专利名称：抗爱滋免疫调节复合剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗爱滋治疗性免疫复合剂，该制剂具有依赖于非特异性抗原的免疫能力。
众所周知，细菌学中的壁表面，膜表面或荚膜表面的抗原(以结合或游离方式溶于培养基)是糖蛋白、多肽或多糖类。
最近大量报道的疫苗皆属于结合于核糖核酸(源于核糖体)，诸如蛋白多糖或多糖类膜物质，以及致病菌的提取物。
这些疫苗利用特异性抗原，适应于确定的特异性，微生物感染。
然而，抗原能力主要取决于微生物细胞的核糖核酸(尤其核糖体)。竞争性免疫细胞直接利用核糖核酸作为活性载体。
为了建立我们新型的免疫复合剂，以便替代细菌血清型抗原，我们将核糖核酸(源于优选核糖体)与存在于Ⅲ型胶原蛋白中的一个糖蛋白类的氨基酸序列(以共价键结合)偶联(人体中，胶原蛋白近似表示机体的蛋白层；Ⅲ型被选用于它的氨基酸序列，同时由于它基本上存在于管壁和真皮中)。
另外，核糖核酸已被应用于非细胞疫苗的制备中(参见，Infect.andImmunity，1，574-82，1970)。这个核糖核酸被相连接的因子所稳定。
在我们的复合剂中，我们利用用来建立核糖体核糖核酸相同的菌种作为细胞膜部分的稳定剂。
上述膜部分包含了全部的多糖肽物质。另外，此类物质作为其它通用免疫辅助剂已众所周知。
然而，这并不违背需要具有与那些通过提取其核糖体而获得相同微生物的相同膜部分(葡聚糖或多糖蛋白)。
关于所发明疫苗复合剂的组成A.所应用的源于核糖体，核糖核酸可以通过提取如下菌种而获得。
如下列举有限的几个菌种-Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)-Streptococcus(pneumoniaeetpyogenes)(肺炎链球菌和化脓链球菌)-Staphilococcusaureus(金黄色葡萄球菌)-Serratiamarcescens(黏质沙雷氏菌)-Escherichiacoli(埃希氏大肠杆菌)-Salmonellatyphimurium(鼠伤寒沙门氏菌)-Corynebacterium(granulosam，parvum，acnts))；(棒杆菌)-Mycobacterium(tuberculosis，smegmatis，chelonei)(结核分枝杆菌，解皂菌状杆菌，龟分枝杆菌)-Hemophilusinfluenzae(流感嗜血菌)-PneumocoquetypeⅡ(Ⅱ型肺炎球菌)-Rothiadentocariosus-Bacteriumcoli(肠细菌)-Shigelladysentariae(痢疾志贺氏菌)
-Enterococcus(肠道球菌)-Nocardia(asteroides[星型诺卡氏菌]，brasiliensis，rhodocrans，opaca[不透明诺卡氏菌]，rubra[红色诺卡氏菌])(诺卡氏(放线)菌)-BacilledeCalmetteetGuerin(结核菌苗)这些核糖核酸的平均分子量介于5.104和108道尔顿之间。
有关此类核糖核酸的制备已有多种工业方法，作为一个例子我们引用发表在“InfectandImmunity，1，574-82，1970”中有关核糖核酸的提取过程将所用细菌磨碎后进行分段沉降，其间核糖体蛋白被溶解，而沉淀的核糖核酸用链霉蛋白酶处理，最后再用离子交换色谱纯化。
如果核糖核酸用酶学方法获得，最后的纯化可以用分子筛色谱进行纯化。重点参见如图文献-C.EHRESMAN(1972)-Biochimie，54，901-H.KAGAWA(1972)-J.Biochem.，(1972)，827-M.SANTER(1973)-J.Bact，116，1304-NOMURA(1974)-Ribosomes，Ed.ColdSpringHarborLaboratoryB.所用的细菌细胞膜部分可以通过提取如下菌种而获得，下表给出有限的几个菌种。
1-荚膜多糖-Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)-Streptococcuspneumoniae(肺炎链球菌)-Hemophilusinfluenzae(流感嗜血菌)-Escherichiacoli(埃希氏大肠杆菌)肺炎克雷伯氏菌-C.ERBING，L.KENNE，B.LINBERG，J.LONNGREN(1976)-StructuralstudiesofthecapsularpolysaccharideofKlebsiellapneumoniaetypeI(Carbohydr.Res.，50(1976)115-20).
-W.NIMMICH(1968)-ZurIsolierungundqualitativenBausteianalysederK.AngigenvonKlebsiellen(Med.Mikrobio.undImmunol.，154，117，131).
-C.RICHARD(1973)-Etudeantigeniqueetbiochimiquede500souchesdeKlebsiella(Ann.Biol.Clin.，1973)肺炎链球菌-F.KAUFFMANNetE.LUND(1954)(Int.Bull.Bact.Nomencl.4，125-28)-FELTONetOTTINGER(J.ofBacteriology，194243，94，105)-M.COLIN，M.D.MACLEODetcoll.-Preventionofpneumococcalpneumoniaebyimmunizationwithspecificcapsularpolysaccharides(J.Exp.Med.，1945，82，445-64)-A.R.DOCHEZetO.T.AVERY-TheelaborationofspecificsolublesubstancebyPneumocococcusduringgrowth(1971)(J.Exp.Med.26，477-93).
-WESTPHALetLUDERITZ(1952)(Z.Naturf.7B，148)-C.P.J.GLAUDEMANSetH.P.TREFFERS-AnimprovedpreparationofthecapsularpolysaccharidefromDiplococcuspneumoniae(Carbohydr.Res.1967，4，181-84)流感嗜血菌(多核糖磷酸型荚膜多糖)-P.ANDERSONetcoll.(1972)-Immunizationofhumanswithpolyribosephosphate，thecapsularantigenofHemophilusinfluenzaetypeB(J.ofClin.Invest.，vol.51，1972，39-44)-P.ANDERSONetcoll.(1977)-IsolationofthecapsularpolysaccharidefromsupernatantofHemophilusinfluenzaetypeB(Infect.andImmun.，1977，15(2)，472-77).
埃希氏大肠杆菌(荚膜多糖)-LUDERITZetcoll.(1977)-Somaticandcapsularantigensofgram-negativebacteria(Compr.Biochem.26A，105-228)2-膜脂多糖(LPS)-Corynebacterium(avidum，bovis，diphteriae，enzymicum，equi，fascians，flaccum，facients，flavidum，fusiforme，granulosum，helvolum，hypertrophicans，insidiosum，liquefaciens，parvum，paurometabolum，pyogenes，rumescens，xerosis)(棒杆菌)-etlesgram-moins(革兰氏阴性菌)-Klebsiella(pneumoniaeetrhinoscleromatis)(肺炎克雷伯氏菌和鼻硬结克雷伯氏菌)-Salmonellatyphimurium(鼠伤寒沙门氏菌)-Serratia(marcescens，corralina，indica，plymuthica，kiluea)(沙雷氏菌)-Neisseriameningitidis(脑膜炎奈瑟氏球菌)-Escherichiacoli(埃希氏大肠杆菌)-C.ERBINetcoll.(1977)-StrictualstudiesontheKlebsiellaLPS(Carbohydr.Res.，56，377-81).
-C.B.CASTORetcoll.(1971)-CharacteristicsofahighlypurifiedpyrogenicLPSofKlebsiellapneumoniae(J.ofPharm.Sci.，60，(10)，1578-80).
-K.FUKUSHI(1964)-ExtractionandpurificationofendotoxinfromEnterobacteriaceae:acomparisonofselectedmethodsandsources(J.ofBacteriol.87，(2)，391-400).
-G.A.LIMJUCO-StudiesonthechemicalcompositionofLPSfromNeisseriameningitidisgroupB(J.ofGen.Microbiol.1978，104，187-91).
-G.A.ADAMS(1967)-ExtractionofLPSfromgram-negativebacteriawithDMSO(Canad.J.Biochem.，45，422-26).
-K.G.JOHNSON(1976)-ImprovedtechniquesforthepreparationofbacterialLPS(Canad.J.Microbiol.(22)，29-34).
-Y.B.KIMetcoll.(1967)-BiologicallyactiveendotoxinsfromSalmonellamutans(J.ofBacteriol.，94，(5)，1320-26).
3-膜蛋白-Escherichiacoli(埃希氏大肠杆菌)-Serratiamarcesens(黏质沙雷氏菌)-Streptococcuspyogenes(化脓链球菌)-Salmonellatyphimurium(鼠伤寒沙门氏菌)埃希氏大肠菌-S.F.STIRMetcoll.(1967)-Episome，carriedsurfaceantigenK88ofEscherichiacoli(J.ofBacteriol.，93，(2)，731-39).
-S.J.BETZetcoll.(1977)-ChemicalandbiologicalpropertiesofaproteinrichfractionofbacterialLPS(J.ofImmunol.，119，(4);1475-81).
黏质沙雷氏菌-W.WOBER(1971)-Studiesontheproteinmoietyofendotoxinfromgram-negativebacteria，characterisationoftheprotein-moietingisolatedbyaceticacidhydrolysisofendotoxinofSerratiamarcescens.
化脓链球菌-M.K.WITTNER(1977)-Homologousandheterologousprotectionofmicewithgroup-AStreptococcalMproteinvaccine(Infect.andImmun.，1977，15，(1)，104-8).
鼠伤寒沙门氏菌-N.KUUSIetcoll.(1979)-Immunizationwithmajoroutermembraneproteininexpetimentalsalmonellosisofmice(Infect.andImmun.，1979，25，(3)，857-62).
-C.BARBERetcoll.(1972)-TheprotectiveroleofproteinsfromSalmonellathyphimuriumininfectionofmicewiththeirnaturalpathogen(Rev.Immunol.，36，77-81).
-G.DELORD(1979)-Etuded′unantigènevaccinantcontenudanslesurnageantdeculturedeSalmonellathyphimurium，soucheM-206，thèsedemédecinedeLyonn°428，1979.
-G.W.GOODMAN(1979)-CharacterizationofthechemicalandphysicalpropertiesofanovelB-lymphocyteactivatorendotoxinprotein(Infect.andImmun.，1979，24(3)，685-96).
4-磷壁质和脂磷壁质链球菌、葡萄球菌和乳杆菌(革兰氏阳性菌)，表面由磷壁质构成，此类物质是由磷酸二酯桥连接的甘油聚合体)。
如下文章阐述获取过程-M.M.BURGER(1966)-Teicho c acids:antigenic determinants，chain separation，and their location in the cell wall(Microbiology 56，910-17).
-K.W.KNOX(1973)-Immunological properties of teicho c acids (Bacteriol.Reviews，37，21，215-57).
-G.A.MILLER(1976)-Effects of streptococcal lipoteicho c acid on host response in mice(Infect.and Immun.，1976，13，(5)，1408-17).
-A.J.WICKEN et coll.(1975)-Lipoteicho c acids:a new class of bacterial antigens(Science，187，1161-67).
不同的可行剂量核糖核酸* FISKE et SUBBAROW-Dosage de phosphore.Chromatographie HPLC sur colonne échangeuse d′ions pour le contr le qualitatif(J.Biol.Chem.(1926)，66，375).
蛋白质*LOWRY(J.Biol.Chem.(1951)，193，265-75).
己糖*T.A.SCOTT-Dosagecolorimétr.àl′anthrone(Anal.Chem.(1953)，25，1956-61).
己糖胺*L.A.ELSON(Biochem.J(1953)，27，1824-28).
脂多糖*J.JANDAetE.WORK(FebsLetters，1971，16(4)，343-45).
C-其它免疫辅助因子，除膜部分之外有-Ⅲ型胶原蛋白-氯化钠所用Ⅲ型胶原蛋白特征如下a-如下顺序相连的氨基酸序列(浓度以克/千克表示)-天冬氨酸AA51.5-羟基脯氨酸HP107.0-苏氨酸TH16.1-色氨酸SE27.8-谷氨酸AG95.9-脯氨酸PR124.0-甘氨酸GL149.0-丙氨酸AL87.9-缬氨酸VA23.3-蛋氨酸ME7.5-异亮氨酸IL14.4-亮氨酸LE27.8
-酪氨酸TY6.7-苯丙氨酸PA14.4-赖氨酸LY28.6-组氨酸HI5.5-精氨酸AR73.0b.性状分析如下-颜色浅黄白色-表观密度250克/升-湿度6%-10%溶液pH6.9-40℃时Engler粘度(17.75%溶液)2.5-脂肪含量0.9%-灰分含量2.2%-铁+铜+钙含量462毫克/千克-重金属弧光发射光谱下未检测出-元素分析C46.80%H7.10%N14.96%有关所发明免疫复合剂的组成由核糖核酸或核糖体核糖核酸片段，膜部分(例如肺炎克雷伯氏菌的蛋白多糖)和Ⅲ型胶原蛋白相结合，再加上氯化钠和一个抗炎剂，可以通过施用微剂量而不产生任何毒性，而获得一个高水平保护和痊愈作用。
优先选用的剂型是上述成分的注射剂，然而在附有一个药物使用说明情况下，采用其他剂型和/或其他支持剂或可兼容的添加剂也是可行的。
免疫复合剂作用机制具文献报道，上述免疫治疗复合剂具有淋巴激活素的特性，可以固定在巨噬细胞上而抑制病毒在细胞内的生长。
1974-75A.S.和G.P.YOUMANS证实应用不同的抑制剂可以对核糖核酸的免疫反应起抑制作用。
我们发现所发明的免疫复合剂恰恰对V.I.H.逆转录病毒的复制产生相同的抑制作用。
YOUMANS一直从事于一个只能寄生在细胞内的细菌菌株的研究。
自从1972年VENNEMAN和同事阐述真正的抗原可能是结合在核糖核酸上而作为它的一个辅助因子。他们用核糖体核糖核酸免疫小家鼠，此核糖核酸由苯酚在65℃下提取取鼠伤寒沙门氏菌－菌株的核糖体而获得。免疫三十天后的动物比用活菌株疫苗保护效果更好(减缓的)。
尤其证实了保护作用与注射的核糖核酸量有关。
迄今已知，从肺炎链球菌提取的核糖体核糖核酸可以诱导天然体液的免疫的保护作用，而从肺炎克雷伯氏菌提取的核糖体核糖核酸可以诱导天然细胞免疫的保护作用。
DUSSOURDd’HINTERLAND，FONTANCES及同事(法国里昂军事医学研究中心微生室)进行的初步实验已经表明，注入小鼠和豚鼠活体内的复合剂对肺泡的巨噬细胞可产生作用。
当用致溶血空斑的酸性磷酸酯与小鼠的脾细胞直接接触时重新发现了这一“短暂”效应。
在DUSSOURDd’HINTERLAND对核糖体疫苗进行的免疫学研究中，当此类疫苗在FREUND辅助剂(不完全)或克雷伯氏菌膜蛋白多糖存在下施用于动物体时，它们可以诱导O.F.品系雌性小鼠体内特异性抗体的产生。
对于我们的免疫复合剂过程而言，当体液和细胞免疫被激活以后，紧接着对V.I.H.产生一个非特异性的但又极为重要的作用。由于恰恰是机体本身被激起而抵抗感染细胞(P24抗原血在假完全态下减弱至零)所以我们可以累积这一作用而产生一个“病毒坏死因子(V.N.F)。
S.ROSENBERG的治疗过程，尽管与我们的近似，但不完全一致。他将一个可以产生肿瘤坏死因子(T.N.F.)的基因固定在人的脱氧核糖核酸上。此基因在埃希氏大肠杆菌克隆和繁殖后，借助一个病毒载体将其引入我们在肿瘤中遇到的T淋巴细胞(杀手)。
由于采用的辅助剂(膜蛋白多糖，Ⅲ型胶原蛋白、氯化钠的结合体)对核糖核酸(非特异性细菌核糖体)产生的调理素作用，我们的治疗机理允许产生一个天然克隆。
此克隆不仅诱导免疫作用来抵抗抗-HIV抗体的个体基因型，而且产生一个抗体来抵抗病毒对CD4分子的连接部位。为了减弱或抑制抗CD4自动免疫反应(CD4淋巴起作用)，当用此免疫复合剂治疗时必须使用类皮质激素陪塞米松二磷酸盐20-60mg溶液，静脉、肌肉注射。
此作用不仅伴随产生一个内源干扰素，而且使天然杀伤(N.K.)细胞活化。
因此，我们的免疫调节复合剂的目标就是当一个病毒感染源带入机体内时，诱导一个免疫反应来阴抑或至少降低(直至可自动防御阈值)感染原的增值。
与其他治疗剂相比，我们的治疗剂的新颖就在于在感染之前减缓或消除已存在的抑制细胞剂而发生作用。
我们的治疗通过细胞和/或体液的防御机制而产生抗爱滋反应。
结论我们的治疗复合剂通过定向优化而产生核糖核酸分子，这些分子与病素蛋白接合，而阻断爱滋逆转录病毒的感染。
免疫复合剂的给药途径此免疫复合剂可以口服，但首选方法是肠胃道外给药；或者静脉内直接注射；或者缓慢滴注；或者皮下注射；上述给药途径实验证明是有效的。
日服量和服用次数主要取决于患者的状况。由于复合剂的低毒性，高剂量不具有任何危险。
静脉注射方法，平均每月连续用药一周，此周的每一天同时滴注500毫升无菌溶液。
-0.9%氯化钠-40微或膜糖部分(肺炎克雷伯氏菌的蛋白多糖)-22微克核糖核酸(核糖体)*肺炎双球菌7微克*化脓链球菌(A12)7微克*肺炎克雷伯氏菌7微克*流感嗜血菌1微克
-10微克上述Ⅲ型胶原蛋白-8毫克陪塞米松二磷酸钠(或2毫升注射液)对于应该采用急救方法的患者，缓慢静脉注射之后，紧接着进行皮下注射治疗。
-40微克膜糖部分(肺炎克雷伯氏蛋白多糖)-22微克核糖核酸(核糖体)*肺炎双球菌7微克*化脓链球菌(A12)7微克*肺炎克雷伯氏菌7微克*流感嗜血菌1微克-10微克上述Ⅲ型胶原蛋白-0.5毫升0.9%氯化钠-4毫克(陪塞米松二磷酸(或1毫升注射液)此治疗可连续进行几个月，直至血清阳性完全呈阴性反应(即P24抗原=0)下述有限的几个病历，用来阐述我们治疗性免疫复合剂的具体效果。
实施例1J.A……先生，65岁，血友病，感染于八年前的一次输血。爱滋病和肝炎(组ⅣC2)。1991年9月出现严重代偿性失调。住院，虚弱无力，体重减轻，肠代谢失调，鼻窦炎，等，……AZT治疗无效。
1992年9月-接受我们免疫复合剂治疗静脉注射几个疗程后，于1992年12月再进行皮下注射治疗。
目前，我们证实-整体状况良好-体重增加
-P24抗原血清呈阴性反应实施例2A.A……夫人，59岁，上述患者配偶，1992年5月出现严重代偿性失调，虚弱无力和体重减轻(组ⅣA)。
1992年9月-接受我们的免疫复合剂治疗静脉注射几个疗程后，于1992年12月再进行皮下注射治疗。
目前，我们证明-整体状况良好-增加至原来体重-P24抗原血清呈阴性反应实施例3E.C……先生，30岁，感染于六年前性关系，1988年诊断为爱滋病(组ⅣC1)。1992年，患者虚弱无力，肺气肿(接受大剂量AZT+Bactrim治疗)。
1992年9月-接受我们的免疫复合剂治疗只进行皮下注射几个疗程，同时停止所有其他治疗。
目前，我们确认-整体状况极佳(已可以从事职业性活动)-P24抗原血清呈阴性反应根据患者的要求以及他们所正在接受治疗的确实无效，应用我们的免疫复合剂已对其中各类患者进行了治疗。
权利要求
1.抗爱滋免疫调节复合剂，是含有如下组分的一个复合物-所选细胞核糖核酸，所述细菌膜部分-糖肽和脂多糖-和Ⅲ型胶原蛋白氨基酸。
2.根据权利要求1的免疫调节复合剂，其特征在于该免疫调节复合剂可以识别两种分子，这些分子由可以确保结合于一个靶标的氨基酸功能臂与一个核糖核酸基因臂偶联而成，而且此基因臂必须有与功能臂组成相对应的密码记录。
3.根据权利要求1或2的免疫调节复合剂，其特征在于它应具有产生抑御病毒结合部位的(尤其对CD4分子)定向抗体和产生内源干扰素。
4.根据权利要求1至3之一的免疫调节复合剂，其特征在于，针对血清阳性这一问题，该免疫调节复合剂诱导一个个体基因型疫苗来抵御抗-HIV抗体的个体基因型，从而达到使P24抗原血呈阴性的效果。
5.根据权利要求1至4之一的免疫调节复合剂，其特征在于，该免疫调节复合剂可以有如下不同的给药途径滴注，静脉，皮下注射，化学电极装置或其他，同时，并用氯化钠。
6.根据权利要求1至5之一的免疫调节复合剂，其特征在于它的剂型应允许同时施用主要抗炎药物(皮质激素类)，作为免疫抑制剂来抑制或减弱抗-CD4自动免疫反应(此反应作用于CD4淋巴)。
全文摘要
非特异性治疗免疫复合剂通过免疫调节起作用，提供调节机体的天然抵御能力。本发明的药物可以使爱滋的P24抗原呈阴性反应。它主要由核糖核酸，微生物膜的特定部分，尤其，氨基酸顺序，氯化钠和抗炎甾类药物按确定的比例组成。根据发明所言，此药物尤其适用于治疗后天免疫缺乏症。
文档编号A61K31/70GK1106980SQ9419016
公开日1995年8月16日 申请日期1994年2月18日 优先权日1993年3月31日
发明者费尔南德·纳贝·托罗索昂 申请人:费尔南德·纳贝·托罗索昂