用该物质或与活组织相关(例 如对患者给药)的另一种物质(例如活性剂，诸如因子VIII部分)一起使用有关的有益作 用超过了由临床医师，例如内科医师评价的任何有害作用。就非免疫原性而言，将物质视为 无免疫原性的条件是该物质在体内的计划应用不会产生不需要的免疫反应(例如形成抗 体)或即使产生免疫反应，那么也不认为这类反应是由临床医师评价的临床上显著的或重 要的。特别优选所述的水溶性聚合物是生物相容性的和非免疫原性的。此外，所述的聚合物的一般特征在于带有2至约300个末端。这类聚合物的实例 包括，但不限于聚(亚烷基二醇类)诸如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(〃 PPG")、乙二 醇和丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(羟 基烷基甲基丙烯酰胺)，聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚(α-羟基酸)，聚(乙 烯醇)，聚磷嗪，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)和任意上述物质的组合。所述的聚合物并不限于特定的结构且可以为线型(例如烷氧基PEG或双官能 PEG)、支化或多臂的(例如叉形PEG或与多元醇核结合的PEG)、树枝状的或带有可降解的 键。此外，可以以任意数量的不同模式构成聚合物的内部结构且这些结构可以选自均聚物、 交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三聚体、无规三聚体和嵌段三聚体。一般来说，用适合于与因子VIII部分上的所需位质偶联的合适活化基团活化PEG 和其它水溶性聚合物。活化的聚合物试剂将带有与因子VIII部分反应的反应基团。用 于使这些聚合物与活性部分轭合的有代表性的聚合物试剂和方法是本领域中公知的且进 一步描述在hlipsky，S.等的“官能化聚(乙二醇)在多肽类修饰中的应用”(〃 Use of Functionalized Poly (Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides")-《聚乙二醇化学生物技术与生物医学应用》(Polyethylene Glycol Chemistry =Biotechnical and Biomedical Applications), J.M.Harris, Plenus Press, New York(1992)； 禾口 Zalipsky (1995)《高级药物综述》(Advanced Drug Reviews)!^ 157-182。一般来说，共轭物中任意指定聚合物的标称平均分子量为约100道尔顿至约 150，000道尔顿。然而，典型范围包括大于5，000道尔顿至约100，000道尔顿范围、约6，000 道尔顿至约90，000道尔顿范围、约10，000道尔顿至约85，000道尔顿范围、约20，000道尔 顿至约85，000道尔顿范围和约53，000道尔顿至约85，000道尔顿范围内的标称平均分子 量。对任意指定的水溶性聚合物而言，优选具有这些分子量范围的PE(^s。水溶性聚合物链段的典型标称平均分子量包括约100道尔顿、约200道尔顿、约 300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约 800道尔顿、约900道尔顿、约1，000道尔顿、约2，000道尔顿、约2，200道尔顿、约2，500 道尔顿、约3，000道尔顿、约4，000道尔顿、约4，400道尔顿、约5，000道尔顿、约6，000道 尔顿、约7，000道尔顿、约7，500道尔顿、约8，000道尔顿、约9，000道尔顿、约10，000道尔 顿、约11，000道尔顿、约12，000道尔顿、约13，000道尔顿、约14，000道尔顿、约15，000道 尔顿、约20，000道尔顿、约22，500道尔顿、约25，000道尔顿、约30，000道尔顿、约40，000 道尔顿、约50，000道尔顿、约60，000道尔顿和约75，000道尔顿。当用作聚合物时，PEG s—般包括许多(OCH2CH2)单体。本说明书上下文中所用的 重复单元数量由〃(OCH2CH2)n“中的下标〃 η"确定。因此，(η)值一般在如下范围中的一 种或多种2至约2，300 ；约100至约2，300 ；约1；35至约2，000 ；约230至约1，900 ；约450 至约1，900 ；和约1，200至约1，900。对分子量已知的任意指定聚合物而言，通过用聚合物 的总分子量除以重复单元的分子量确定重复单元的数量(即“n")是可能的。用于本发明的一种特别优选的聚合物为封端聚合物，即带有至少一个被相对惰性 的基团，诸如低级Cp6烷氧基封端的末端的聚合物。例如，当聚合物为PEG时，优选使用甲 氧基-PEG (常称作mPEG)，它是PEG的线性形式，其中聚合物的一个末端为甲氧基(-OCH3)， 而另一个末端为羟基或可以任选进行化学修饰的其它官能团。在适用于本发明的一种形式中，游离或未结合的PEG为在每一末端上被羟基终止 的线型聚合物HO-CH2CH2O- (CH2CH2O)m, -CH2CH2-OH,其中(m') 一般在0至约4，000的范围。可以将上述聚合物α -，ω-二羟基聚(乙二醇)表示为H0-PEG-0H的简单形式，其 中可以理解-PEG-符号可以表示下列结构单元-CH2CH20-(CH2CH2O)m, -CH2CH2-，其中(m') 如上述所定义。适用于本发明的另一种类型的PEG为甲氧基-PEG-OH或简写为mPEG，其中一个末 端为相对惰性的甲氧基，而另一个末端为羟基。mPEG的结构如下所示。CH3O-CH2CH2O- (CH2CH2O) m’ -CH2CH2-OH其中(m')如上述所定义。诸如描述在美国专利No. 5，932，462中的那些多臂或支化PEG分子也可以被用作 PEG聚合物。例如，PEG可以具有如下结构
权利要求
1.缀合物，其包含经由可降解键或因子VIII多肽内所含的半胱氨酸残基的巯基与该 因子VIII多肽共价结合的水溶性聚合物，其中所述因子VIII多肽选自由因子VIII、因子 Villa、因子VIII C、因子VIII :vWF和B-结构域缺失的因子VIII组成的组，并且其中所述 水溶性聚合物选自由聚(亚烷基二醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚Tl唑啉和 聚(丙烯酰吗啉)组成的组。
2.权利要求1的缀合物，其中所述因子VIII多肽与一个、两个、三个或四个水溶性聚合 物共价结合。
3.权利要求2的缀合物，其中所述因子VIII多肽与一个、两个或三个水溶性聚合物共 价结合。
4.权利要求1的缀合物，其中所述水溶性聚合物是聚(环氧烷)。
5.权利要求4的缀合物，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
6.权利要求5的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)被封端部分封端，所述的封端部分选 自由羟基、烷氧基、取代的烷氧基、链烯氧基、取代的链烯氧基、炔氧基、取代的炔氧基、芳氧 基和取代的芳氧基组成的组。
7.权利要求6的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)被甲氧基封端。
8.权利要求6的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)被羟基封端。
9.权利要求5的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的标称平均分子量在大于5，000 道尔顿至150,000道尔顿的范围内。
10.权利要求9的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的标称平均分子量在10，000 道尔顿至85，000道尔顿的范围内。
11.权利要求10的缀合物，其中所述的聚(乙二醇)具有的标称平均分子量在20，000 道尔顿至85，000道尔顿的范围内。
12.权利要求1的缀合物，其中所述水溶性聚合物为线型的。
13.权利要求1的缀合物，其中所述水溶性聚合物为支化的。
14.权利要求1的缀合物，其中所述的因子VIII多肽选自由因子VIII、因子Villa、因 子VIII:C和因子VIII: vWF组成的组。
15.权利要求1的缀合物，其中所述的因子VIII多肽为B-结构域缺失的因子VIII。
16.权利要求1的缀合物，其中所述的因子VIII多肽为因子VIII:vWF。
17.权利要求1的缀合物，其中所述的因子VIII多肽为重组的因子VIII多肽。
18.权利要求1的缀合物，其中所述的因子VIII多肽是从血液中获得的。
19.权利要求5的缀合物，其中该缀合物是单PEG化的。
20.权利要求5的缀合物，其中该缀合物是二PEG化的。
21.权利要求1的缀合物，其包含经由可降解键与因子VIII多肽共价结合的水溶性聚 合物。
22.权利要求21的缀合物，其中所述键是水解可降解的，以允许释放母体因子VIII多肽。
23.权利要求21的缀合物，其中所述水解可降解的键选自由羧酸酯、磷酸酯、硫羟酸 酯、酸酐类、缩醛类、酮缩醇类、酰氧基烷基醚、亚胺类和原酸酯类组成的组。
24.权利要求1的缀合物，其包含经由因子VIII多肽内所含的半胱氨酸残基的巯基与因子VIII多肽共价结合的水溶性聚合物。
25.权利要求对的缀合物，其中所述因子VIII多肽是经修饰以便添加半胱氨酸残基的 因子VIII多肽，所述半胱氨酸残基与所述水溶性聚合物共价结合。
26.权利要求25的缀合物，其中所述因子VIII多肽是经修饰以便添加半胱氨酸残基的 B-结构域缺失的因子VIII，所述半胱氨酸残基与所述水溶性聚合物共价结合。
27.权利要求25或沈的缀合物，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)并且所述缀合 物是单PEG化的。
28.权利要求对的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由位于所述因子VIII多肽的Al 亚基内的半胱氨酸残基的巯基与所述因子VIII多肽共价结合。
29.权利要求M的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由位于所述因子VIII多肽的A2 亚基内的半胱氨酸残基的巯基与所述因子VIII多肽共价结合。
30.权利要求M的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由位于所述因子VIII多肽的A3 亚基内的半胱氨酸残基的巯基与所述因子VIII多肽共价结合。
31.权利要求对的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由位于所述因子VIII多肽的Cl 亚基内的半胱氨酸残基的巯基与所述因子VIII多肽共价结合。
32.权利要求M的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由位于所述因子VIII多肽的C2 亚基内的半胱氨酸残基的巯基与所述因子VIII多肽共价结合。
33.权利要求对的缀合物，其是通过末端为马来酰亚胺的水溶性聚合物与所述半胱氨 酸残基的巯基反应而形成的。
34.权利要求对的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由硫醚键与所述因子VIII多肽共 价结合。
35.权利要求对的缀合物，其中所述水溶性聚合物经由二硫键与所述因子VIII多肽共 价结合。
36.组合物，其包含一种或多种根据权利要求21的缀合物。
37.组合物，其包含一种或多种根据权利要求M的缀合物。
38.组合物，其包含多种权利要求21或M的单PEG化或二PEG化因子VIII多肽缀合 物，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
39.权利要求38的组合物，其中该组合物不含所述缀合物的位置异构体。
40.权利要求36或37的组合物，其中该组合物不含清蛋白。
41.权利要求36或37的组合物，其中该组合物不含没有因子VIII活性的蛋白质。
42.权利要求36或37的组合物，其呈冻干的形式。
43.权利要求36或37的组合物，其呈液体形式。
44.权利要求36或37的组合物，它进一步包含药物上可接受的赋形剂。
全文摘要
本发明提供了聚合物-因子VIII多肽缀合物。一般来说，所述的水溶性聚合物为聚(乙二醇)或其衍生物。本发明还提供了包括所述缀合物的组合物、制备所述缀合物的方法和对患者给予包括所述缀合物的组合物的方法。
文档编号A61K38/19GK102139114SQ201010541868
公开日2011年8月3日 申请日期2004年2月26日 优先权日2003年2月26日
发明者M·D·本特利, M·J·博萨德 申请人:尼克塔治疗公司