专利名称：新的合成肽，含有该肽的肺表面活化剂以及治疗呼吸窘迫综合症的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的合成肽。更具体地说，本发明涉及通过与一种类脂混合物复合而显示有潜在表面活性作用的合成肽。本发明还涉及生产所述合成肽的中间体，生产这种合成肽的方法，含有该肽和一种类脂混合物的肺表面活化剂以及含有所述肺表面活化剂作为活性成分的用于治疗呼吸窘迫综合症的药物。
背景技术：
呼吸窘迫综合症是一种由于失去了肺表面活化剂而使肺泡表面的表面活性降低的疾病。这种疾病导致肺泡萎陷，继而导致严重的呼吸紊乱。这种综合症经常见于发育不全的新生婴儿并且出现较高的致死率。已知肺表面活化剂组合物十分有效地抵抗新生儿呼吸窘迫综合症。
由各种原因引起的血氧过少也可使成年人受折磨，并且用胸腔X-射线照相术在两叶肺中看到类似扩散性簇镜片的阴影(diffuse ground-glass-like shadow)的许多例子以及尽管用呼吸器等控制呼吸仍呼吸衰竭。Ueda和其同事(在Hiromoto Yasuda，“Biosurfactants.Chapter 3.Medical Practices Using Surfactants.Section 1.Clinical Application of Surfactants.V.Aspiration Pneumonia and Surfactants.″P.184，1990，Science Forum，Co.Ltd)已经报道两种成人肺炎病例(即下列病例①硝酸盐气体吸入性肺炎和②源于脑瘤的复发性吸入性肺炎，这种肺炎引起血氧过少并且导致正常状态变坏和呼吸衰竭)，对于这两种病例，通过向呼吸道注射肺表面活化剂而获得显著改善和挽救生命。在心脏手术之后由于手术期间呼吸停止而可能出现手术后呼吸衰竭。还已经有人报道肺表面活化剂对这种呼吸衰竭的作用(Shuichi Nosaka et al，Journal of Japanese MedicalSociety for Biological Interface，Vol.22，P.66，1991)。
因此从体外和借助于呼吸道施用肺表面活化剂的替代治疗法显示对呼吸窘迫综合症有显著的治疗效果。
最近，发现4种类型的脱辅基蛋白质是极好的哺乳动物的肺表面活化剂。它们是亲水性的表面活化剂脱辅基蛋白质A和表面活化剂脱辅基蛋白质D，以及疏水性的表面活化剂脱辅基蛋白质B(下文将称为SP-B)以及表面活化剂脱辅基蛋白质C(下文中将称为SP-C)(Toyoaki Akino和YoshioKuroki，Respiration and Circulation，Vol.38，No.18.P.722，1990；Hiromoto Yasuda et al，BiosurfactantsChapter 2.Ihe Biochemistry of Surfactants-Surfactants and Apoproteins，P.131，1990，Science Forum，Co.Ltd.)。
来源于人肺的SP-C(序列号.1)由35个氨基酸组成，并且是富含缬氨酸的高度疏水脱辅基蛋白质，它有作为N-末端氨基酸的苯丙氨酸。分离自牛肺(序列号.2)，猪肺(序列号.3)，大鼠肺等的SP-C也由34-35个氨基酸组成并且虽然不同种之间N-末端氨基酸序列不同，但他们与人SP-C显示有非常高的同源性。
日本专利申请No.Hei-3-502095还指出具有作为SP-C结构一部分的下述的32氨基酸序列的合成肽(序列号.4)是显示高效表面活性的基本单位，还指明该肽和类脂的混合物可有效地治疗呼吸窘迫综合症，并且将该基本单位肽的表面活性和其他具有更短的氨基酸序列的合成肽的表面活性进行比较显示表面活性的丧失不是由于特定氨基酸的丧失引起的而是肽链长度降低的缘故。
以前，本发明的一部分发明人已经发现由一种合成肽(下文中称作为TP-C)，其结构是作为SP-C结构一部分，以及一种类脂构成的混合物可有效地治疗呼吸窘迫综合症，并且已经有关这个主题申请了一份专利(日本专利申请No.Hei-5-518188)。
就合成肽的生产而言，总的来说，随着肽的氨基酸序列延长在生产期间形成有缺陷肽的频率升高，分离和纯化变得困难，生产需要的时间增加，大批量地生产也变得困难等等。
从保持优良特性考虑，也经常可制备干粉组合物形式的肺表面活化剂组合物，在使用时将干粉组合物制作为生理盐水悬液给药。已经有人建议例如加入类似甘露醇的悬浮剂(日本专利公开No.Hei-1-60451)并且在-1至-10℃的原始冻干的方法可以改善肺表面活化剂的悬浮特性。但是，在实际操作中这些方法较复杂因此需要研制生产药剂的更简单方法。
通过将SP-C与一种类脂混合物(由胆碱磷酸甘油酯，一种酸性磷脂以及一种脂肪酸类似物组成)复合而制备的肺表面活化剂组合物(下文中称作为S-35)在生理盐水中具有十分低的可分散性，要将其制备成一种足够均匀而可用作组合物的悬浮液是十分困难的，其原因包括在肽中由半胱氨酸残基形成二硫桥键，从而使肽具高度内聚性和肺表面活化剂本身高度疏水性。
由于TP-C在一般性溶剂中溶解性较低，利用三氟乙酸(TFA)制备肺表面活化剂组合物是必要的。因此TP-C具有这样的问题，例如为除去尽可能多的TFA需要更多的浓缩和干燥时间，并且由于在肺表面活化剂组合物制备期间残留有TFA使肺表面活化剂悬浮液变得酸化。发明内容本发明人考虑到上述因素勤勉地研究合成肽并且已经达到了发明目的，即新的合成肽含有在N-末端具有亲水肽部分的特定序列以及在C-末端具主要由Leu和/或NIe组成的疏水性肽部分的下文中所述的氨基酸序列，该新合成肽易于分离和纯化，可以大批量地生产，在甲酸，TFA，三氟乙醇，二甲基亚砜(DMSO)，氯仿，氯仿-甲醇混合物，甲醇，2-氯乙醇和四氢呋喃中溶解性大，特别是与合成SP-C和TP-C相比，新合成肽具显著高的溶解性。本发明人还发现当于-20℃或更低采用普通冻干方法进行生产并且没有添加悬浮剂时，从本发明的合成肽和类脂混合物制备的肺表面活化剂与S-35相比或与仅由一种类脂混合物(由胆碱磷酸甘油酯，酸性磷脂以及脂肪酸类似物组成)组成的合成肺表面活化剂(下文中称作为“SF-3””，日本专利申请No.H-2-87685)相比或与含有结合有脂肪酸的一种由磷脂、中性类脂、总胆固醇、碳水化合物以及哺乳动物肺中存在的微量蛋白质组成的物质的一种物质(下文中称为“S-TA”；日本专利申请Sho-61-9924)相比具有很均匀的悬浮特性，并且这种肺表面活化剂还显示有相当于S-35，S-TA或由TP-C和类脂混合物组成的肺表面活化剂的强表面活性。
Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W(Xaa可能不存在或者可能代表Cys或Ser，Xbb代表His或Asn，Xcc代表Leu或Ile并且W代表疏水部分)。
本发明合成肽含有由下文中特定序列的N-末端描述的亲水肽部分以及具有主要由C-末端的Leu和/或Nle组成的疏水肽部分的一段肽组分，并且该本发明所述合成肽是当与一种类脂混合物复合时显示有强表面活性的合成肽。
Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg(Xaa可以不存在或者可以代表Cys或Ser，Xbb代表His或Asn以及Xcc代表Leu或Ile)。
尽管疏水肽部分是由如Leu，Nle，Ile，Val，Phe，Nva和Trp这样的疏水氨基酸组成的，但其主要是由12或更多以及优选的是12-20个Leu和/或Nle的分子组成。虽然从合成方便来考虑优选的是该疏水肽部分是由相同疏水氨基酸组成，但它也可以由Leu和Nle分子的合成序列组成或者在其序列内含有1-5个分子的Ile，Val，Nva，Trp和其它疏水氨基酸。
本发明的合成肽还包括在上面介绍的合成肽的N-末端和/或C-末端增加了氨基酸或肽的合成肽。被加到N-末端的氨基酸可能是Cys或者Ser。此外，可将具有Phe-Gly-Ile-Pro序列的肽加到N-末端。借助于一个具14-18个碳原子的脂肪酸并且优选的是棕榈酸可将上文介绍的合成肽中存在的巯基或羟基酰化，或者可以乙酰胺基甲基化。加到C-末端的肽可以具有Gly-Ala-Leu-Leu或者Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Gly-Leu序列。
此外，本发明的合成肽还包括含有肽基团的合成肽(除具有天然SP-C部分结构的肽外)，所述肽基团当与类脂混合物复合时显示出良好亲水性以及强大的表面活性，甚至于在其含有一个或多个氨基酸增加、除去和替代后也具有这种特性。
本发明的合成肽可以采用化学或遗传工程方法生产，但是就分离和纯化而言优选的是化学方法。
生产本发明合成肽的化学方法包括逐步延伸方法和片段缩合方法，涉及液相或固相合成方法如叠氨化物方法，酸性氯化物方法，酸酐方法，混合的酸酐方法，DCC方法，活化的酯方法(对-硝基苯酯方法，对-羟基琥珀酰亚胺酯方法，碳咪唑方法等)，氧化还原方法以及DCC-活化方法。
本发明还提供用于生产本发明合成肽的片段缩合方法，该方法中以具有被保护的N-末端和被保护的功能侧链的亲水肽基团作为生产的中间产物。
与逐步延伸方法相比，片段缩合方法提供了易于纯化的目的物质，更适于大量合成并且具有阻止由于不期望出现的错误而丧失的特性。通过采用液相或固相合成方法将疏水部分与具有被保护的N-末端和被保护的功能侧链的前面制备的亲水肽进行缩合可以生产本发明的合成肽。N-末端以及功能性侧链的保护性基团没有特别规定，只要是常规的肽合成方法中使用的保护性基团。可用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，2-氯苯氧基羰基(2-CLZ)或者t-丁氧羰基(Boc)基团作为末端氨基酸基团的保护性基团，可将Fmoc，Boc或者苄氧羰基(Z)或者对甲苯碳酰(Tos)基团用作为Lys的保护性基团，可将Trt，Fmoc，Boc，Dnp，Bom，Bzl或者Tos用作为His和Mtr的保护性基团，以Pmc，Mts或者Tos作为Arg的保护性基团。因此，可用作为生产本发明合成肽的中间产物的肽包括Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)，Fmoc-Pro-Val-Asn-Leu(Boc)-Arg(Mtr)和Fmoc-Pro-Val-Asn-Ile-Lys(Boc)-Arg(Mtr)。
通过将本发明的合成肽与由胆碱磷酸甘油酯，酸性磷脂和一种脂肪酸类似物组成的类脂混合物进行复合而生产肺表面活化剂(下文中称作为“本发明表面活化剂”)。
适当地规定组合物中每种组分所占比例，以便相对最终产物的总干重量而言每种组分的重量比为合成肽占0.1-5.0％(w/w)，胆碱磷酸甘油酯为50.6-80.5％(w/w)，酸性磷脂比例为4.5-37.6％(w/w)以及脂肪酸类似物占4.6-24.6％(w/w)。
适用于本发明的表面活化剂的胆碱磷酸甘油酯的例子包括1，2-二酰基甘油-(3)-磷酸胆碱如1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱(二棕榈酰磷脂酰胆碱)，1，2-二硬脂酰甘油-(3)-磷酸胆碱，1-棕榈酰-2-硬脂酰甘油-(3)-磷酸胆碱和1-硬脂酰-2-棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱等等；1-烷基-2-酰基甘油-(3)-磷酸胆碱如1-十六烷基-2-棕榈酰甘油(3)-磷酸胆碱和1-十八烷基-2-棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱等；以及1，2-二烷基甘油-(3)-磷酸胆碱例如1，2-二-十六烷基甘油-(3)-磷酸胆碱等等。虽然对于上述化合物存在基于甘油残基的第二位碳原子的光学异构体，但是对于本发明的表面活化剂可以使用D-，L-和DL-形式任一种。除了上面提到的单个胆碱磷酸甘油酯化合物以外，可以将由两个或多个带有酰基基团，优选的是两个饱和的酰基基团的含12-24个碳原子的不同1，2-二酰基甘油-(3)磷酸胆碱组成的混合物或者这种混合物与上面介绍的单个化合物组成的混合物用作为胆碱磷酸甘油酯。
合适的酸性磷脂的例子包括1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸(L-α-磷脂酸)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-L-丝氨酸(磷脂酰丝氨酸)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(磷脂酰甘油)以及1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-(1)-L-myo-肌醇(磷脂酰肌醇)。这些化合物的第一和第二位可以采用相同的酰基基团或者采用不同酰基基团替代。这里，具有12-24个碳原子的酰基基团是优选的。
合适的脂肪酸类似物的例子包括游离脂肪酸，脂肪酸的碱金属盐，脂肪酸烷基酯，脂肪酸甘油酯和脂酰胺以及由上述二种或多种类似物组成的混合物和脂肪醇以及脂肪胺。
在本发明说明书中，“脂肪酸类似物”包括上面介绍的脂肪醇和脂族胺。
可用肉豆蔻酸，棕榈酸或硬脂酸作为游离脂肪酸，但是棕榈酸是优选的。
可以用上面介绍的游离脂肪酸的钠盐，钾盐，镁盐和钙盐作为脂肪酸的碱金属盐，但是棕榈酸钠是优选的。可用具1-4个碳原子的低级烷基酯作为脂肪酸烷基酯，但棕榈酸乙酯是优选的。甘油一酯可用作为脂肪酸甘油酯，但是，单棕榈酸甘油酯是优选的。
具有14-18个碳原子的醇可用作为脂肪醇，但是十六烷醇是优选的。具有14-18个碳原子的胺可用作为脂族胺，但是十六烷胺是优选的。
上文中介绍的胆碱磷酸甘油酯，酸性磷脂以及脂肪酸类似物可以是从植物或动物中分离到的产物，也可使用半合成产物或合成的化学产品和可购买到的这样的产品。
通过在减压下干燥和固化由本发明的肽溶液和上面介绍的类脂混合物的混合物并将由此获得的残留物悬浮于合适的悬浮液体中然后冻干可生产本发明的表面活化剂。
可用于制备本发明的肽溶液的溶剂的例子包括甲酸，TFA，三氟乙醇，DMSO，氯仿-甲醇，氯仿，甲醇，2-氯乙醇和四氢呋喃。
可用于制备类脂混合物溶液的溶剂的例子包括氯仿和氯仿-甲醇[1∶2-5∶1(V/V)]。
悬浮液例子包括水和水-乙醇混合物[4∶1-20∶1(V/V)]，但是水-乙醇混合物是优选的。悬浮步骤执行5-60分钟并且优选的是在30-60℃，并且优选的是在40-50℃执行15-30分钟。
采用这种方法制备的本发明的表面活化剂不可避免地含有小量的残留水。但是，优选的是将表面活化剂干燥至相对于总重量而言残留水的重量比是5.0％(w/w)或更低。如果将表面活化剂干燥到该含量，即使使用水-乙醇混合物的情况下也不能检测到乙醇残留物。
利用用手振荡或变速混合器或超声波发生装置可将本发明的表面活化剂的干粉组合物均匀悬浮和分散于具有合适生理浓度的单价或二价金属盐，例如0.9％NaCl或1.5mM CaCl2的溶液或者含有所述盐的生理缓冲溶液中。
现在将描述由此产生的本发明表面活化剂的表面活性，悬浮特性和药物特性。
(1)表面活性①降低表面张力的作用根据Tanaka等人采用的方法(Journal of Japanese Medical Society for Biological Interface，Vol.13，No.2，P.87，1982)测定降低表面张力的作用。
将本发明的表面活化剂的悬浮液滴加到生理盐水(表面积为54.0cm2)中，从而每cm2中含有本发明表面活化剂为1.0-2.0μg。在2-5分钟内将所说表面积压缩和扩大到54.0-21.6cm2范围内，并且用Wilhelmy的表面天平(由Kyowa Interface Science Co.Ltd.制造)在37℃连续地检测表面张力。最大表面张力是24.7-34.1达因/cm以及最小表面张力是0.2-8.7达因/cm，表明本发明表面活化剂的降低表面张力的作用使生理盐水的表面张力降低。
采用相同方法检测SF-3的表面张力降低作用，结果产生最大表面张力为26.8-50.3达因/cm以及最小表面张力为1.0-13.5达因/cm。
在37℃时生理盐水本身的表面张力是70.5达因/cm。
②在气-液界面间的可扩散性将本发明的表面活化剂的悬浮液滴加到生理盐水的表面，使每cm2的生理盐水表面有0.8-1.5μg的表面活化剂，采用垂直平板方法从滴加悬浮液后时间点立即开始检测表面张力随时间的变化。检测温度是37℃。
达到平衡与时间相关，即表面张力从滴加样品之后即时开始到达到固定值花费的时间，该时间之后的值称为平衡表面张力。
本发明表面活化剂在30-60秒短时间内在气-液界面形成一薄层并且将表面张力降低到26.7-34.3达因/cm。
采用相同方法检测SF-3的气-液界面扩散作用，结果显示120秒之后表面张力是38.1-52.9达因/cm。
该结果表明本发明的表面活化剂迅速地扩散在气-液界面并且快速降低表面张力。
③吸附到气-液界面的能力制备在37℃时每ml含有0.2-1.0mg本发明表面活化剂的生理盐水悬浮液，并检测被悬浮的本发明的表面活化剂吸附到生理盐水气-液界面的速率。
根据King等人的方法(American Journal of Physiology，No.223，P.715，1972)检测吸附能力。
就是说，将该悬浮液注射到含有生理盐水的直径为5cm的特富龙罐的底部，然后用磁搅拌器进行搅拌。根据停止搅拌之后表面张力的变异测定吸附能力。
在停止搅拌之后30到100秒内本发明表面活化剂将表面张力降至28.3至36.8达因/cm之间，此后表面张力保持不变。
这一结果表明在悬浮条件下本发明的表面活化剂在30到100秒的时间内漂浮并吸附到气-液界面并形成具有强大表面活性的一薄层。
当以相同方式检测SF-3时，结果表明在150秒或更多的时间内恒量的表面张力达到42.2-58.3达因/cm。
这一结果表明SF-3的气-液界面吸附作用低于本发明的表面活化剂，并且本发明的表面活化剂具有强有力的促进表面吸附的能力。
(2)悬浮能力按照在日本实用新型公开号Hei-4-76965中指出的方法对肺表面活化剂的悬浮能力进行检测。
就是说，根据开始悬浮操作以后特定时间点的分散效率以及根据开始悬浮操作以后2分钟最大分散颗粒大小来评估悬浮能力。
分散效率检测按如下方法进行，将60mg的每一种肺表面活化剂分散到20ml的各个小试管中。然后向所述的每个小试管中加入2ml的生理盐水并将试管置于I waki KM Shaker-V-S型振荡器(由I waki Sangyo Co.Ltd制造)中，以270次/分钟的速率进行振荡。在振荡起始之后开头的2分钟期间每隔30秒，在振荡起始之后2分钟到4分钟内每隔1分钟以及在振荡起始之后4分钟之后每隔10分钟用磁玻璃肉眼观察每个样品的分散状态。
在各个特定的时间由二人，每人各评价10个样品对悬浮状况进行评价。如果在容器内没有小团块以及该组合物均匀地分散于生理盐水中而形成一种白色一致的悬浮液，则判定样品是悬浮的。
由每人在各个特定的时间点检测分散效率即完全悬浮的样品占样品总数(10bials)的百分数，结果以两人测得的平均值表示。
按如下方法对最大分散颗粒直径进行测量。将每种肺表面活化剂各60mg分散于20ml的试管中。然后向每个试管中加入20ml的生理盐水并在上面介绍的相同条件下连续振荡2分钟。然后用显微镜寻找悬浮液中最大颗粒，并用游标测径器测量而确定其直径。由此发现在2分钟内本发明的表面活化剂大多数被悬浮，并且它的最大颗粒直径是0.8mm或更低，表明其悬浮能力是好的。
(3)药理特性①急性毒性利用5周龄的ICR雄鼠和Wister大鼠对本发明的表面活化剂的急性毒性进行检测。对于雄鼠口服LD50和腹膜LD50分别为2.4-10.0克/千克和1.0-5.0克/千克，而对于大鼠分别为1.5-5.0克/千克以及1.5-2.5克/千克。
②亚急性毒性以每天300-600mg/kg的剂量将本发明的表面活化剂给成年Wister大鼠腹膜注射1个月。大鼠的重量没有变化，用裸眼观察组织学分析没有看到异常。
③维持肺泡体积的作用末成熟的兔胎儿在妊娠期27天时几乎没有产生肺表面活化剂并处于肺表面活化剂缺乏条件下。因此可将其用作为研究新生儿呼吸窘迫综合症动物模型。
利用5只妊娠期27天的兔胎儿，于37℃不同的气道压力下检测肺泡空间体积(下文中称为肺体积)。
在通过呼吸道供给本发明肺表面活化剂5分钟后切开胎儿的颈并用附在气管上的水测压计进行连续检测。用由2个独立通道启动的注射泵No.940(泵由Harvard Co.，USA制造)将气道压力提高到30cm H2O以便扩张肺泡。然后在以不同水压条件下测量肺体积时将气道压力降到0cm H2O以便使肺泡衰退。然后以每1kg体重的ml(ml/kg)数表示肺体积。
本发明的表面活化剂可通过将表面活化剂浓度为1.0-6.0％(w/v)的0.05-0.5ml生理盐水悬浮液直接注射到呼吸道中而完成给药。
在压力降到5cm H2O时肺体积表示残留的功能能力并且该体积越大，肺表面活化剂的活性越大。
作为对照，用生理盐水替代本发明表面活化剂来给药。对照组不成熟兔胎儿的肺体积(在5cm水时)是1-5ml/kg，表明肺泡几乎没有被扩张。
妊娠30天的足月的胎儿具有正常的肺表面活化剂含量。它们的肺体积(在5cm水)是35-53ml/kg，表明肺泡被适量地扩张并可执行正常呼吸。
在以SF-3给药时，未成熟胎儿的肺体积(在5cm H2O)是15-25ml/kg，表明肺泡扩张不足。
如果以本发明的表面活化剂给药，则肺体积(在5cm H2O)是39-55ml/kg，表明本发明的表面活化剂将末成熟胎儿的肺体积改善到正常水平。
如上所述，本发明的合成肽具有强有力地提高类脂混合物的表面活性的作用。因此，制备用于呼吸窘迫综合症的治疗剂是可行的，所述治疗剂具有来自本发明的表面活化剂的表面活性，悬浮能力以及药学特性，所述表面活化剂可由本发明的合成肽和一种类脂混合物组成。
还可用含有本发明表面活化剂作为活性成分的组合物治疗肺表面活化剂对其有治疗效果的其他疾病，包括手术后呼吸紊乱，哮喘，支气管炎，新生儿坏死肠炎，胃和十二指肠溃疡，由病毒和管道障碍引起的呼吸病和可用于防止输卵管粘连以及手术后器官粘连并作为祛痰剂。
由本发明提供的用于呼吸窘迫综合症治疗的治疗剂在儿童使用时每剂量含有50-1000mg本发明的表面活化剂而在成人使用时每剂量含有500-5000mg的本发明的表面活化剂。通过以1.0-10.0％(w/v)的浓度悬浮于水，生理盐水或生理上可接受的缓冲液等中可制备这些剂量。然后将治疗剂在出现呼吸紊乱之后72小时内通过分1-10次注射或喷雾剂呼吸道内而给药。也可以通过吸方法使用该组合物，换句话说作为粉剂使用没有悬浮。使用的剂量，方法和频率适当地根据患者症状和重复治疗次数而改变。
如果需要，本发明的治疗剂可含有类似于稳定剂，防腐剂，等离子剂，缓冲剂，悬浮剂，抗氧化剂和表面活化剂这样的药物辅剂或者类似的气管扩张剂、抗过敏剂、治癌剂、抗病毒剂、抗炎剂和抗真菌剂的药物。
所述剂型可适当地制成液体或粉末形式。可将本发明的治疗剂装填于密封容器如试管和安瓿管以及以无菌组合物状态保存。实现发明的最好方式参照下列实施例更详细地描述本发明。
(1)肽的生产在下文描述的实施例中，用快速原子轰击质谱法(FABMS)测量合成肽的分子量。所使用的质量分析仪是JMS--S102A(JEOL.Ltd.)以及以铯枪(10KeeV)作为离子源。实施例1按照“The Peptides″(GrossE.和Meinenhofe J.eds.，Barney G.和Merrifield R.authors，Vol.2，pp.1-284，Academic Press，New York，1980)描述的方法采用固相合成法在苯乙酰胺甲基(PAM)树脂表面合成以序列No.5表示的肽(肽A)。
将C-末端亮氨酸残基转化为t-丁氧羰基-亮氨酸(Boc-Leu)并借助于一个羟甲基苯乙酰胺甲基键结合到PAM树脂上。在键合到C-末端之后，将Boc-Leu-PAM树脂(0.7mol/g，0.35g)转移到肽合成仪(Model 990E，Beckman Instruments，Inc.)的反应容器内。然后采用对称酸酐方法在树脂的表面以N-末端方向加上已经过保护性处理的氨基酸，以便合成得到充分保护的肽-O-树脂。但是，在缩合精氨酸时，利用N，N-二环己基碳化二亚胺/羟基苯并三唑完成双偶合(Connie等人，Chem.Ber.，103，788-798(1970)。
所有氨基酸的N-末端氨基用Boc基团保护，并在反应中使用氨基酸之前用下列基团保护功能性侧链Arg-Tos(甲苯磺酰基)
Lys-2CLZ(2-氯苯氧羰基)Cys-4Me Bzl(4-甲基苯基)His-Tos(甲苯磺酰基)采用茚三酮方法kaiser检测方法证实这些缩合反应。在二氯甲烷中使得到充分保护的肽-O-树脂(155mg)吸胀5分钟。然后用含有1％(V/V)吲哚和0.1％(v/v)乙烷二硫醇的TFA除去N-α-Boc保护性基团。接着，通过在0℃用无水氟化氢(HF)(11ml)将脱保护的肽-O-树脂处理60分钟而从树脂上将肽切下，所述氟化氢中加入了p-甲酚(1ml)，p-巯基甲酚(0.2克)和DMSO(1ml)。
在0℃真空条件下蒸馏HF和DMSO。用冷二乙醚(15ml)将移走的肽和树脂洗涤三次，通过在冷TFA(5ml)中洗四次而提取移走的肽。将提取液立即过滤并加入冰冷水(150ml)以沉淀粗制肽。然后以1000xg及0℃将该粗制肽离心30分钟，并回收沉淀。用二乙醚(15ml)洗涤该沉淀。用二乙醚，乙酸乙酯和蒸馏水重复洗涤处理之后得到84mg肽A。
将该粗制肽溶于50％DMSO水溶液中并采用反相高效液相层析(HPLC)方法以及利用μ-Bondasphere和一个C8-300柱进行纯化以收集纯肽A。
利用含0.1％TFA的50％乙腈水溶液作为洗脱剂进行5分钟的洗脱。利用上面提及的洗脱剂和含0.1％TFA的80％乙腈水溶液形成的线性浓度梯度洗脱30分钟。在245nm(分光光度计，日本Spectroscopic Co.Ltd.Model870-UV)以及示差折光计(Shimadzu制造公司RID-6A型)监测洗脱液中存在的肽。
FABMS(M+H+)；3837.1(计算出的分子量；3835.9)实施例2采用固相方法以及利用多肽固相合成系统“Kokku-San”(商品名；Kokusan Chemical works Co.Ltd)，并且参照由E.Atherton和R.C.Sheppard在“Solid Phase Peptide Syntyesis-A Practical Approach”中(pp.25-189，牛津大学出版社，牛津)以及由Kenichi Akagi等人(Chem.Pharm.Bull.，37(10)PP.2661-2664，1989)说明的方法合成序列No.6的肽(肽B)。
以N-α-9-芴基甲氧羰基-亮氨酸-O-树脂(Fmoc-Leu-O-树脂)(0.20mmol/0.5克)(其中N-α-9-芴基甲氧羰基-亮氨酸(Fmoc-Leu)键合到4-(羟甲基)苯氧甲基-共聚物(苯乙烯1％二乙烯苯)树脂上)用作为起始树脂。用N，N-二甲基甲胺(DMF)吸胀该树脂20分钟，然后用DMF洗4次。然后加入溶于DMF中的20％哌啶，并振荡该混合物以除去保护基。该操作重复三次，以彻底去除保护基团。接着用DMF洗三次，用N-甲基-2-吡咯烷酮洗三次，再用DMF洗三次，以去除树脂中过量的哌啶。在此时用pH试纸检测哌啶的存在。
然后加入DMF(6ml)，Fmoc-Leu(0.5mmol)，N-羟苯并三唑(0.5mmol)以及N，N′-二异丙基碳化二亚胺(0.5mmol)，将混合物振荡90分钟以完成缩合反应。然后用DMF将树脂洗四次以去除过量的试剂。用茚三酮方法kaiser检测法检测该缩合反应。
由此进行合成计划并在树脂表面，从N-末端方向逐步增加氨基酸，从而形成了具有完全被保护的N-末端和功能基团的肽-O-树脂。
用于导入Arg，Lys，His，Pro和Cys的缩合反应共进行二次，每次120分钟。
此后，将溶于DMF中的20％哌啶加入到被保护的肽-O-树脂以便去除N-末端的Fmoc保护基团。然后用DMF和甲醇将该肽-O-树脂各洗六次，并在减压条件下干燥。然后向干燥的肽-O-树脂(100mg)中边搅拌边冷却地加入m-甲酚(0.2ml)，1，2-乙烷二巯基(0.5ml)，苯硫基甲烷(1.2ml)，TFA(7.5ml)和三甲基甲硅烷基溴化物(1.4ml)。随后在冰冷下将该混合物搅拌120分钟，从而从功能侧链上除去保护性基团以及从树脂上去除肽，然后用一玻璃滤器(G3)过滤。在减压条件下用一蒸发器将滤液浓缩到大约5ml。然后加入二乙醚以使肽沉淀。用一个玻璃滤器(G3)收集肽沉淀，用二乙醚洗五次并在减压条件下干燥，获得了60mg肽B。
在将氨基酸用于反应之前所有氨基酸的N-端氨基用Fmoc基团进行保护，功能侧链用下列基团保护Arg-Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)Lys-Boc(t-丁氧基羰基)Cys-Trt(三苯甲基)His-Trt(三苯甲基)将约100mg的粗制肽溶于TFA(1ml)中，加入四倍于该量的溶于TFA-二氯乙烷(5∶95，v/v)中的流动相溶剂即10mMβ-巯基乙醇从而制备20mg/ml样品溶液，利用AsahipakGS-510(φ7.5×500mm)柱(商品名；Asahi化学工业有限公司)以HPLC方法对该溶液进行纯化，从而收集纯肽B。
将溶于TFA-二氯乙烷(5∶95，v/v)中的10mMβ-巯基乙醇用作为洗脱剂并以0.8ml/分的速度洗脱80分钟。在245nm(分光光度计；日本Spectroscopic有限公司，870-UV型)并且用一示差折光计(Shimadzu公司RID-6A型)监测洗脱液中存在的肽。
FABMS(M+H+)；3017.9(计算得到的分子量；3016.9)实施例3以与实施例2相同的方式制备序列No.7的肽(肽C)。
FABMS(M+H+)；3116.0(计算得的分子量；3115.1)。实施例4以与实施例2相同的方式制备序列No.8的肽(肽D)。
FABMS(M+H+)；2663.7(计算得的分子量；2662.5)。实施例5以与实施例2相同的方式制备序列No.9的肽(肽F)。
FABMS(M+H+)；2211.2(计算得的分子量；2209.9)。实施例6以与实施例2相同的方式制备序列No.10的肽(肽F)。
FABMS(M+H+)；2647.5(计算得的分子量；2646.4)。实施例7以与实施例2相同的方式制备序列No.11的肽(肽G)。
FABMS(M+H+)；3018.1(计算得的分子量；3016.9)。实施例8以与实施例2相同的方式利用固相多肽合成系统以固相合成方法合成具有序列No.12的肽(肽H)。
以N-α-9-芴基甲氧羰基-正亮氨酸-O-树脂(Fmoc-Nle-O-树脂)(0.20mmol/0.5g)树脂作为起始树脂。将该树脂吸胀DMF20分钟，然后用DMF洗四次。然后加入溶于DMF中的20％哌啶，振荡该混合物以去除保护基团。将该操作重复三次以彻底去除保护基团。接着用DMF洗9次以去除树脂中过量的哌啶。在此时利用pH试纸检测残留哌啶的存在。
然后加入DMF(6ml)，Fmoc-Nle(0.5mmol)，N-羟苯并三唑(0.5mmol)和N，N′-二异丙基碳化二亚胺(0.5mmol)并将混合物摇荡90分钟以完成缩合反应。然后用DMF将树脂洗涤四次，以去除过量试剂。用茚三酮方法kaiser检测法检测该缩合反应。
由此执行合成计划并在树脂表面于N-末端方向逐步加入氨基酸，从而形成了其N-末端和功能基团得到充分保护的肽-O-树脂。
对于导入Arg，Lys，His，Pro和Cys的缩合反应进行两次，每次120分钟。
此后，将溶于DMF中的20％吡啶加到受保护的肽-O-树脂中以便去除N-末端的Fmoc保护性基团。然后用DMF将肽-O-树脂洗六次，用甲醇洗六次并在减压条件下进行干燥。然后边搅拌边在冰上冷却而边向干燥的肽-O-树脂(100mg)中加入m-甲酚(0.2ml)，1，2-乙烷二硫醇(0.5ml)，苯硫基甲烷(1.2ml)，TFA(7.5ml)和三甲基甲硅烷基溴化物(1.4ml)。然后边用冰冷却边将该混合物振荡120分钟从而从功能性侧链上去除保护基团，以及从树脂去除肽，然后用玻璃滤器(G3)进行过滤。用一个蒸发器将滤液在减压条件下浓缩至约5ml。然后加入二乙醚以沉淀该肽。用一玻璃滤器(G3)收集该肽沉淀，用二乙醚洗5次，在减压条件下进行干燥，获得了65mg肽H。
将所有氨基酸的N-端氨基用Fmoc基团保护并且功能侧链用下列基团保护，然后将氨基酸用于反应中Arg-Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)Lys-Boc(正-丁氧羰基)Cys-Trt(三苯甲基)His-Boc(正-丁氧羰基)将约10mg的肽溶于3.0ml的氯仿-甲醇(C/M)2∶1(v/v)的混合溶剂中。然后用Sephadex LH-60柱(φ2.5cm×90cm)纯化样品，从而收集肽H，所述柱用C/M混合溶剂2∶1(V/V)平衡。
在245nm(分光光度计；日本Spectroscopic有限公司，870-UV型)并用示差折光计(Shimadzu公司RID-6A型)对洗脱液中存在的肽进行监测。
FABMS(M+H+)；2663.6(计算得的分子量；2662.5)。实施例9以与实施例8相同的方式制备序列No.13的肽(肽I)。
FABMS(M+H+)；2560.4(计算得的分子量；2559.3)。实施例10以与实施例8相同的方式制备序列No.14的肽(肽J)。
FABMS(M+H+)；2663.8(计算得的分子量；2662.5)。实施例11以与实施例2相同的方式制备序列No.15的肽(肽K)。
FABMS(M+H+)；2663.5(计算得的分子量；2662.5)。实施例12以与实施例2相同的方式制备序列No.16的肽(肽L)。
FABMS(M+H+)；2503.6(计算得的分子量；2502.4)。实施例13以与实施例2相同的方式制备序列No.17的肽(肽M)。
FABMS(M+H+)；2736.7(计算得的分子量；2735.5)。实施例14以与实施例2相同的方式制备序列No.18的肽(肽N)。
FABMS(M+H+)；2640.4(计算得的分子量；2639.4)。实施例15以与实施例8相同的方式制备序列No.19的肽(肽O)。
FABMS(M+H+)；2640.3(计算得的分子量；2639.4)。实施例16Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)利用肽合成仪系统9050(MilliporeCorp.)以固相方法合成主题肽(肽P)。
以N-α-9-芴基甲基羰基-N-ω-4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基-精氨酸-O-树脂(Fmoc-Arg(Mtr)-O-树脂)(0.20mmol)(其中N-α-9-芴基甲基羰基-N-ω-4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基-精氨酸(Fmoc-Arg(Mtr))键合到2-甲氧基-4-烷氧基苄基醇-树脂(Sasrin树脂，Bachem Co.，Ltd的商品名))用作为起始树脂，按照肽合成仪系统9050的合成方案在树脂表面以N-末端方向依次添加氨基酸从而合成N-末端和功能基团被完全保护的肽-O-树脂。
然后用甲醇将被充分保护的肽-O-树脂洗涤五次，并在减压条件下干燥。然后边搅拌边用冰冷却向干燥的肽-O-树脂(330mg)中加入TFA-二氯甲烷溶液(1∶99，V/V)。然后边用冰冷却边将混合物振荡30分钟，然后在室温下振荡90分钟从而从树脂上去除仍附有保护基团的肽。然后用玻璃滤器(G3)过滤该混合物，用一个蒸发器在减压条件下将滤液浓缩至约5ml。然后加入二乙醚以使肽沉淀。用玻璃滤器(G3)收集该肽沉淀，然后用二乙醚洗五次，并在减压条件下干燥，于是获得了180mg的肽P。
在将氨基酸用于反应之前，将所有氨基酸的N-末端氨基用Fmoc基保护并且功能侧链用下列基团保护Arg-Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)Lys-Boc(正丁氧羰基)His-Trt(三苯甲基)然后向该粗制肽中加入TFA-二氯甲烷(1∶99，V/V)溶液从而制备10mg/ml样品溶液，将该溶液用Asahipak GS-510(φ21.5×500mm)柱(商品名；Asahi化学工业有限公司)以HPLC进行纯化从而收集到纯化肽P。
以TFA-二氯甲烷(1∶99，V/V)溶液作为洗脱剂，并以8.1ml/分的流速洗脱120分钟。在245nm(分光光度计；Japan Spectroscopic Co.Ltd.870-UV型)以及用示差折光计(Shimadzu公司RID-6A型)监测洗脱液中存在的肽。
FABMS(M+H+)；1405.0(计算的分子量；1403.8)。实施例17
按照实施例8的方法采用固相多肽合成系统合成H-Nle-(Nle)14-Nle-O-树脂。
接着，在将DMF加入到合成的H-Nle-(Nle)14-Nle-O-树脂中之后，加入肽P以替代Fmoc-Arg(Mtr)。加入N-羟基苯并三唑以及N，N′-二异丙基碳化二亚胺，然后将混合物振荡8小时。将该缩合反应进行二次。用茚三酮方法kaiser检测法检测缩合反应。
此后，根据实施例8的方法，去除功能基团的保护基，从树脂上去除肽并用HPLC进行纯化以制备具有序列No.13的肽(肽I)。
FABMS(M+H+)；2560.2(计算的分子量；2559.3)。实施例18按类似于实施例4的方式制备具有乙酰胺基甲基化(acetoamidomethylated，ACM)形式的肽D的巯基的肽(肽Q)，不同的是利用Fmoc-Cys(Acm)替代Fmoc-Cys(Trt)。
FABMS(M+H+)；2734.7(计算的分子量；2733.6)。实施例19根据Sarin，Virender和Kumar的方法(EP0458167A1)用棕榈酸将肽E的巯基酯化而制备肽R。
FABMS(M+H+)；2448.5(计算的分子量；2448.3)。比较实施例1按类似于实施例2的方式制备具序列No.20的肽(肽S)。
FABMS(M+H+)；2793.8(计算的分子量；2792.6)。比较实施例2按类似于实施例2的方式制备具序列No.21的肽(肽T)。
FABMS(M+H+)；3018.3(计算的分子量；3016.9)。
对本发明合成肽的氨基酸组分的分析在150℃，真空条件下用含5％(w/v)苯酚的12N HCl-TFA溶液[2∶1(V/V)]将本发明合成肽酸水解1，2，4，6，12，24，48和72小时，在去除酸之后，用Shimadzu自动氨基酸分析系统(LC-9A)分析水解产物。
用4.2N NaOH水溶液将肽M的Trp碱水解16，24和32小时，然后用HCl中和，然后用氨基酸分析系统分析。从在1-72小时的水解过程表示更高回收率的氨基酸的值计算到的氨基酸组成成分表明该值基本上与从化学公式计算出的值相匹配。
结果显示于表1。
表1本发明的合成肽的氨基酸组成<

>(除肽N和O是将Asx含量设为1.0而计算其它氨基酸值外，其它肽均以His含量设为1.0而计算。)
(2)本发明表面活化剂的制备通过将本发明的肽与胆碱磷酸甘油酯，酸性磷脂和脂肪酸类似物三种类脂成分混合而制备本发明的表面活化剂。实施例20在室温下将无菌的1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱(1350mg)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24个碳的酰基基团；由Sigma化学有限公司制造)(450mg)和肉豆蔻酸(200mg)溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](1000ml)以及将25mg的肽A溶于TFA(1.0ml)中。将这些溶液混合在一起，然后在减压条件下干燥和固化。在40℃将得到的残留物悬浮于水-乙醇混合物[9∶1(V/V)](1000ml)15分钟。在-50℃将该悬浮液进行冷冻，然后在85-100μHg真空中干燥36小时，获得白色粉末的表面活化剂(2070mg)。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活化剂的总量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为65.2％(W/W)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn甘油为21.7％(W/W)，肉豆蔻酸为9.7％(W/W)，肽A为1.2％(W/W)以及水占2.2％(W/W)。实施例21
将1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱(300.0mg)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具14-24碳原子的酰基；由Sgma化学有限公司制造)(100.0mg)以及棕榈酸(40.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](300ml)，将10.0mg肽B溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](2.0ml)。将这些溶液混合在一起，然后在减压条件下干燥和固化。在45℃将获得的残留物于水-乙醇混合物[9∶1(V/V)](100ml)中悬浮20分钟。将悬浮液在-60℃冷冻并在60-110μHg的真空器中干燥40小时，获得459.1mg的白色粉末状表面活化剂。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活化剂总重量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为65.3％(W/W)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油为21.8％(W/W)，棕榈酸为8.7％W/W)，肽B为2.2％(W/W)以及水为2.0％(W/W)。实施例22将1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱(280.0mg)，1，2-二月桂酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(120.0mg)以及棕榈酸(27.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](150ml)以及将2.8mg肽C溶于氯仿-甲醇混合物[1∶2(V/V)](0.5ml)。将这些溶液混合在一起，然后在减压条件下干燥和固化。在40℃将获得的残留物于水-乙醇混合物[8∶2(V/V)](100ml)中悬浮45分钟。在-65℃将该悬浮液冷冻并用真空器50-80μHg干燥36小时，获得了437.6mg的白色粉末状表面活化剂。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活化剂总重量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为64.0％(W/W)，1，2-二月桂酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油为27.4％(W/W)，棕榈酸为6.2％(W/W)，肽C为0.6％(W/W)以及水为1.8％(W/W)。实施例23除了以肽D代替肽B以及用1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油替代1，2-二酰基-sn-甘油(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24碳原子的酰基基团；由Sigma化学有限公司制造)以外，完成类似于实施例21的操作，产生了451.9mg的白色表面活化剂粉末。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活化剂总重量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为66.4％，1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘同22.1％(W/W)，棕榈酸为8.9％(W/W)，肽D为2.2％(W/W)以及水为0.4％(W/W)。实施例24
将1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱(320.0mg)，1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(80.0mg)以及棕榈酸(60.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[1∶1(V/V)](200ml)以及将肽E(14.0mg)溶于TFA(0.3ml)中。将这些溶液混合在一起，然后在减压条件下干燥和固化。在45℃将获得的残留物于水-乙醇混合物[10∶1(V/V)](50ml)中悬浮60分钟。在-45℃将该悬浮液冷冻并用50-110μHg的真空器干燥24小时，获得479.2mg的白色粉末状表面活化剂。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活化剂总重量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为66.8％(W/W)，1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油为16.7％，棕榈酸为12.5％，肽E为2.9％(W/W)以及水为1.1％(W/W)。实施例25除了以肽F(22.0mg)代替肽B(10.0mg)以及利用1，2-二硬脂酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油替代1，2-二酰基-sn-甘油(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24碳原子的酰基基团；由Sigma化学有限公司制造)以外，以类似于实施例21的操作，产生了463.9mg的白色表面活化剂粉末。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活化剂总重量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为64.7％，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油为21.6％(W/W)，棕榈酸为8.6％(W/W)，肽F为4.7％(W/W)以及水为0.4％(W/W)。实施例26除了以肽G代替肽B以外，按实施例21描述方法生产454.1mg的白色表面活化剂粉末。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活化剂总重量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为66.1％，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24个碳原子的酰基，由Sigma化学有限公司制造)为22.0％(W/W)，棕榈酸为8.8％(W/W)，肽G为2.2％(W/W)以及水为0.9％(W/W)。实施例27将1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱(210mg)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24个碳原子的酰基；由Sihma化学有限公司制造)和硬脂酸33.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[3∶1(V/V)](100ml)中以及将肽H(1.9mg)溶于甲醇(0.5ml)。将这些溶液混合在一起，然后在减压条件下干燥和固化。在50℃将获得的残留物于水-乙醇混合物[9∶1(V/V)](90ml)中悬浮15分钟。在-55℃将该悬浮液冷冻和在100-120μHg的真空器中干燥28小时，获得340.2mg的白色粉末状表面活化剂。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活化剂总重量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为61.7％(W/W)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油为26.5％(W/W)，硬脂酸为9.7％(W/W)，肽H为0.5％(W/W)以及水为1.6％(W/W)。实施例28将1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱(210.0mg)，1-棕榈酰-2油酰-sn-甘油-(3)-磷酸-L-丝氨酸(90.0mg)以及棕榈酸(33.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[4∶1(V/V)](100ml)以及将肽I(11.0mg)溶于TFA(0.5ml)中。将这些溶液混合在一起，然后在减压条件下干燥和固化。在45℃将获得的残留物于水-乙醇混合物[9∶1(V/V)](110ml)中悬浮25分钟。在-55℃将该悬浮液冷冻后在100-120μHg真空器中干燥28小时，获得了348.7mg的白色粉末状表面活化剂。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活化剂总重量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为60.2％(W/W)，1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-(3)-磷酸-L-丝氨酸为25.8％(W.W)，棕榈酸为9.5％(W/W)，肽I为3.2％(W/W)以及水为1.3％(W/W)。实施例29除了利用肽J替代肽B以外，按与实施例21相同的操作，生产了459.3mg的白色表面活化剂粉末。实施例30除了利用肽K替代肽B以外，按与实施例21相同的操作方法，生产了452.5mg的白色表面活化剂粉末。实施例31除了利用肽L代替肽B以外，按与实施例21相同的操作方法，生产456.6mg的白色表面活化剂粉末。实施例32除了利用肽M替代肽B以外，按与实施例21相同的操作方法生产453.9mg的白色表面活化剂粉末。实施例33除了利用肽N替代肽B以外，按与实施例21相同的操作，生产了452.5mg的白色表面活化剂粉末。实施例34除了利用肽O替代肽B以外，按与实施例21相同的操作，生产了458.1mg的白色表面活化剂粉末。实施例35将1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱(30.0mg)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24个碳原子的酰基；由Sigma化学有限公司制造)(10.0mg)以及棕榈酸(4.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](30ml)以及将肽Q(1.0mg)溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](2.0ml)。将这些溶液混合在一起，然后在减压条件下干燥和固化。将获得在残留物在45℃在水-乙醇混合物[9∶1(V/V)](10ml)中悬浮20分钟。在-60℃将该悬浮液冷冻并在60-120μHg的真空器中干燥36小时之后，获得45.4mg的白色表面活化剂粉末。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活化剂总重量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为66.1％(W/W)，1，2-二酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油为22.0％(W/W)，棕榈酸为8.8％(W/W)，肽Q为2.2％(W/W)以及水为0.9％(W/W)。实施例36除了使用肽R替代肽Q以外，按与实施例35相同的操作方法，生产得到45.7mg的白色表面活化剂粉末。比较实施例3
除了利用溶于TFA(0.3ml)中的肽S(10.0mg)的溶液替代溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](2.0ml)中的肽B(10.0mg)溶液以外，按实施例21相同的操作法，生产455.2mg的白色表面活化剂粉末。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活性剂总重量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为65.9％(W/W)，1，2-酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24个碳原子的酰基基团；由Sigma化学有限公司制造)为22.0％(W/W)，棕榈酸为8.8％(W/W)，肽S占2.2％(W/W)以及水为1.1％。(W/W)。比较实施例4除了利用溶于TFA(0.3ml)中的肽T(10.0mg)的溶液替代溶于氯仿-甲醇混合物[2∶1(V/V)](2.0ml)中的肽B(10.0g)溶液以外，按实施例21相同的操作法，生产456.0mg的白色表面活化剂粉末。
在该粉末中没有可检测量的乙醇，相对于表面活性剂总重量而言各种成分的含量分别是1，2-二棕榈酰甘油-(3)-磷酸胆碱为65.8％(W/W)，1，2-酰基-sn-甘油-(3)-磷酸-sn-甘油(具有14-24个碳原子的酰基基团；由Sigma化学有限公司制造)为21.9％(W/W)，棕榈酸为8.8％(W/W)，肽T占2.2％(W/W)以及水为1.3％。(W/W)。
表2显示由本发明的表面活化剂对表面活性以及保持肺泡空间体积的作用的检测效果。
在工业上的潜在应用如上所述，与常规组合物相比，本发明的新合成肽易于分离和纯化，可采用允许大批量生产方法进行制备，在一般性溶剂中具高溶解性，并且显示更好的均匀悬浮性以及同样效力的表面活性。
因此，本发明可用作为呼吸窘迫综合症的治疗剂，该综合症是一种导致严重呼吸紊乱的疾症。
表2本发明的表面活化剂的表面活性及维持肺泡体积的作用

序列表序列号1序列长度35序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val1 5 10 15Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu20 25 30Met Gly Leu35序列号2序列长度34序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Leu Ile Pro Cys Cys Pro Val Asn Ile Lys Arg Leu Leu Ile Val Val1 5 10 15Val Val Val Val Leu Leu Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met20 25 30Gly Leu序列号3序列长度35序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Leu Arg Ile Pro Cys Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Leu Leu Val Val1 5 10 15Val Val Val Val Val Leu Val Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu20 25 30Met Gly Leu35序列号4序列长度32序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val1 5 10 15Val Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu His20 25 30序列号5序列长度35序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Phe Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu20 25 30Met Gly Leu35序列号6序列长度27序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu20 25序列号7序列长度27序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu20 25序列号8序列长度23序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu20序列号9序列长度19序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu序列号10序列长度23序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu20序列号11序列长度27序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle1 5 10 15Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Gly Ala Leu Leu20 25序列号12序列长度23序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle1 5 10 15Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle20序列号13序列长度22序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Pro Val His Leu Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle1 5 10 15Nle Nle Nle Nle Nle Nle20序列号14序列长度23序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Nle1 5 10 15Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle20序列号15序列长度23序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Ile Leu Leu Leu Leu Ile Leu20序列号16序列长度23序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Nva Leu Val1 5 10 15Leu Nva Leu Leu Leu Leu Val20序列号17序列长度23序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp20序列号18序列长度23序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val Asn Leu Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 1015Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu20序列号19序列长度23序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val Asn Ile Lys Arg Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle1 5 10 15Nle Nle Nle Nle Nle Nle Nle20序列号20序列长度27序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Val Val Val Val Val Val Val Val Val1510 15Val Val Val Val Val Val Val Gly Ala Leu Leu20 25序列号21序列长度27序列形式氨基酸拓扑结构直链序列类型肽序列Cys Pro Val His Leu Lys Arg Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile1 5 10 15Ile Ile Ile Ile Ile Ile Ile Gly Ala Leu Leu20 2权利要求
1.具有下列特定序列的合成肽Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W(Xaa可以不存在，或者可以代表Cys或Ser，Xbb代表His或Asn，Xcc代表Leu或Ile，以及W代表疏水部分)。
2.根据权利要求1所述合成肽，其中疏水肽部分由12-20分子的Leu和/或Nle组成。
3.根据权利要求1或2所述合成肽，其中疏水肽部分含有除Leu和Nle以外的疏水氨基酸。
4.根据权利要求1至3所述合成肽，其中疏水肽部分含有1-5分子的Ile，Val，Nva或Trp。
5.根据权利要求1所述合成肽，具有序列No.5-19之一作为特定的肽序列，或者它是序列No.8的肽的S-乙酰胺基甲基化形式或者它是序列No.9的肽的S-棕榈酰基化形式。
6.用于合成的肽，其中该肽的由下列序列指明的亲水肽部分的N-末端和功能基团被保护Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg(Xaa可以不存在，或者可以是Cys或Ser，Xbb代表His或者Asn，Xcc代表Leu或Ile)。
7.如权利要求6所述用于合成的肽，它是Fmoc-Pro-Val-His(Trt)-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)，Fmoc-Pro-Val-Asn-Leu-Lys(Boc)-Arg(Mtr)或者Fmoc-Pro-Val-Asn-Ile-Lys(Boc)-Arg(Mtr)。
8.生产权利要求1合成肽的方法，其特征在于将权利要求1-4指示的疏水肽部分与权利要求6或7指明的用于合成的肽进行缩合。
9.肺表面活化剂，由具有特定序列的合成肽，胆碱磷酸甘油酯，酸性磷脂和脂肪酸类似物组成。
10.用于治疗呼吸窘迫综合症的治疗剂，含有其中作为活性成分的肺表面活化剂，所述肺表面活化剂由具有特定序列的合成肽，胆碱磷酸甘油酯，酸性磷脂以及脂肪酸类似物组成。
全文摘要
含有下列特定序列的合成肽Xaa-Pro-Val-Xbb-Xcc-Lys-Arg-W(其中Xaa可以不存在或者代表Cys或Ser，Xbb代表His或Asn，Xcc代表Leu或Ile，W代表一种疏水肽部分)，一种用于制备该肽的中间体，一种生产该肽的方法，含该肽和一种类脂混合物的肺表面活化剂以及以该表面活化剂作为主要成分的用于治疗呼吸窘迫综合症的药物。该肽易于分离和纯化并适于大批量生产。由于其在甲醇等中具高可溶性，因而其易于与类脂混合物混合，并适用于制备肺表面活化剂。由于肺表面活化剂有较高的悬浮性和潜在表面活性，因而适用于作为治疗呼吸窘迫综合症的药物。
文档编号A61K38/00GK1136813SQ94194376
公开日1996年11月27日 申请日期1994年12月7日 优先权日1993年12月8日
发明者武井恒知, 大坪英二, 大川博 申请人:东京田辺制药株式会社