专利名称：一种治疗脊髓损伤的方法和治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗脊髓损伤(SCI)的新方法和治疗剂。具体地说，本发明涉及通过向SCI忠者的脊髓的损伤部位局部注射CNS神经胶质细胞而治疗脊髓损伤的方法和活性成分是CNS神经胶质细胞的治疗剂。
背景技术：
脊髓损伤引起严重的症状截瘫(双下肢麻痹)或四肢瘫痪或甚至呼吸肌麻痹兼四肢瘫痪，因此轮椅和卧床不起的生活是不可避免的。至今仍未发现治疗SCI的有效疗法。由于瞬间的交通或运动事故而被剥夺手和脚自由的患者极渴望活动他或她自己的手和脚并通过恢复损伤的神经通路而再次行走。
自19世纪末期以来，人们已相信哺乳动物CNS通路根本不能再生或者很少再生，即使有，也无明显的功能[例如Ra’mon y Cajal，Degeneration and Regeneration in the Nervous System，1959，Hafner，New York(1928)]。但是，过去二十年的研究披露哺乳动物CNS通路的功能上的明显再生是可能的，因而否定了全世界认为的不能再生的观念。
一种关于CNS环境的假说于最近出现并逐渐成为一个教条。它主张哺乳动物CNS的环境不允许轴突生长，因而必需使环境允许诱导轴突的再生。Schwab和他的合作者发现了CNS白质中与髓磷脂相关的生长抑制因子，并推测所述因子导致哺乳动物CNS不允许再生。事实上，他们报道由抗体导致的因子的中和诱导横切之后锥体束的再生，且该束的外延越过整个成年大鼠的损伤部位[Nature，343(18)，269(1990)]。除了他们的报道之外，还进行了多种尝试使CNS环境允许诱导成年大鼠脊髓的再生移植外周神经节、雪旺氏细胞、嗅觉鞘样细胞(OEC，对嗅神经和嗅球具有特异性的神经胶质细胞)。Cheng和他的合作者报道在除去成年大鼠脊髓节段之后通过在空的脊髓间隙中桥接神经节发生功能恢复(Science，273(26)，510(1996)]。Guest和他的合作者报道通过移植雪旺氏细胞，即PNS的神经胶质细胞而发生脊髓的再生[Exp.Neurol.，148，502(1997)]。Li和他的合作者报道在部分横切颈上脊髓之后通过将培养的OEC移植到损伤部位发生锥体束的再生和功能恢复[Science，277(26)，2000(1997)]。
但是通过这些尝试使环境允许再生的投射数量小且长度短(至多10mm)，且大部分是异常的，达不到适当的目标。因此功能恢复程度小，因而后肢不能完全支持体重。为了使SCI患者从轮椅上解放出来并用他们自己的脚再次行走，重要的是开发一种新能够重建类似于正常的神经投射的治疗方法。
本发明的目的是提供一种新的在数量(投射神经元的数量)、长度(轴突的范围)、通路和末端方面实现恢复类似于正常的神经投射的方法，并使SCI患者能够再次行走。本发明还提供所述方法的治疗剂。预期本发明能减少患者和他们的家庭护理者的生理和心理负担，并节约沉重的医疗负担和社会福利成本。

发明内容
本发明基于我们的假设，即局部损伤症状而不是CNS的整体不允许环境导致轴突再生失败。所述假设与目前所持观点相当不同，但与我们的脊髓损伤研究的发现一致我们发现被横切的CNS通路中显著的再生自发地发生在小于一个月龄的大鼠被急速切割之后。在2-3个月龄的成年大鼠中，自发性再生不发生，推测因为其CNS组织比年幼动物坚硬，因而横切导致损伤部位的水肿。但是，当将胚胎大鼠脊髓组织移植到损伤部位时，类似于正常投射的轴索再生被诱导。因此，我们推测CNS环境不是整体不允许再生，而再生失败是由于局部条件恶化，即使生长轴突能够发现正确通路和目标的轴突指导线索紊乱导致的。似乎很有可能有多种因素使CNS环境允许破坏轴突指导线索的一致性，从而限制轴突再生的数量和范围，导致异常投射。根据我们的推测，我们尝试通过移植从新生大鼠脊髓收集的培养的混合的神经胶质细胞来改善损伤部位的局部条件，期望恢复损伤部位的微环境。在完全横切成年大鼠胸节段水平的脊髓之后将神经胶质细胞移植到损伤部位。移植的动物从完全截瘫恢复到几乎正常行走。再生的投射在数量、范围、通路和末端方面类似于正常。本发明通过对哺乳动物CNS再生的新认识来实现。与CNS神经胶质细胞妨碍轴突再生的常规观念完全相反，我们使用这种细胞成功地实现脊髓的神经修复。神经连接恢复和功能复原的程度大大高于根据常规观念进行尝试的程度。
本发明提供一种通过将CNS神经胶质细胞移植到损伤的人或其它哺乳动物的脊髓而治疗脊髓损伤的方法。用于移植的细胞包括除了II型星形胶质细胞之外的培养的CNS神经胶质细胞中的至少一种。本发明还提供适用于所述治疗脊髓损伤的方法的治疗剂。
所述治疗剂包含至少一种除了I型星形胶质细胞之外的培养的CNS神经胶质细胞作为活性成分，并可以包含任何医疗允许的赋形剂。本发明的进一步特征和优点将在以下“本发明的最佳实施方式”中变得清晰。
本发明的最佳实施方式CNS神经胶质细胞由I型和II型星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和它们的祖细胞组成。本发明的治疗剂包含至少一种除了I型星形胶质细胞之外的培养的CNS神经胶质细胞作为活性成分；它们可以是多于2种CNS神经胶质细胞的混合的细胞。所述的CNS神经胶质细胞优选包括所述三种细胞即I型星形胶质细胞的祖细胞、II型星形胶质细胞的祖细胞和O4祖细胞中的至少一种。最适宜的治疗剂主要包含II型星形胶质细胞的祖细胞，但可以包含I型星形胶质细胞、II型星形胶质细胞，少突胶质细胞和小胶质细胞。此外，它们可以包含雪旺氏细胞和嗅觉鞘样神经胶质。
用于本发明的神经胶质细胞的来源无限制；可以使用自体的或同种异体的或异种的CNS神经胶质细胞。其中优选自体的细胞和同种异体的细胞。对于临床应用，可以从患者自身损伤的脊髓中收集自体的细胞。可以从流产的胚胎或脑/心脏死亡的尸体中收集同种异体的细胞。可以从猪、猴或某些其它哺乳动物的CNS中收集异种细胞。由于CNS是免疫学豁免部位，异种细胞可以在施用少量免疫抑制药物时存活。
CNS神经胶质细胞的来源优选胚胎、新生儿或幼小的哺乳动物，但可以是年老的动物。优选但不是必须地从它们的脊髓中进行收集。任何其它CNS部分，例如大脑皮层、脑干或全脑可以是供应来源。来源于胚胎干细胞或神经干细胞的神经胶质细胞也可以是供应来源。神经干细胞分成成人型、胚胎型和神经上皮型。它们不仅可以从胚胎或新生儿中收集，也可以从成人中收集。神经胶质细胞可以通过常规的生物技术，使用刺激剂EGF、bFGF、CNTF、视黄酸或T3由这些来源制备[(Genes Dev.，10，3129-3140(1996)，Neuron，18，81-93(1997)，J.Neurosci.，18，3620-3629(1998))。
任何细胞培养技术可以用于制备神经胶质细胞。例如，用蛋白酶(如胰蛋白酶)处理在无菌中切除的脊髓或大脑皮层以制备单细胞或小细胞群。然后将它们接种于陪替氏培养皿并在含有血清的培养基中于CO2恒温箱中培养一定的时间。在培养期间，神经元早早死亡而混合的神经胶质细胞存活。关于细胞培养，可以使用含有10-20％胎牛血清、F-10培养基或RPMI1640或某些其它培养基的Dulbecco’s MEM(DMEM)。培养基每3-4天更换，并保持在大约30-40℃下。
过了几天，星形胶质细胞由于其旺盛的增殖潜能而变成占绝大多数的细胞，如果需要的话可以通过使用不含血清的培养基而增加少突胶质细胞。Percoll密度梯度法或粘合剂差异法有效地分离少突胶质细胞和星形胶质细胞。
可以通过制备在培养基或适宜的缓冲溶液如PBS中的培养的神经胶质细胞的悬浮液而制备适于应用的本发明的治疗剂。细胞悬浮液的培养基可以包含医学上允许的添加剂，除非它们抑制细胞活性。应用的细胞密度的范围为103-106细胞/μL，优选104-105细胞/μL。
所述治疗脊髓损伤的方法是将有效量的悬浮液注射到损伤部位。所述方法适用于人和其它哺乳动物，用于部分或全部横切。对损伤的位置没有限制髓质、颈、胸、腰或骶骨节段中的任何部分。所述的方法适用于呼吸麻痹、四肢瘫痪、截瘫，而不管其严重程度。
所述的方法最好用于由跌落事故或运动事故导致的脊髓损伤，但不一定应用于这些外伤性事故。例如它也可以用于脑血管导致的锥体束损伤。所述治疗可以优选进行急性治疗，即在24小时之内，优选8小时之内进行治疗。但是，所述的治疗也可以在慢性阶段进行，例如损伤后一周、5年或者甚至大于10年进行。后者的依据是发现相当数量的投射神经元在切断轴突之后存活数个月(大鼠为数个月，对应于人则多于10年)。因此似乎轴突的再生是可能的，条件是损伤部位的局部条件得到改善。
可以使用任何方法将培养的神经胶质细胞的悬浮液施用于损伤部位，只要它是注射安全和可靠的。例如，通过椎板切除术暴露脊髓，然后可以在外科显微镜下使用微量调节注射器髓内注射悬浮液。当获得高清度MRI图像时，可以不用椎板切除术注射细胞悬浮液，如利用腰穿刺技术进行注射。
待注射的CNS神经胶质细胞的数量取决于损伤的程度。通常对于成年患者它的总量范围为103-107细胞，优选105-107细胞。
在注射细胞之前，可以施用免疫抑制药物如环孢菌素、他克莫司(FK505)、环磷酰胺(cyclophosamid)、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤或咪唑立宾。它在移植异种细胞时是必需的。
实施例在以下的工作实施例中更为完整地解释本发明，所述实施例不限制本发明的范围。
工作实施例1制备从新生大鼠的脊髓中收集的培养的混合的神经胶质细胞并分析它们的组成无菌下从1-2日龄的EGFP-转基因SD大鼠中切除脊髓[EGFP增强的绿色荧光蛋白，SD＝Sprague-Dawley系；指FEBS Letter，407，313-319，1997]。通过胰蛋白酶和DNase处理将它解离成单细胞和小细胞群。以在补充10％的胎牛血清、青霉素100单位/mL、两性霉素B2.5μg/mL、链霉素100μg/mL的DMEM培养基中的5×105细胞/75cm2的密度将它们接种于陪替氏培养皿，并在常规条件下培养。细胞密度对应于取自3-4个脊髓/皿的物质。在第2、6和10天，加入相同组成的DMEM培养基。2周后细胞达到融合。用胰蛋白酶-EDTA(由GIBCO/BRL、0.25％胰蛋白酶、1mM EDTA制备)将它们离解，将其再接种(1皿→1皿)并培养。每3-4天进行一次培养基更换。在开始培养后的第3-4周，用胰蛋白酶-EDTA离解细胞，并用DMEM培养基(1皿提供50μL)将其制成4-5×104细胞/μL的悬浮液。在工作实施例2中施用所述细胞悬浮液。
培养的混合的神经胶质细胞的组成由抗原特异性标记分子分析并列在表1中。应用Neuroglia，Helmut Kettenmann等人，OxfordUniversity Press(1995)所述的分类。
从大鼠脊髓中收集的培养的混合的神经胶质细胞的组成细胞类型 抗原的表达充足率Vim1Ran2 A2B5 O4 GFAP (％)神经胶质细胞的直系祖细胞 + + + -- 5I型星形胶质细胞的祖细胞+ + - -- 25I型星形胶质细胞- + - -+ 502A祖细胞 + - + -- 0II型星形胶质细胞的祖细胞 + - + -+ 45II型星形胶质细胞 - - + -+ 0O4祖细胞 - - + +- 15桡骨神经胶质细胞的祖细胞 + - - -- 3(RC2+)小胶质细胞(ED1+) - - - -- 21Vim-波形蛋白工作实施例2将神经胶质细胞注射到损伤脊髓的损伤部位在胸下节段快速地完全横切成年SD大鼠(♀，2个月大)的脊髓。用哈密顿微量调节注射器，以4-5×104细胞(1μL)每个部位的数量将在工作实施例1中制备的细胞悬浮液注射到横断面嘴侧和尾侧的两个部位。用Basso，Beattie和Bresnahan[J.Neurotrauma 121-21(1995)]开发的BBB度量评价运动表现。简言之，得分0和21分别表示瘫痪大鼠的运动和正常运动。得分1至8集中在不能站立或支持重量的大鼠的肢体运动。得分9至13描述能够站立然后以不同程度的后前肢协调行走的大鼠。得分14至20描述作为脚放置、趾间隙、尾位置和躯干稳定性渐渐得到改善的良好的行走大鼠。
在开始时，用神经胶质细胞注射处理的脊髓损伤的大鼠完全截瘫和无尿，具有湿润和肮脏的肛门与生殖器区域。在外科手术后3-4天，它们开始移动后肢。一周后，后肢变得能够支持体重。2周后观察到有后-前肢协调的行走。3周后它们能够以类似于正常动物的方式行走。BBB得分从0升高到大于15。通过示踪法检查的再生的轴突在数量、范围和通路方面类似于正常的投射。它们终于正常目标并形成突触。
工作实施例3制备从成年大鼠的损伤的脊髓中收集的培养的混合的神经胶质细胞的悬浮液在胸下节段横切60天大的EGFP-转基因成年SD大鼠的脊髓[参考FEBS Letter，407，313-319，1997]。将动物饲养一个月。在外科手术后一个月，在无菌下切除2-3个包括损伤部位的节段，并用蛋白酶处理以以类似于工作实施例1所述的方式制备单细胞或小细胞群。将这些细胞或细胞群以5×106细胞(取自一只或二只大鼠的物质)/皿的密度接种于陪替氏培养皿(75cm2)，并在常规条件下在补充10％胎牛血清、青霉素100单位/mL、两性霉素B2.5μg/mL、链霉素100μg/mL的DMEM培养基中培养。在第2、6和10天加入相同组成的DMEM培养基。然后每3-4天进行培养基更换。来源于成年的物质的细胞增殖大大慢于来源于新生儿的物质，且细胞在3-4周后达到融合。如所述地用胰蛋白酶-EDTA将它们离解，将其再接种(1皿→1皿)，并再培养2周。在培养开始后5-6周，收集细胞，并以类似于工作实施例1所述的方式制备密度为4-5×104细胞/μL的悬浮液。来源于成年大鼠损伤脊髓的培养的混合的神经胶质细胞的悬浮液用于注射到工作实施例4的损伤部位。
工作实施例4将来源于成年大鼠的损伤的脊髓的培养的混合的神经胶质细胞注射到脊髓损伤部位。
在胸下节段快速地完全横切成年SD大鼠(♀，2个月大)的脊髓。以类似于实施例2所述的方法将实施例3制备的细胞悬浮液注射到损伤部位。然后动物从完全截瘫恢复到如实施例2中的行走。
对比实施施1将培养的I型星形胶质细胞注射到损伤部位以类似于先前的Wang JJ等人(Effects of astrocytesimplantation into the hemisected adult rat spinal cord.Neuroscience 65，973-981，1995)的研究的方式制备来源于新生大鼠大脑皮层的I型星形胶质细胞的细胞悬浮液。在胸下节段快速地完全横切成年SD大鼠(♀，2个月大)的脊髓，并用哈密顿微量调节注射器，以4-5×104细胞(1μL)每个部位的数量将细胞悬浮液注射到横断面嘴侧和尾侧的两个部位。所述的方法类似于工作实施例2所述的方法。在开始时，大鼠如实施例2那样完全截瘫和无尿，具有湿润和肮脏的肛门与生殖器区域，而功能恢复远远差于工作实施例2。一周后发生微小的后肢运动，但体重支持从未发生。BBB度量的评价总是小于8分。
比较实施例2将活化的培养的巨噬细胞注射到损伤部位我们制备巨噬细胞的细胞悬浮液，并通过以类似于先前SchwartzM等人(Implantation of stimulated homologous macrophagesresults in partial recovery of paraplegic rats，1998)的研究的方式共培养坐骨神经节段而进行培养和活化。在胸下节段快速地完全横切成年SD大鼠(♀，2个月大)的脊髓，并用哈密顿微量调节注射器，以4-5×104细胞(1μL)每个部位的数量将细胞悬浮液注射到横断面嘴侧和尾侧的两个部位。所述的方法类似于工作实施例2所述的方法。在开始时，大鼠如工作实施例2那样完全截瘫和无尿，具有湿润和肮脏的肛门与生殖器区域，而功能恢复远远差于工作实施例2。一周后发生微小的后肢运动，但体重支持从未发生。BBB度量的评价总是小于8分。结果非常类似于对比实施例2的结果。
工业实用性本发明提供一种通过将培养的混合的CNS神经胶质细胞注射到损伤部位而治疗脊髓损伤的方法。本发明实现修复在数量(投射神经元的数量)、长度(轴突的范围)、通路和末端方面几乎难以与正常大鼠区分的神经连接。从完全截瘫快速恢复至不仅支持体重而且进行后前肢协调行走的程度。尽管存在多种治疗脊髓损伤的努力，但这种突破是迄今未实现的，且它提供了目前不存在的有效治疗策略。当开发出有效治疗时，它将减少患者和他们的家庭护理者的医疗和心理负担，并节约沉重的医疗负担和社会福利成本。
权利要求
1.一种用于治疗脊髓损伤的治疗剂，所述治疗剂包含作为活性成分的神经胶质细胞，所述神经胶质细胞包括选自除了I型星形胶质细胞之外的培养的CNS神经胶质细胞的至少一种。
2.根据权利要求1的治疗剂，其中所述的CNS神经胶质细胞包括选自I型和II型星形胶质细胞的祖细胞和少突胶质细胞的祖细胞中的至少一种。
3.根据权利要求1的治疗剂，其中所述的神经胶质细胞主要包含II型星形胶质细胞的祖细胞。
4.根据权利要求1-3之任一项的治疗剂，其中所述的神经胶质细胞是来源于脊髓的混合的神经胶质细胞。
5.根据权利要求1-4之任一项的治疗剂，其中所述的神经胶质细胞是自体的或同种异体的。
6.根据权利要求1-4之任一项的治疗剂，其中所包含的神经胶质细胞的数量为103-106细胞/μL。
7.一种通过向人或其它哺乳动物的损伤的脊髓局部注射有效剂量的神经胶质细胞而治疗脊髓损伤的方法，所述神经胶质细胞包括选自除I型星形胶质细胞之外的培养的CNS神经胶质细胞中的至少一种。
8.根据权利要求7的方法，其中所述神经胶质细胞是来源于脊髓的混合的神经胶质细胞。
9.根据权利要求7或8的治疗剂，其中所述的神经胶质细胞是自体的或同种异体的。
10.根据权利要求7-9之任一项的方法，其中所述损伤的脊髓是成人身体的部分，而所述培养的CNS神经胶质细胞的注射总数为103-107。
全文摘要
一种用于治疗脊髓损伤的治疗剂，所述治疗剂包含作为活性成分的神经胶质细胞，所述神经胶质细胞包括作为CNS胶质细胞的I型星形胶质细胞的祖细胞和II型星形胶质细胞的祖细胞和04祖细胞；和一种特征在于通过将有效剂量的上述治疗剂局部给药而治疗脊髓损伤的方法。
文档编号A61K35/12GK1545416SQ0281643
公开日2004年11月10日 申请日期2002年8月23日 优先权日2001年8月23日
发明者川口三郎, 西尾健资, 资 申请人:川口三郎, 西尾健资