专利名称：调节性树突细胞的制备方法
技术领域：
本发明涉及在起因于免疫系统的异常应答和过度应答的移植排斥反应、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、变态反应疾病、慢性炎性疾病和败血症等疾病的预防和治疗中利用的调节性树突细胞的制备方法。更详细地，本发明涉及应用[1，2，4]三唑并[l，5_a]嘧啶衍生物、特别是(S)-(+)-1-(5-羟基-I, 5- 二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑[1，5-α]嘧啶-2-基]脲(ΝΚ026680)的调节性树突细胞的制备方法。进一步地，本发明涉及通过上述方法制备的调节性树突细胞、以及含有上述调节性树突细胞的药物组合物或药物试剂盒。进一步地，本发明涉及[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物在调节性树突细胞的制备中的用途。
背景技术：
对于起因于免疫性的异常和过度应答的疾病的预防和治疗，迄今主要利用免疫抑 制剂、抗炎症剂和抗变态反应剂等药剂。药剂治疗是有效的，但也产生副作用引起的患者的QOL低下的问题。这些药剂也迁移到靶免疫细胞以外的组织。药物在这种靶外组织中表现非特异性的作用，从而出现副作用。由于这种副作用，常常发生尽管显示免疫抑制效果也不得不中止给药的情况，另外，进行用于减轻副作用的医疗处置等有时也降低患者的Q0L。也尝试通过局部给药减轻副作用，但其限于疾病部位局限于特定的组织或器官的特应性皮炎、支气管哮喘等。因此，尝试应用调节性树突细胞进行前述疾病等的预防和治疗。树突细胞是具有树状突起的抗原呈递细胞，在末梢非淋巴组织、淋巴组织中作为未成熟树突细胞广泛存在。在受微生物、病毒、异物等外来抗原侵袭的炎症组织中，其吞噬这些抗原而分化为成熟树突细胞，并向所属次级淋巴组织迁移。在此处，成熟树突细胞与抗原刺激共刺激幼稚T细胞，使其分化诱导为抗原特异性效应T细胞而引起免疫应答。这样的树突细胞是连接天然免疫和获得性免疫的强有力的抗原呈递细胞。一方面揭示了，存在在炎症环境下共刺激分子的表达降低的树突细胞，这些树突细胞抑制性地调节T细胞，诱导对自身组织等的免疫耐受。这样的树突细胞称为调节性树突细胞。应用调节性树突细胞的免疫细胞疗法在小鼠中在移植物抗宿主病、自身免疫疾病、变态反应疾病模型中诱导抗原特异性不应答T细胞、调节性T细胞，从而显示治疗效果(非专利文献1、2和3)。进一步地，在小鼠败血症模型中，调节性树突细胞通过IL-10的产生阻碍炎性细胞因子的产生而显示延长寿命的效果(非专利文献4)。专利文献I记载了，将人树突细胞或其前体细胞在体外与至少含有IL-10和TGF-β的细胞因子类共培养而诱导人免疫调节性树突细胞的方法，和通过该方法得到的人免疫调节性树突细胞。专利文献2尝试了，将调节性树突细胞作为IL-10产生促进剂使用，用于全身性炎症反应综合征。迄今，致力于应用如前述的调节性树突细胞的免疫细胞疗法对免疫疾病的临床应用，对于实际临床应用，需要建立包含调节性树突细胞的安全性的大量制备方法。如非专利文献I中所示，迄今报告的调节性树突细胞的制备中使用包含IL-IO和TGF-β的细胞因子类等，但由于这些细胞因子类由大肠杆菌等的基因重组体制备，具有阻碍大量制备的制备成本、安全性的问题。一方面，[I, 2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物(专利文献3和4)是阻碍树突细胞的功能的物质，对小鼠延迟型过敏反应显示抑制作用(专利文献4)。特别地，在其衍生物之一的(S)-⑴-1-(5-羟基-1,5-ニ甲基己基)-3-[7-(4_甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[I, 5-α]嘧啶-2-基]脲(下文称为“ΝΚ026680”)存在下培养树突细胞，共刺激分子的表达降低，另外ΝΚ026680对移植物抗宿主病模型和自身免疫性血管炎模型显示效果(非专利文献5和6)。现有技术文献 专利文献 专利文献I :特开2004-298181号公报 专利文献2 :特开2006-290761号公报 专利文献3 :特开2005-154335号公报 专利文献4 :国际公开2004/108729号公报。非专利文献
非专利文献 I Sato K, Yamashita N, Yamashita N, Baba M, Matsuyama T.Regulatory dendritic cells protect mice from murine acute graft-versus-hostdisease and leukemia relapse. Immunity 2003; 18(3): 367-379.
非专利文献 2 :Sato Kj Yamashita N，Baba M，Matsuyama T. Modified myeloiddendritic cells act as regulatory dendritic ceils to induce anergic andregulatory T cells. Blood 2003; 101(9): 3581-3589.
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非专利文献5 ；Saiga K，Toyoda E，Tokunaka K，Masuda A，Matsumoto S，MashibaHj Kuramochi H，Nemoto K，Abe F，Kawagishi N，Furukawa H，Ono Μ. NK026680，anovel compound suppressive of dendritic cell function, ameliorates mortality inacute lethal graft-versus-host reaction in mice. Bone Marrow Transplant 2006;37(3) : 317-323.
非专利文献 6 Saiga K，Yoshida M，Nakamura I，Toyoda E，Tokunaka K，Morohashi H， Abe F， Nemoto K， Nose M. Evaluation of the ameliorative effectsof immunosuppressants on crescentic glomerulonephritis in SCG/Kj mice. IntImmunopharmacoI 2008; 8(9): 1183-1189。

发明内容
发明要解決的课题
本发明要解决的课题是，建立能够安全且简便地制备大量的调节性树突细胞的方法。进ー步地，本发明要解决的课题是，提供維持患者的QOL的、对于免疫系统疾病的预防和治疗有用的调节性树突细胞。解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题而深入研究，结果发现，通过在[1，2， 4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物的存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞，能够制备调节性树突细胞，从而完成本发明。即，根据本发明，提供以下的发明。(I)调节性树突细胞的制备方法，其包括在[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物的存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞。(2) (I)中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中[1，2，4]三唑并[l，5_a]嘧啶衍生物是(S) - (+)-I-(5-羟基-1，5- ニ甲基己基)-3- [7- (4-甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]嘧啶-2-基]脲。(3) (I)或(2)中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中可诱导为调节性树突细胞的细胞是树突细胞或其前体细胞。(4) (3)中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中树突细胞的前体细胞是单核细胞。(5) (I)至⑷中的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中可诱导为调节性树突细胞的细胞是末梢血、骨髄、脾脏、或脐带血来源的细胞。(6) (I)至(5)的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其包含在GM-CSF和IL-4的存在下培养细胞。(7) (I)至(6)的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其包含在TNF-α和/或LPS的存在下培养细胞。(8)由(I)至(7)的任ー项中记载的制备方法制备的调节性树突细胞。(9) (8)中记载的调节性树突细胞，与通过在[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其CD40、CD80和CD86的表达量低。(10) (8)或(9)中记载的调节性树突细胞，与通过在[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其IL-6和IL-12 p40的产生量低。(11) (8)至(10)的任一项中记载的调节性树突细胞，与通过在[1，2，4]三唑并[I, 5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其诱导T细胞针对异源抗原活化的能力低。(12)含有(8)至(11)的任一项中记载的调节性树突细胞的药物组合物或药物试剂盒。(13) (12)中记载的药物组合物或药物试剂盒，其用于在起因于免疫系统的异常应答和过度应答的移植排斥反应、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、变态反应疾病、慢性炎性疾病和败血症的预防和/或治疗中应用。(14) [I, 2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物在调节性树突细胞的制备中的应用。(15) (14)中记载的应用，其中[1，2，4]三唑并[l，5_a]嘧啶衍生物是(S)-(+)-l-(5-羟基-1，5-ニ甲基己基)-3-[7-(4_ 甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[I, 5-α ]嘧啶-2-基]脲。(16)含有[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物的调节性树突细胞诱导试剂。(17) (16)中记载的调节性树突细胞诱导试剂，其中[1，2，4]三唑并[1，5_a]嘧啶衍生物是(S) - (+)-I-(5-羟基-1，5- ニ甲基己基)-3- [7- (4-甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]嘧啶-2-基]脲。
发明的效果
本发明中的[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物对于在生物体外从末梢血细胞、骨髄细胞等中包含的单核的细胞诱导调节性树突细胞是有用的。[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物是制备成本低且能够确保大量生产和安全性的低分子化合物。通过将[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物用于调节性树突细胞的制备，能够安全且简便地得到大量的调节性树突细胞。本发明中，可以不应用昂贵且物理性质不稳定的基因重组细胞因子类、以低成本配制大量的调节性树突细胞。另外，由于本发明的调节性树突细胞中不残留制备中使用的药剂，不发生制备中使用的药剂引起的副作用，对于骨髄抑制、脏器移植、自身免疫疾病、变态反应疾病和休克等起因于免疫系统的异常和过度应答的疾病的预防和治疗是非常有效的。


图I显示本发明的调节性树突细胞(NK-DC)、未处理树突细胞(CTR-DC)和未成熟树突细胞(unstim-DC)的3H_TdR的掺入(incorporation)。黑色圆圈表示NK-DC,白色圆圈表示 CTR-DC，X 表示 unstim-DC。图2显示分别移入本发明调节性树突细胞(NK-DC)与未处理树突细胞(CTR-DC)的C3He/J小鼠中，移植了 C57BL/6小鼠的心脏的心移植C3He/J小鼠的存活率。实线表示NK-DC,点线表示 CTR-DC。具体实施方案
本发明中，通过将可诱导为调节性树突细胞的细胞(例如，树突细胞或其前体细胞等)在试管内应用[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物处理、以及根据期望应用细胞因子类和/或炎性刺激物处理，可以制备调节性树突细胞。具体地，通过向从末梢血或骨髓等收集的单核细胞中添加GM-CSF、IL-4、[I, 2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物而诱导树突细胞、和对该树突细胞进行细胞因子类和/或炎性刺激(例如TNF-α、LPS等)处理，可以获得调节性树突细胞。另外，这些细胞因子类和/或炎性刺激、和[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物的刺激顺序没有特别限制，通过以任意顺序进行该刺激顺序，可以配制调节性树突细胞。作为ー个例子，通过将单核细胞在GM-CSF和IL-4的存在下体外培养，使单核细胞分化为树突细胞，得到的树突细胞通过[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物可诱导调节性树突细胞。此时，可以将单核细胞最初用GM-CSF和IL-4刺激分化为树突细胞后用[1，2，4]三唑并[I, 5-a]嘧啶衍生物刺激，也可以用GM-CSF、IL-4、[I, 2，4]三唑并[I, 5-a]嘧啶衍生物同时刺激。此时，可以使使调节性树突细胞分化的细胞因子类(例如IL-IO和TGF-β等)与[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物共存。进ー步地，通过TNF-α、LPS等给予炎性刺激，可以得到成熟的调节性树突细胞。在本发明的调节性树突细胞的制备中使用的细胞因子类、炎性刺激物没有特别限制。细胞因子类可列举，例如GM-CSF、IL-4、IL-10, TGF-β等具有分化诱导树突细胞的作用的物质。炎性刺激物可列举，例如以LPS为代表的脂多糖、TNF-α等赋予炎性刺激的细胞因子。树突细胞通过在GM-CSF和/或IL_4的存在下培养如前述的单核细胞获得。此时的单核细胞可以源自末梢血、源自骨髄、源自脾脏细胞、源自脐带血。进ー步地，可以利用细胞分选仪等，以⑶Ia等树突细胞特异性表面抗原的表达为指标，从这些组织、器官分离树突细胞。利用细胞分选仪分离特定细胞群可以利用公知的方法进行。用于得到本发明的调 节性树突细胞的单核细胞源自哺乳动物即可，可列举灵长目、啮齿目、食肉目、偶蹄目、奇蹄目等，例如人、猴、小鼠、大鼠、兔、猫、牛、犬、马、山羊等，最优选地是人。在上述中优选地，与利用本发明的调节性树突细胞实施疾病的预防或治疗的动物为同种来源。单核细胞、树突细胞的培养可以通过公知的淋巴系细胞培养技术进行。培养液可以应用例如RPMI1640、DMEM，可在这些基本培养基中添加适当的抗生素、动物血清等进行培养。培养容器也不进行限定，可以根据培养规模适当选择并应用市售的平板、培养皿、摇瓶。本发明中应用的[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物具体为特开2005-154335号公报和国际公开2004/108729号公报中记载的化合物。即，本发明中应用的[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物优选地是下述通式(I)中表示的化合物或其药学容许的盐。[化学式I]
权利要求
1.调节性树突细胞的制备方法，其包括在[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物的存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞。
2.权利要求I中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物是(S) - (+)-I-(5-羟基-1，5- ニ甲基己基)-3-[7- (4-甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]嘧啶-2-基]脲。
3.权利要求I或2中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中可诱导为调节性树突细胞的细胞是树突细胞或其前体细胞。
4.权利要求3中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中树突细胞的前体细胞是单核细胞。
5.权利要求I至4的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中可诱导为调节性树突细胞的细胞是末梢血、骨髄、脾脏、或脐带血来源的细胞。
6.权利要求I至5的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其包含在GM-CSF和IL-4的存在下培养细胞。
7.权利要求I至6的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其包含在TNF-α和/或LPS的存在下培养细胞。
8.由权利要求I至7的任ー项中记载的制备方法制备的调节性树突细胞。
9.权利要求8中记载的调节性树突细胞，与通过在[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其CD40、CD80和CD86的表达量低。
10.权利要求8或9中记载的调节性树突细胞，与通过在[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其IL-6和IL-12P40的产生量低。
11.权利要求8至10的任一项中记载的调节性树突细胞，与通过在[1，2，4]三唑并[I, 5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其诱导T细胞针对异源抗原活化的能力低。
12.含有权利要求8至11的任一项中记载的调节性树突细胞的药物组合物或药物试剂盒。
13.权利要求12中记载的药物组合物或药物试剂盒，其用于在起因于免疫系统的异常应答和过度应答的移植排斥反应、自身免疫疾病、变态反应疾病、炎性疾病、败血症或休克的预防和/或治疗中应用。
14.[1,2,4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物在调节性树突细胞的制备中的应用。
15.权利要求14中记载的应用，其中[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物是(S)-(+)-1-(5-羟基-1，5-ニ甲基己基)-3-[7-(4_ 甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[I, 5-α ]嘧啶-2-基]脲。
16.含有[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物的调节性树突细胞诱导试剂。
17.权利要求16中记载的调节性树突细胞诱导试剂，其中[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物是(S) - (+)-I-(5-羟基-1，5- ニ甲基己基)-3- [7- (4-甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]嘧啶-2-基]脲。
全文摘要
本发明的目的是建立能够安全且简便地制备大量的调节性树突细胞的方法。根据本发明，提供了调节性树突细胞的制备方法，包括在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞。
文档编号A61P37/06GK102834506SQ20118001051
公开日2012年12月19日 申请日期2011年2月23日 优先权日2010年2月23日
发明者藤堂省, 山下健一郎, 柴崎晋 申请人:日本化药株式会社, 国立大学法人北海道大学