专利名称：一种鸡亚单位四联疫苗及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于禽类疫苗制造领域，具体涉及一种鸡亚单位四联疫苗及其制备和应用，即一种鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感-传染性法氏囊病四联疫苗。
背景技术：
鸡新城疫(newcastle disease，ND)是由鸡新城疫病毒(NDV)引起的禽类急性传染病，传播速度快，长期以来给我国养禽业带来了巨大的威胁。鸡新城疫活疫苗虽然效果好、价格低廉、使用方便，但其免疫期短、免疫易受母源抗体干扰，且容易引起呼吸道副作用，干扰实验室诊断病毒分离，因此，1980年以来，使用鸡新城疫灭活疫苗逐渐成为我国鸡场防治鸡新城疫的常规方法之一。鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)又称鸡传染性腔上囊病， 是由传染性法氏囊病毒引起的一种急性、接触传染性疾病。以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征，能够引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果。该病发病率高，是目前养禽业最重要的疾病之一。而且，近年来由于超强毒的出现，传统的疫苗免疫失败屡屡发生，因此，有必要筛选鸡传染性法氏囊病毒的不同等位基因，并借助基因工程亚单位疫苗的方法为鸡传染性法氏囊病预防提供了一条新的途径。鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis, IB)是急性接触性传染性呼吸道疾病，其特征为病鸡咳嗽、喷嚏、气管啰音，蛋鸡产蛋数量和质量下降。IB为世界各国集约化养鸡普遍存在的疫病，有的地区阳性率可达100%。我国主要流行的病原血清型是Massachusetts型，该型毒株异型毒株也能产生较好的免疫力，我国普遍选用M41株做为疫苗毒株。禽流感(avian influenza, Al)是由A型禽流行性感冒病毒引起的一种禽类传染病。禽流感病毒感染后可以表现为轻度的呼吸道症状、消化道症状，死亡率较低；或表现为较严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高。这种症状上的不同，主要是由禽流感的毒型决定的。本发明所采用的H9亚型毒株制备的疫苗能预防血清型为H9亚型的禽流感病毒感染。为了有效控制ND、IB、Al和IBD，减少接种次数，便于生产应用，因此，有必要提供一种鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感和传染性法氏囊病四联疫苗来满足市场的要求。

发明内容
本发明的目的是制备一种可以同时预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、禽流感和鸡传染性法氏囊病特别是超强毒感染的疫苗，其中的鸡传染性法氏囊病部分是采用大肠杆菌表达的主要抗原保护性蛋白VP2蛋白制成的亚单位疫苗。本发明的四联疫苗，包含有序列为SEQ ID NO 1的鸡传染性法氏囊病VP2蛋白和新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒。上述的四联疫苗的制备方法，是将新城疫病毒接种鸡胚后，收获胚液加入甲醛灭活；将鸡传染性支气管炎病毒接种鸡胚后，收获胚液加入甲醛灭活；将禽流感病毒接种鸡胚后，收获胚液加入甲醛灭活；然后将灭活的新城疫病毒胚液、鸡传染性支气管炎病毒胚液、禽流感病毒胚液与鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白混合后，加入疫苗佐剂乳化制成的。上述的新城疫病毒为新城疫病毒Clone30。上述的传染性支气管炎为传染性支气管炎M41。上述的禽流感病毒为H9亚型NJ02株。本发明四联疫苗免疫21日龄的鸡，可同时预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、禽流感和鸡传染性法氏囊病，免疫效果与鸡新城疫单苗、鸡传染性支气管炎灭活疫苗、禽流感及鸡传染性法氏囊病单苗效果相似，达到了减少免疫次数，降低应激的目的。
具体实施方式

IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是最主要宿主保护性抗原，本发明是用PCR方法扩增了 IBD超强毒的VP2基因，克隆到pET-28a载体上，转化BL21 (DE3)，经IPTG诱导后VP2蛋白获得了表达，将表达菌体高压匀浆破碎后离心取上清即为VP2蛋白溶液。新城疫病毒Clone30株接种10日龄SPF胚，收取培养48 96小时的鸡胚液，超滤浓缩法将病毒液浓缩，加入终浓度为O. 1%的甲醛。鸡传染性支气管炎病毒M42株接种l(Tll日龄SPF胚，收取培养24 48小时的鸡胚液，超滤浓缩法将病毒浓缩，加入终浓度为O. 1%的甲醛。将VP2蛋白液与新城疫病毒液、鸡传染性支气管炎病毒液、禽流感病毒液混合后乳化配苗。下面结合具体的实施例对本发明的鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感-传染性法氏囊病毒VP2亚单位四联疫苗进行详细的描述。一、新城疫病毒液的制备将新城疫病毒Clone30株(购自中国兽医药品监察所)，用灭菌生理盐水做适当稀释，经尿囊腔接种扩10日龄易感鸡胚，每胚O. 1ml，接种后密封针孔，直36 37°C继续孵育。弃去48小时前死亡鸡胚，此后Γ8小时照蛋一次，死亡胚随时取出，直至96小时全部取出，置疒8°C冷却12 24小时。收获鸡胚尿囊液及羊水，弃去血凝价低于1:128，进行无菌检验。新城疫病毒液的浓缩将收获的病毒液用二级预过滤柱除去大颗粒杂质，然后用病毒超滤法浓缩系统将新城疫病毒液浓缩至原体积的1/4。灭活将浓缩后的病毒液置于灭活罐内，加入终浓度为O. 1%的甲醛，随加随搅拌，使其充分混合。37°C灭活16小时。二、鸡传染性支气管炎病毒液的制备将鸡传染性支气管炎病毒M41株(购自中国兽医药品监察所)用灭菌生理盐水适当稀释，经尿囊腔接种l(Tll日龄易感鸡胚，每胚O. 1ml，接种后密封针孔，置36 37°C继续孵育。弃去24小时前死亡鸡胚，此后4飞小时照蛋一次，死亡胚随时取出，直至48小时全部取出，置2 8°C冷却12 24小时。收获鸡胚尿囊液及羊水。鸡传染性支气管炎病毒液的浓缩
将收获的病毒液用二级预过滤柱除去大颗粒杂质，然后用病毒超滤法浓缩系统将新城疫病毒液浓缩至原体积的1/4。灭活将浓缩后的病毒液置于灭活罐内，加入终浓度为O. 1%的甲醛，随加随搅拌，使其充分混合。37°C灭活16小时。三、禽流感病毒液的制备将禽流感种毒NJ02用灭菌用生理盐水做适当稀释，每胚尿囊腔内接种O.1ml，密封针孔，置36 37°C继续孵育，弃去24小时以内死亡的鸡胚，24小时后4飞小时照蛋一次，随时取出死胚，直至120小时全部取出，置2 8°C冷却12 24小时。收获鸡胚尿囊液及羊水。禽流感病毒的浓缩 将收获的病毒液用二级预过滤柱除去大颗粒杂质，然后用病毒超滤法浓缩系统将禽流感病毒液浓缩至原体积的1/4。灭活将浓缩后的病毒液置于灭活罐内，加入终浓度为O. 1%的甲醛，随加随搅拌，使其充分混合。37°C灭活16小时。四、VP2基因的筛选用Primer5. O软件设计了一对扩增鸡传染性法氏囊病病毒VP2全基因引物，并在上游引物5'端加入保护性碱基及BamH I酶切位点，在下游引物的5'端加入保护性碱基和Xho I酶切位点，引物序列为Primer I 5/ -GCG TCG ACA TGA CAA ACC TGC AAG ATC - 3'Primer 2 5/ -CCC TCG AGT TAT CCT TAT GGC CCG GAT T -3'取200 μ 用临床分离的疑似IBDV的病料感染的鸡胚接种尿囊膜悬液上清液，按RNAisoReagent说明书所述方法提取病毒RNA,按反转录试剂盒使用说明书进行反转录合成cDNA，进行PCR扩增，扩增体系为(50 μ ):10XPCR Buffer δμΙ, ΝΤΡ (IOmM each) μ ,上、下游引物(IOmM)各 μ ，cDNA 3 μ , 25mM MgCl2 4 μ , Taq酶(5υ/μ1 ) μ1，(ΗΗ2034μ1 ;PCR 反应参数95 °C 5min，95°C lmin，58°C 2min，72°C 2min，35 个循环，72 °CIOmin。得到一个1300bp左右的片段，切胶回收该片段，与pMD-18T载体连接。PCR回收片段 6μ1，Τ 载体 2μ1 (稀释 10 倍后)，T4 DNA 连接酶 μ1，Τ4 buffer 2. 5μ1，水13. 5μ1，总计25μ1。16°C过夜连接，取20 μ 连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，挑选10个白色菌落培养，提取质粒鉴定正确的选取3个测序，结果3个质粒的测序结果都一致，证明获得的核苷酸片段在扩增的过程中没有产生错误，其核苷酸序列为SEQ ID Ν0:2，翻译的氨基酸序列为 SEQ ID NO:1。将该核苷酸序列在NCBI上Blast比对，有十几个碱基发生了点突变，表明该毒株为一株新的流行毒株。这是由于VP2蛋白是主要宿主保护性抗原，经常发生突变而导致抗原性发生差异。VP2重组蛋白的表达将鉴定正确的上述一个质粒用BamH I和Xho I双酶切回收基因片段，与用这两个酶切的pET-28a载体连接，转化感受态大肠杆菌JM109，提取质粒鉴定正确后转化感受体的BL21 (DE3)，挑取单菌落，转接5mlLB小管培养基，37°C振荡培养3 4小时至0D600为O. 6时，加入终浓度为O. 8mM的IPTG诱导4飞小时，SDS-PAGE电泳结果证实为分泌表达。将表达菌用5倍菌体湿重PBS重悬，高压匀浆破碎细菌，离心取上清，做琼脂免疫扩散试验，结果琼扩效价不低于1:64。VP2蛋白的纯化用镍柱纯化，200mM的咪唑洗脱，洗脱液用PBS透析过夜。所得透析液即为纯化的蛋白，可用于制苗。VP2亚单位疫苗的制备取注射用白油94份、司本-80 6份，混合后加入硬脂酸铝2份加热溶化，116°C灭菌30分钟，做为制苗用油相；加入灭菌的吐温-80 4份，然后加入上述制备的VP2重组蛋白 发酵提取液96份，充分振摇，使吐温-80完全溶解，做为制苗用水相；取油相3份放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相I份，加完后再以10000r/min搅拌2 5分钟，在终止搅拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最终浓度为O. 01 %。VP2亚单位疫苗的免疫效果将20只SPF鸡随机分为两组，每组10只，其中一组在21日龄时以O. 3ml/只的剂量皮下注射VP2亚单位疫苗，免疫21日后连同不免疫对照组每只经点眼途径接种100BID鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85株毒液，攻毒后每天观察鸡只的临床表现及死亡情况，记录发病和死亡鸡数，剖检观察死亡鸡法氏囊等病变，72 96小时扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病理变化。结果不免疫对照组8只鸡发病，而免疫组鸡只无发病。上述结果证明本发明制备的VP2亚单位疫苗具有很好的免疫原性。五、四联疫苗的制备取注射用白油94份、司本-80 6份混合后加入硬脂酸铝2份，加热溶化，116°C灭菌30分钟做为制苗用油相；将上述制备的灭活新城疫病毒液、灭活的传支病毒液、禽流管病毒液和VP2重组蛋白发酵提取液按照1:1:1:2的比例混合均匀制成抗原液；取混和均匀的抗原液96份，再取灭菌的吐温-80 4份，完全溶解吐温-80做为制苗用的水相；再取油相3份放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相I份，加完后再以IOOOOr/min搅拌2 5分钟，在终止搅拌前加入I %硫柳汞溶液，使其最终浓度为O. 01 %，完成四联疫苗的制备。对于四联疫苗中灭活新城疫病毒液、灭活的传支病毒液、灭活的禽流感病毒液和VP2重组蛋白发酵提取液的比例，本发明并不做特别的限定，只要制备的四联疫苗能够有效的预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、禽流感和鸡传染性法氏囊病即可。四联疫苗的使用效果将50只21日龄SPF鸡随机分为6组，每组10只，其中两组皮下注射免疫四联疫苗O. 3ml，免疫后21日采血分离血清，测定禽流感HI效价，取一组免疫鸡连同不免疫的对照用新城疫北京株攻毒，另一组免疫鸡连同另一组不免疫的对照用鸡传染性法氏囊病病毒攻毒，最后一组不攻毒，结果免疫组20只鸡的血清HI抗体效价的几何平均数为1:128，高于规程规定的1:90. 5;免疫组中有一只出现轻微的法氏囊症状，其余均无异常；而新城疫攻毒对照组10/10发病死亡，鸡传染性法氏囊病病毒攻毒对照组8/10发病。将10只21日龄SPF鸡个点眼接种I羽份的鸡传染性支气管炎活疫苗(H120)在负压隔离器里饲养观察，另取5只不免疫做对照。免疫后21日分别采血，分离血清测HI抗体效价，同时肌肉注射四联苗O. 5ml。加强免疫后28日分别采血测HI抗体效价，结果二免 的抗体效价几何平均数是首免的3. 6倍，而未免疫对照组为1:4，表明该四联疫苗传支部分是有效的。
权利要求
1.一种四联疫苗，包含有序列为SEQ ID NO :1的鸡传染性法氏囊病VP2蛋白和新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒。
2.如权利要求1所述的四联疫苗，其特征在于所述的新城疫病毒为新城疫病毒Clone30o
3.如权利要求1所述的四联疫苗，其特征在于所述的鸡传染性支气管炎病毒为鸡传染性支气管炎病毒M41。
4.如权利要求1所述的四联疫苗，其特征在于所述的禽流感病毒为H9亚型NJ02株。
5.权利要求1所述的四联疫苗的制备方法，是将新城疫病毒接种鸡胚后，收获胚液加入甲醛灭活；将传染性支气管炎病毒接种鸡胚后，收获胚液加入甲醛灭活；将禽流感病毒接种鸡胚后，收获胚液加入甲醛灭活；然后将新城疫病毒胚液、传染性支气管炎病毒胚液、禽流感病毒胚液和鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白混合后，加入疫苗佐剂乳化制成的。
6.权利要求1所述的四联疫苗在预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、禽流感和鸡传染性法氏囊病中的应用。
全文摘要
本发明的目的是制备一种可以同时预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、禽流感和鸡传染性法氏囊病特别是超强毒感染的疫苗，包含有序列为SEQ ID NO1的鸡传染性法氏囊病VP2蛋白和新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽流感病毒。本发明四联疫苗免疫21日龄的鸡，可同时预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、禽流感和鸡传染性法氏囊病，免疫效果与鸡新城疫单苗、鸡传染性支气管炎灭活疫苗、禽流感灭活疫苗及鸡传染性法氏囊病单苗效果相似，达到了减少免疫次数，降低应激的目的。
文档编号A61K39/145GK103007271SQ20121050663
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者王雷, 凌红丽, 于春梅, 吴晓燕 申请人:青岛康地恩药业股份有限公司, 青岛宝依特生物制药有限公司