专利名称：低hdl血症改善剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及到以半胱氨酸蛋白酶抑制剂为有效成分的低HDL血症改善剂和由该低HDL血症改善剂构成的动脉硬化预防和治疗剂。
背景技术：
HDL(high-density lipoprotein；高密度脂蛋白)主要在肝脏和小肠上皮细胞合成、分泌的。刚分泌的HDL是以脱辅蛋白A-I(也称之为apoAI)和磷脂为主要成分的圆盘状粒子，也称之为原始HDL。该HDL在血中接受来自末梢细胞的细胞膜的、或其他脂蛋白水解过程中生成的游离胆固醇，通过LCAT(lecithin cholesterol acyltransferase，卵磷脂胆固醇酰基转移酶)的作用，一边以胆固醇酯保持在疏水性中心部，一边向球状HDL成熟。
在于血液中获取来自末梢组织的多余的胆固醇，将它转运到肝脏的称为“胆固醇逆转运系统”的脂代谢中，HDL对极其重要的生理功能也起着主要的作用，人们认为这样的胆固醇逆转输送系统对动脉硬化有预防作用。
除了上述生物化学知识外，有关血液中胆固醇浓度和动脉硬化的关系从到目前为止多次实施的免疫学调查中，确认HDL胆固醇浓度越低，动脉硬化的发病频率越高，可以说改善低HDL血症从动脉硬化的预防和治疗方面看是非常重要的。
现在，血中HDL量是以临床上可容易测定的HDL组分的胆固醇(以下表示为HDL胆固醇)的浓度作为指标测定的。就日本人来说，通常当血中HDL胆固醇值低于40mg/dl时，诊断为“低HDL血症”。
低HDL血症在以动脉硬化为主，以及高脂血症、脑梗塞、肥胖、糖尿病等多种疾病中经常发现外，在以丹吉尔(Tangier)病为首的各种各样的遗传疾病中也可看到。
到目前为止，遗传病出现的低HDL血症治疗困难多，而就在动脉硬化、高脂血症、脑梗塞、肥胖、糖尿病等疾病中出现的低HDL血症来说，针对HDL本身的有用的低HDL血症改善剂也没有看到，期待着它的出现。
另外就有关与在上述肝脏和小肠上皮细胞合成、分泌的HDL不同的脱辅脂蛋白为成分的HDL来说也获得了有兴趣的知识。
即，在脑的星状细胞中合成、分泌的HDL以脱辅脂蛋白质E(也称之为apoE)和磷脂为主要成分，确认apoE参与中枢神经系统的损伤修复，在apoE存在下，通过脑星状细胞损伤修复作用，可以使阿耳茨海默病等、与神经障碍有关的疾病的发展推迟[Schiefermeier等，Stroke，31(9)，2068-2073(2000)]。因此，使在脑的星状细胞中合成、分泌的apoE-HDL增加在有关神经障碍或中枢神经系统的损伤的疾病的预防和治疗上非常重要。
另外，最近，Bodzioch等[Nat.Genet.，22，347-351(1999)]、Brooks-wilson等人[Nat.Genet.，22，336-345(1999)]以及Rust等人[Nat、Genet.，22，347-351(1999)]鉴定ABCA1(ATP-binding cassettetransport 1)为表现出HDL显著低值的丹吉尔病的原因基因，低HDL血症和ABCA1基因的关系引起了人们的注目。
ABCA1是主要存在于以肝脏、小肠、胎盘、肾上腺为首的各种脏器的细胞的细胞膜中的蛋白质，到目前为止人们一直认为它参与氨基酸、维生素、糖等物质的膜转运[Annu.Rev.Cell，Biol，8，67-113(1992)]。
按照上述最近的见解，有报道说在丹吉尔病患者中由于在ABCA1基因存在变异，所以看不到脂代谢需要的ABCA1的表达，胆固醇向细胞外排泄被阻碍，HDL消失。
除了上述见解外，Richard等人[J.Clin.Invest.，104，R25-R31(1999)]和Von Bckardstein等人[The FASBB J.，15，1555-1561(2001)]发现ABCA1基因的导入促进HDL的新生反应，现正在进行用基因工程技术使体内的ABCA1的表达量增加，提高或调节HDL胆固醇的浓度的尝试。
例如在WO00/78971和WO00/78972中公开了通过直接将ABCA1多肽导入宿主细胞，提高ABCA1的表达量和活性，用于谋求胆固醇流出和HDL浓度上升的技术。
如上所述，改善低HDL血症从动脉硬化的预防和治疗方面看是非常重要的，期待着针对HDL的有用的低HDL血症改善剂的出现，根据最近得到的有关丹吉尔病的资料，进行了使ABCA1的表达量增加，提高或调节HDL胆固醇浓度的尝试。然而，这些尝试无论哪一种都是使用基因工程技术的产物，即使是对遗传疾病的治疗是有效的，但对于与该遗传疾病相比占绝大多数的动脉硬化、高脂血症、脑梗塞、肥胖、糖尿病等疾病中出现的低HDL血症还不能成为有用的改善剂。
由于这样的状况，人们期待着不需要基因工程技术，而能针对HDL的有用的低HDL血症改善剂的出现。

发明内容
因此，本发明人等为了发现不需要基因工程技术、而且能针对HDL的有用的低HDL血症改善剂，使用以ABCA1的表达量上升为指标的试验体系，就各种各样物质进行了深入研究，结果发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以使ABCA1的表达量大幅度而且持续上升，进一步深入研究完成了本发明。
本发明提供1)一种以半胱氨酸蛋白酶抑制剂为有效成分的低HDL血症改善剂。
2)根据1)所述的低HDL血症改善剂，半胱氨酸蛋白酶抑制剂来自天然物或非天然物。
3)根据上述2)所述的低HDL血症改善剂，来自天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂源于微生物、植物或动物。
4)根据上述3)所述的低HDL血症改善剂，源于微生物、植物或动物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂是从亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶以及E-64中选出来的。
5)根据上述2)所述的低HDL血症改善剂，来自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂不是来源于微生物、植物或动物中的任一种，而是合成的物质。
6)根据上述5)所述的低HDL血症改善剂，来自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂是ALLN或N-乙酰基leu-leu-蛋氨醛(methioninal)。
7)一种由上述1)～6)的任一项所述的低HDL血症改善剂构成的动脉硬化预防和治疗剂；以及8)使用THP-1细胞，以ABCA1的表达为指标筛选具有促进HDL新生反应作用的物质的方法。
另一方面，本发明还提供9)该病症或疾病的预防和/或治疗法，其特征是将有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制剂投给有低HDL血症或动脉硬化症危险因素的动物，以及10)半胱氨酸蛋白酶抑制剂的用途，将有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制剂与医药上容许的载体配合后用于制造低HDL血症改善剂或由低HDL血症改善剂构成的动脉硬化预防和治疗剂。
本发明的其他目的、特征、优点以及具有的观点通过以下所述对本领域技术人员都会明白的。但是，包括以下所述以及具体的实施例等叙述在内的本说明书的记载给出了本发明的优选方式，但希望理解为只是为了说明给出的例子。在本说明书公开的本发明的意图和范围内，做出各种的变化和/或改变(或修饰)通过以下所述以及本说明书的其他部分的知识对本领域技术人员应当容易明白。在本说明书中引用的所有专利文献以及参考文献应当理解为是为了说明的目的而引用的，这些文献作为本说明书的一部分，其内容也应该解释为包括在本说明书的内容中。
附图的简单说明

图1是表示试验例1结果的图。
图2是表示试验例2结果的图。
图3是表示试验例3结果的图。
具体实施例方式
在本发明中提供以半胱氨酸蛋白酶抑制剂为有效成分的低HDL血症改善剂和由该低HDL血症改善剂构成的动脉硬化预防和治疗剂，以及该疾病的预防和治疗方法。
本说明书中，所谓“半胱氨酸蛋白酶抑制剂”是对SH基为活性中心存在的蛋白酶半胱氨酸蛋白酶[生物化学词典、第3版、(株)东京化学同人、637(1998)]表现出抑制作用的物质，无论是来自天然物还是来自非天然物都可以。
所谓来自天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂是源于微生物、植物或动物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，可以说是在微生物、植物或动物的组织生成、分离出的物质。上述源于微生物、植物或动物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂包括亮抑蛋白酶肽[生物化学词典、第3版、(株)东京化学同人、1531(1998)]、抗蛋白酶[生物化学词典、第3版、(株)东京化学同人、110(1998)]以及E-64[L-反-环氧琥珀酰-亮氨酰酰氨-(4-胍基)丁烷；生物化学词典、第3版、(株)东京化学同人、150(1998)]等，另外还包括特开平10-77276号公开的源于微生物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂和特开平7-48340号引用的源于微生物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂等。其中优选亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶以及E-64。
上述所谓来自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂不是源于微生物、植物及动物的任一种，而是合成的物质。上述源于非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂包括例如ALLN[N-乙酰基leu-leu-norleucinal；J.EnzymeInhibition，3，195(1990)]和N-乙酰基leu-leu-蛋氨醛[J.EnzymeInhibition，3，195(1990)]等，此外还包括以下给出的文献和专利公报公开的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。其中，优选ALLN和N-乙酰基leu-leu-蛋氨醛。
Biochemical Biophysical Research Communications，取157，1117(1988)，J.Enzyme Inhibition，3，195(1990)、特开平7-48340号、特开平8-151355号、特开平8-325282号、特开平9-165360号、特开平9-169752号、特开平9-295996号、特开平10-147564号、特开平10-147566号、特开平11-1491号、特开平11-171881号、特开2001-139534号、特开2001-233847号、特表平11-507912号、特表2000-510447号、特表2001-505889号、特表2001-506596号、特表2001-506614号、WO96/25408、WO97/03060、WO98/47887、WO98/01133、WO98/04539。
上述半胱氨酸蛋白酶抑制剂无论哪一种都是已知物质，可以使用按照上述文献和专利公报中公开的方法等分离、合成的物质或市售品，优选使用作为医药品具有可耐受品质和稳定性级别的物质。
作为该半胱氨酸蛋白酶抑制剂包括含有亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶、ALLN和N-乙酰基leu-leu-蛋氨醛等，可以举出例如含有BiochemicalBiophysical Research Communications，157，1117(1988)、J.EnzymeInhibition，3，195(1990)等给出的化学结构骨架的肽基醛衍生物，例如含有特开平7-48340号、特开平10-147564号、特开平10-147566号、特开2001-233847号等给出的化学结构骨架的磺酰胺化肽基醛衍生物，例如含有E-64、特开平8-325282号、特开平10-77276号、特开平10-147566号、WO97/03060、WO98/47887等给出的化学结构骨架的环氧琥珀酰胺衍生物，例如含有特开平9-169752号、特开平11-171881号、WO96/25408、WO98/04539等给出的化学结构骨架的至少含有一个肽键的含氧杂环衍生物，含有特开平9-165360号、特开平11-1491号、特开平9-295996号等给出的化学结构骨架的肽类，例如含有特开平8-151355号等给出的化学结构骨架的酰基氨基醛衍生物，例如含有特开2001-139534号等给出的化学结构骨架的缬氨酸衍生物，例如含有特表平11-507912号等中给出的化学结构骨架的α-(1，3-二羰基烯醇基醚)甲基酮衍生物，例如含有特表2000-510447号等中给出的化学结构骨架的4-氧杂-1-氮杂双环[3，2，0]庚烷衍生物，例如含有特表2001-505889号、特表2001-5065967号等中给出的化学结构骨架的苯(甲)酰胺醛衍生物，例如含有特表2001-506614号等中给出的化学结构骨架的酮苯(甲)酰胺衍生物，例如含有WO98/01133等中给出的化学结构骨架的脯氨酸衍生物等，或它们的改变体和修饰体等。
上述所谓低HDL血症改善剂是对于基于临床上诊断基准的低HDL血症使血中HDL胆固醇浓度上升，改善低HDL血症的药剂。通常当日本人血中HDL胆固醇值低于40mg/dl时，称之为低HDL血症，但也包括变更该诊断基准时，基于变更的诊断基准的低HDL血症。
低HDL血症在丹吉尔病等遗传病和动脉硬化、高脂血症、脑梗塞、肥胖、糖尿病、甲状腺功能异常、肝硬变、骨髓瘤、慢性肾衰竭、慢性炎性肠道疾病(例如，克罗恩氏病(节段性回肠炎)、溃疡性大肠炎)等疾病中可看到，本发明的低HDL血症改善剂除了可以在丹吉尔病等ABCA1在生物体内不能正常合成的遗传病使用外，也可以在上述疾病中的任一种场合的低HDL血症中使用。
另外，本发明的低HDL血症改善剂就象后面试验例表明的那样，可以表现出很好的促进HDL新生反应作用，使血中HDL增加。血中HDL在如上所述对动脉硬化起到预防作用的胆固醇逆转运体系中起到主要的作用，具有增加血中HDL作用的本发明的低HDL血症改善剂也可以用作动脉硬化的预防和治疗剂。
就是说，出现低HDL血症时，由于HDL的减少，胆固醇逆转运体系不能充分发挥功能，蓄积在血管壁的胆固醇难于转运到血管外，所以促进动脉硬化。本发明的低HDL血症改善剂可以改善这样的状态，可用于动脉硬化的预防和治疗。
另外，本发明的低HDL血症改善剂即使在脑中，通过使apoE-HDL浓度上升，促进中枢神经系统损伤修复作用，也可以用作与中枢神经系统损伤有关的疾病(例如，阿耳茨海默病)的预防和治疗剂。
本发明也提供使用THP-1细胞以ABCA1的表达为指标筛选具有促进HDL新生反应作用的物质的方法。
就是说，通过向对THP-1细胞进行培养和分化得到的巨噬细胞中添加筛选对象物质，测定细胞内表达的ABCA1的量，可以发现具有促进HDL新生反应作用的物质。筛选对象物质没有特别限定，无论来自天然物的还是来自非天然物的都可以。另外ABCA1表达量的测定方法可以是一般的基因工程手法，例如可以采用下面叙述的实验例1或2给出的手法。
本发明的低HDL血症改善剂以及动脉硬化预防和治疗剂可以单独给药，优选是以加入了药剂学上容许的添加物后的制剂形式给药。作为给药途径，可以采用口服和注射途径。在上述制剂中，无论通过哪一种途径给药，都可以适当使用从众所周知的制剂添加物中选出来的成分(以下也称为“制剂成分”)。具体的众所周知的制剂添加物如可以从(1)医药品添加物手册、丸善(株)、(1989)，(2)医药品添加物事典、第1版、(株)药事日报社(1984)，(3)医药品添加物事典追补、第1版、(株)药事日报社(1995)，和(4)药剂学、改订第5版、(株)南江堂(1997)记载的成分中按照给药途径和制剂用途适宜选择。
例如，当口服给药时，作为上述添加物只要是作为可以构成口服剂的制剂成分能够达到本发明的目的的添加物无论什么样的都可以，通常可以选择赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂等众所周知的制剂成分。作为具体的口服剂，如片剂、胶囊、颗粒剂、细粒剂、散剂、糖浆剂等。在该口服剂中也包括使用众所周知的制剂成分，对作为有效成分的半胱氨酸蛋白酶抑制剂在体内的释放进行控制的制剂(例如速释性制剂、缓释性制剂)。
另外当注射给药时，作为添加物可以使用可以构成水性注射剂或非水性注射剂的制剂成分，通常可以使用溶解剂、溶解助剂、混悬剂、缓冲剂、稳定剂、保存剂等众所周知的制剂成分，也可以是构成用于给药时溶解或混悬后使用的粉末注射剂的众所周知的制剂成分。作为水性注射剂的制剂成分；如注射用蒸馏水、等渗的灭菌水的盐溶液(含有磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或含有这样盐的混合物)等。
本发明的低HDL血症改善剂以及动脉硬化预防和治疗剂的给药量由于给药的患者的年龄、体重、低HDL血症或动脉硬化的症状、有无合并症等而有所不同，可以进行适当调整，通常口服给药时，为1mg～3,000mg/日左右，或在注射给药时，为0.1mg～1,000mg/日左右。
鉴于上述情况，也可理解为本发明提供该病症或疾病的预防和/或治疗法，其特征是将有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制剂投给有低HDL血症或动脉硬化症危险因素的动物，另外还提供将有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制剂与医药上容许的载体配合后用于制造低HDL血症改善剂或由低HDL血症改善剂构成的动脉硬化预防和治疗剂的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的用途。而且，这些方法和用途可以根据上面叙述实施各个具体的方式。
实施例等以下，叙述实验例和制剂例，进一步对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于这些例子。所有的例子等除了另外详细叙述以外，都是使用标准的技术实施的，或可以实施的例子，这些对本领域技术人员来说是众所周知的惯例。
试验例1 ALLN引起的增加ABCA1表达的作用<试验法>将THP-1细胞(人白血病细胞；American Type CultureCollection)在PMA(phorbol myristate acetate(佛波醇肉豆蔻酸酯醋酸酯)；和光纯药工业(株)制)存在下使用10％FBS-RPMI1640培养基(岩城硝子(株)制)72小时培养分化为巨噬细胞。将培养基换成添加了50μM ALLN(Sigma公司制)的0.2％BSA-RPMI1640(岩城硝子(株)制)，按照下述方法，随时解析细胞内ABCA1的表达量。
ALLN处理细胞和在没有添加ALLN的培养基中培养的对照细胞于5mM的Tris-HCl(pH8.5)中进行低渗破碎后，经离心(650g、5分钟)，使核成分沉淀。对上清于105,000g离心30分钟，回收全部膜成分。将全部膜成分溶解于0.9M尿素、0.2％triton X-100(和光纯药工业(株)制)、0.1％二硫代苏糖醇溶液(和光纯药工业(株)制)后，加入4/1量的10％十二烷基硫酸锂溶液(和光纯药工业(株)制)，使用10％SDS-7％聚丙烯酰胺凝胶(和光纯药工业(株)制)进行电泳分离。将分离的蛋白固定和转移到PVDF膜(Bio-Rad公司制)上后，用使用了抗人ABCA1兔抗体(利用通常的手法自己纯化)的免疫印记技术对ABCA1蛋白的表达量进行解析，对得到的该表达量的带的浓度和大小用Scion Image(图像解析软件Scion公司制)读出进行数值化。
<结果>在添加了ALLN的培养基中培养的THP-1细胞与对照细胞相比，可以确认细胞内的ABCA1的表达明显增加。即，在图1中给出了一直到添加ALLN后4小时的ABCA1表达增加作用，该增加作用从添加ALLN 15分钟后就可看到，其强度将对照细胞(添加ALLN后的时间为0时间的细胞)ABCA1表达量作为100时，可以达到168～191。另外ABCA1表达增加作用即使在添加ALLN后24小时也可看到。
试验例2亮抑蛋白酶肽引起的ABCA1表达上升的作用用与试验例1同样的方法，将THP-1细胞于代替ALLN而添加亮抑蛋白酶肽的培养基中培养，与没有经亮抑蛋白酶肽处理的对照细胞进行比较。结果，亮抑蛋白酶肽处理细胞与对照细胞相比，可以确认细胞内的ABCA1的表达明显增加。图2中给出了对照细胞(添加亮抑蛋白酶肽后的时间为0时间的细胞)和添加亮抑蛋白酶肽后7小时的ABCA1表达相对量。该亮抑蛋白酶肽引起的ABCA1增加作用即使在向培养基添加亮抑蛋白酶肽后24小时也可看到。
试验例3 ALLN引起的HDL新生反应促进作用<试验法>利用与Arakawa等人方法[J.Lipod Res.，41，1952-1962(2000)同样的方法，使用THP-1细胞对基于依赖于apoA1的HDL新生反应而转移到培养基中的胆固醇和磷脂量进行解析，对添加了ALLN的细胞和没有添加的细胞进行比较。
<结果>添加了apoA1和ALLN的细胞中，与没有添加apoA1和ALLN的细胞(对照组)和只添加apoA1的细胞(添加apoA1组)相比，确认依赖于apoA1的胆固醇和磷脂转运出的量增加，即可看到HDL新生反应促进作用。图3给出了该结果。
如上所述，通过上述试验确认本发明的低HDL血症改善剂不利用基因工程技术而表现出ABCA1表达增加作用，促进HDL新生反应。
上述本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂引起的ABCA1表达增加作用在将半胱氨酸蛋白酶抑制剂添加到细胞培养基后，很快就可以看到，表明这并不是由于使用上述以往技术中的基因工程技术时那样的ABCA1在细胞内合成的亢进得到的结果，暗示了是由于ABCA1的代谢抑制这一全新的机理造成的结果。
制剂例1本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂100mg、乳糖100mg、玉米淀粉28mg、硬脂酸镁2mg有关上述处方根据日本药局方XIII的制剂总则记载的众所周知方法可以得到胶囊剂。
制剂例2 将本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂50mg溶解于由含有适量氯化钠的注射用蒸馏水10ml配制的等渗水溶液，充填到安瓿瓶，密封后，灭菌，得到注射剂。
如上所述，以半胱氨酸蛋白酶抑制剂为有效成分的本发明的药剂不用上述以往技术所见到的基因工程技术，通过与以往技术完全不同的机理可以使ABCA1的表达量增加，使血中HDL量增加，可以用作动脉硬化等多种疾病中出现频率高的低HDL血症的改善剂。另外本发明的低HDL血症改善剂由于其低HDL血症改善作用，也可以用作动脉硬化预防和治疗剂。另外通过将半胱氨酸蛋白酶抑制剂给予具有患有低HDL血症或患有动脉硬化的危险因素的动物等，可以进行疾病的预防和治疗。
本发明除了上述的说明和实施例中特别记述以外的可以实行是很清楚的。鉴于上述示范，本发明的很多的改变和变形是可能的，因此，这些也是本申请附加的权利范围内的内容。
权利要求
1.以半胱氨酸蛋白酶抑制剂为有效成分的低HDL血症改善剂。
2.根据权利要求1所述的低HDL血症改善剂，其中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂来自天然物或非天然物。
3.根据权利要求2所述的低HDL血症改善剂，其中，来自天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂是微生物、植物或动物来源的。
4.根据权利要求3所述的低HDL血症改善剂，其中，来源于微生物、植物或动物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂是从亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶以及E-64中选出来的。
5.根据权利要求2所述的低HDL血症改善剂，来自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂不是来源于微生物、植物或动物中的任一种，而是合成的物质。
6.根据权利要求5所述的低HDL血症改善剂，其中，来自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂是ALLN或N-乙酰leu-leu-蛋氨醛。
7.由权利要求1～6的任一项所述的低HDL血症改善剂构成的动脉硬化预防和治疗剂。
8.具有促进HDL新生反应作用的物质的筛选方法，使用THP-1细胞、以ABCA1的表达为指标。
全文摘要
本发明涉及低HDL血症改善剂。提供不需要基因工程技术、能针对HDL有用的低HDL血症改善剂以及动脉硬化预防和治疗剂，和该病症的预防和治疗法。提供通过将半胱氨酸蛋白酶抑制剂作为有效成分，不用基因工程技术而使ABCA1的表达量增加，使血中HDL增加，可在临床上利用的低HDL血症改善剂以及动脉硬化预防和治疗剂。
文档编号A61K38/56GK1568199SQ02820238
公开日2005年1月19日 申请日期2002年10月11日 优先权日2001年10月12日
发明者横山信治, 荒川礼二郎 申请人:格勒兰制药株式会社