专利名称：多聚胞嘧啶结合蛋白1在制备预防及治疗帕金森病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)的新用途，具体涉及一种多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)在制备预防及治疗帕金森病药物中的应用，属于生物医药领域。
背景技术：
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种较为常见的中枢神经系统退变性疾病，多发于中老年人，具有高发病率和高致残率的特点。该病以随意运动减少、肌僵直、肢体震颤和姿势平衡障碍为主要临床症状；以中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性使纹状体中多巴胺(DA)含量减少，并伴有Lewy小体生成为主要病理特征。据“九五”调查资料显示，约有50%的病·人从未因H)症状到医院就医，因此实际患病人数可能远远超出统计数字。由于ro病程可长达十几到几十年，治疗效果差和费用昂贵，因此给社会和家庭带来沉重的负担，对该病的研究是老年医学的重要课题。PD的发病机制尚未完全清楚，目前临床最为有效的方法是采用左旋多巴替代治疗，但仍不能有效阻止或减缓疾病的发展，提示单纯补充DA治疗的局限性。因此需要从ro多个发病机制中寻找治疗的新途径和突破口。氧化应激、线粒体损伤以及由此而产生的多种功能蛋白的错误折叠和炎性因子的增多等是公认的重要致病机制，细胞内游离铁的增多可加剧氧化应激的发生。那么如何能找到抗氧化应激、抗炎及清除多余游离铁的制剂是近几年关注的焦点。近年来，多聚胞卩密唳结合蛋白I (poly C binding protein I, PCBPl ；或heterogeneous nuclear ribonuclear protein El, hnRNP El 或 a -complex protein1，a CPI)的研究进展为我们这项发明的提出提供了契机。PCBPl功能多样，在哺乳动物细胞内广泛表达，包括中脑黑质神经元及神经胶质细胞。本研究率先展开直接将PCBPl在人源多巴胺能神经细胞中过表达，再使细胞接受氧化应激毒素6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-0HDA)的作用，观察PCBPl可能存在的对受损细胞的保护作用；确定PCBPl对受损细胞的保护效果后，以腺相关病毒为载体，将PCBPl重组腺相关病毒注入大鼠单侧纹状体，待其表达后，再将6-0HDA按相同部位注入大鼠双侧纹状体，设立对照组，于不同时间观察对照组，6-0HDA注射组(H)模型组)以及PCBP1+6-0HDA注射组(H)预防治疗组)大鼠的行为学变化，以反映PCBP I对多巴胺能神经元的保护作用以及对神经毒素6-0HDA的抗性作用。国内外研究现状及发展动态分析(I)PD发病机制的复杂性及其治疗措施的研究现状WHO 2001年的全球人口比例调查预测报告中指出，全球从2010年开始逐渐步入老龄化社会，而我国老龄化人口比例的增加要高于其它国家。因此威胁老年人的多种疾病也随之日益受到关注。ro好发于中老年人，40岁前发病非常少见，提示神经系统老化和细胞凋亡与之有关。已有研究表明ro与遗传因素、环境因素、兴奋性毒性、氧化应激、免疫学异常等诸多因素有关。因其发病机制复杂，所以至今难以产生明确的治疗手段和方法。Mandel 等人在甲基苯基四氢批P定(l-methyl-4-phenyl-l，2, 3, 6-tetrahydro-pyridine, MPTP)和6-0HDA的H)动物模型上均得出氧化应激的产生、铁活性的增强、畸变的蛋白折叠和聚集，炎症反应，内源性抗氧化剂的减少等是黑质神经元变性死亡的原因。蛋白质的错误折叠与聚合、氧化应激过度和线粒体功能丧失普遍被认为是H)疾病机制中的重要组成部分。目前多种疾病如阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病(HD)以及朊蛋白病(PrD)和H)的病变细胞中都具有一个共同的特征，即在遗传性或获得性的原因作用下，胞内蓄积有大量错误折叠并易于聚合的蛋白质，因此派生了神经变性构象病的新概念。但迄今为止，还没有基于蛋白的构象转换和聚合以及细胞的反应机制而设计的临床治疗措施应用于神经变性疾病。已用于实验的药物包括化学药品、分子伴侣、小分子多肽、单克隆抗体等，这些可减少蛋白错误折叠和聚集的措施一旦可以应用于临床，将具有根治性的意义。过度的氧化应激是ro患者黑质神经元变性死亡的另一主因。有研究发现，在6-0HDA对大鼠造模后，7天后黑质内的游离铁发生聚集，7-10天急剧增多，并且H)病人黑质部位铁离子和脂质过氧化物(LPO)浓度明·显增高，铁离子约增高50%，铁蛋白和谷胱甘肽(GSH,自由基清除系统成分)含量降低，GSH约降低50%。由于铁离子浓度增高，当GSH含量明显降低时，不能有效清除过氧化氢(H2O2),在高浓度铁离子存在的条件下，H2O2便生成更具有毒性的0H+，进而产生LP0，使细胞变性死亡。所以目前认为铁是氧化应激的可能触发点，从而引起神经退行性变，导致帕金森病的发生。但也有实验研究显示对照和H)组的黑质中铁的总量没有显著性差异，也就是说氧化应激的触发者不是黑质细胞中的总铁量的多少，而是与铁蛋白没有结合的游离铁的增多。细胞内铁的稳态失衡，比如铁蛋白功能失调，游离铁过多释出，或者游离铁的转运机制失控，致使氧化应激加剧，均为帕金森病人脑衰老的可能机制。那么在治疗上，主要包括可改善症状、阻止疾病进一步发展和神经修复的药物。目前改善症状的化学药物往往带来许多副作用，如左旋多巴(L-D0PA)。而寻找可阻止疾病进一步发展和神经修复的药物，如从抗氧化应激，采用螯合剂清除铁，抗炎，让蛋白重新正确折叠，增加脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophicfactor, BDNF)等方面寻找药物或适合的治疗措施才能逐步从根本上治疗H)。(2) PCBPl生物学功能的研究进展及其治疗ro的可能性PCBPl的研究进展为我们研究帕金森病的治疗措施提供了新的思路。PCBPl是一个在细胞内具有多种功能角色的桥梁蛋白质，在九十年代中期始有文献报导，之后不断发现其新的功能。它的染色体基因位点在2pl2-13,属于核不均一核糖核蛋白(heterogeneousnuclear ribonuclear protein, hnRNPs)的一个亚家族，该亚家族有三个hnRNP K同源(hnRNP-K-homology，KH)域。PCBP I可通过KH域与mRNA靶分子的嘧啶富含区或某些蛋白质结合，参与许多生物学过程，如复制、转录调控，前mRNAs的加工成熟，mRNAs从核内的运出，以及某些蛋白的翻译控制。即KH类蛋白在胞内广泛的转录和翻译事件中起着枢纽的作用，其KH域是调节系统的组成成分，使这类蛋白可参与蛋白/核酸及蛋白/蛋白间的相互作用，为细胞的某些信号转导事件提供了结构基础。有关PCBPl的研究内容，经目前检索国内文献只有本课题组的一些报道。国外的研究已发现不同的组织细胞中，PCBPl发挥的功能并不相同。也就是说PCBPl可作为不同的mRNAs-蛋白复合体的成分，在不同的细胞中参与控制多种mRNA的翻译和稳定性，而且所调控的mRNA翻译的蛋白往往是体现该组织细胞重要作用的大分子物质。如对神经组织的研究中发现PCBPl参与神经纤维的发育，当脊椎动物的轴突发育成熟时，神经丝-M(neurofilament, NF-M)表达增加，一定程度上归因于NF-M mRNA的稳定性，这是由于特定的结合蛋白结合到NF-M mRNA的3’_UTR区进行转录后调控的结果，亲和纯化及质谱分析鉴定特定的结合蛋白就是PCBPl和hnRNP K，它们识别并结合NF-M mRNA 3’ -UTRs的⑶-富含区，稳定了 mRNA，伴随轴突的成熟，增加了胞浆NF-M的水平。而NFs的调控紊乱与多种神经系统的疾病发生相关。申请者多年来一直从事PCBPl在遗传性疾病及神经来源的细胞(如多巴胺能的神经细胞系SH-SY5Y细胞)中的功能研究。同组研究人员发现细胞的早衰与PCBPl结合到核纤层有关，对早衰的细胞双染发现PCBPl定位到了核膜内，与核内突变的核纤层蛋白发生相互作用并影响到了细胞核的形态而与早老综合征的发病有关。通过酵母双杂交研究发现PCBPl在蛋白-蛋白相互作用的层面更是参与多个功能环路，发挥了多种胞内作用。如前所述，针对包括PD在内的神经变性构象病的治疗只是对症治疗，还没出现有效抑制或逆转神经变性构象病患者脑内蛋白聚集和沉淀的治疗方法或药物。但大量研究表明热休克蛋白在蛋白质错误折叠和聚集过程中起着重要作用。热休克蛋白可以作为分子伴侣帮助错误折叠的蛋白质恢复天然构象或减少蛋白的错误折叠和聚集，还可把错误折叠的蛋白呈递给蛋白酶体或溶酶体系统以促进它们的降解。因此，诱导热休克蛋白表达是一类很有前途的可治疗蛋白错误折叠疾病的方法。当Dong等人用腺病毒载体荷载的HSPAlA (产物:Hsp70)通过基因治疗用于MPTP-损伤的H)鼠模型时，发现Hsp70的表达可显著保护由MPTP损伤的神经元，以及纹状体多巴胺水平的下降，明显缓解由安非它明诱导的单侧帕金森鼠的偏侧旋转行为。这些结果均提示分子伴侣Hsp70表达的增加有利于原发性PD的治疗。而在我们近三年的研究工作发现PCBPl可调控热休克蛋白70家族中HSPA6 (NM 002155)和HSPAlA (NM005345)的表达，过表达PCBPl可明显上调Hsp70的表达。当在多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞中过表达PCBPl时，HSPA6可上调15.87倍，HSPAlA可上调7.89倍。另一方面，在SH-SY5Y细胞中过表达PCBP1，通过基因芯片和荧光抗体染色技术，我们还发现了 PCBPl能够上调BDNF的表达，BDNF的增加对多巴胺能神经元损伤的修复具有很好的作用。而当对内源性PCBPl基因敲低时，则发现与神经元发生、发育和轴突形成等功能有关的多种基因均受到了影响。进一步的动物实验也表明了 PCBPl对帕金森病模型的疗效。我们研究结果已提示:如果将PCBPl用于帕金森病的基因治疗可能会获得更好的疗效。另一些近期文献报道提示了 PCBPl具有可能与ro治疗相关的另外几种生物学功能:一是抗炎；二是促细胞生长；三是可降低游离铁的含量。目前已普遍发现6-0HDA所致的ro模型鼠脑中，大量炎性细胞因子如TNF-α，IL-6等的表达增加，可通过激活NF-κ B参与神经元的变性死亡过程。同样，2009年Aoki等对MPTP-损伤的PD小鼠模型研究中发现，因凋亡所致的多巴胺能神经元的丧失是由于多种细胞因子和凋亡相关蛋白在星形胶质细胞中的增多，激活了 NF-kB通路所引发的，提示抑制NF-kB的活性会有利于H)及其它因凋亡和炎症引起的神经变性病的治疗。同期Wang等人研究也发现在多巴胺能神经细胞SH-SY5Y中，6-0HDA能够抑制信号转导子与转录激活子3 (signal transducerand activator of transcription 3，STAT3)的活性，进而使 NF-κ B 活化，从而增加了炎性因子的表达，促进了神经元的死亡，提示STAT3也可以作为治疗PD的潜在药物靶点。而在2007年，Nishinakamura等人已经研究发现PCBPl能够与组成性激活的STAT3(constitutivelyactivated STAT3, STAT3C)相互作用，抑制NF-κ B的活性；并且过量表达的PCBPl可增强IL-10对IL-6 (前炎症因子)的拮抗作用，而沉默PCBPl则使得这种拮抗作用减弱。提示PCBPl可参与STAT3介导的对NF-κ B活化通路的抑制作用[1°]，有利于细胞处于抗凋亡状态。近期Waggoner等人发现PCBPl和PCBP2 (与PCBPl同源性较强，均属于KH类蛋白)在细胞周期进展中处于中枢地位，如果从K562细胞中敲除这两个基因，则细胞增殖受阻，细胞周期被阻滞在Gl期。表明PCBPl的表达有利于细胞周期及细胞生长的进行。我们前期的工作中也得出了同样的结论。此外，2008年末Science上的一篇文献报导PCBPl可作为铁的分子伴侣，将胞浆中的游离铁(二价/三价)转运到铁蛋白中储存起来，在一定的条件下再释放结合的铁，从而满足胞浆中对铁的需求。前已述及，胞浆中的游离铁的增多是氧化应激的触发点，从而可引起神经退行性变，与ro的发病过程有密切的联系。我们可以假设，即使细胞内总铁含量没有改变，但是储铁的铁蛋白在毒素的作用下如果发生了功能失调或错误折叠，就会致使过量的铁被释放出来，从而激发氧化应激，导致细胞受损。综上所述，可以发现PCBPl在诸多方面可以发挥对细胞的修复作用。设想如果能将PCBPi用于ro的治疗，可能会是一个较为完美的生物调控分子

发明内容
本发明的目的之一在于提供多`聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制备预防或治疗帕金森病药物中的应用。在本发明中，优选的，所述的多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列:(a) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或(b)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。本发明的目的之二在于提供多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制备提高脑源性神经营养因子(BDNF)的表达药物中的应用。在本发明中，优选的，所述的多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列:(a) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或(b)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。本发明的目的之三在于提供多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制备促进人源多巴胺能神经细胞的生长药物中的应用。在本发明中，优选的，所述的多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列:
(a) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或(b)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。本发明的目的之四在于提供多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制备抑制由H)毒性物6-0HDA导致的神经细胞的损伤药物中的应用。在本发明中，优选的，所述的多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列:(a) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或(b)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。本发明经过建立帕金森病细胞模型，发现外源导入的PCBPl能促进人源多巴胺能神经细胞(SH-SY5Y细胞)的生长，同时，外源PCBPl具有抑制H)毒性物6-0HDA导致的神经细胞的损伤的作用；共聚焦分析表明，PCBPl可以提高H)模型细胞中BDNF的表达水平，而BDNF是已知可以促进神经元生长和活性的分泌因子。另外，在帕金森病动物模型上，预先注入PCBPl对疾病动物模型的行为改善作用进一步体现了该蛋白多肽的预防及抵抗帕金森病作用。因此，PCBPl这种多靶点的蛋白多肽或结构与其类似的蛋白多肽可有望开发为抗ro作用的多肽生物制剂，本发明在临床应用中具有重要价值和应用前景。



图1为PCBPl-pEGFP-N2重组质粒酶切鉴定结果；图2为PCBPl转染后细胞生长情况；A为对照(转染空质粒)，B为转染重组质粒组。C为两组细胞相对数量与生长天数的关系图3 为 5-100 μ mo I/L 6-0HDA 对 SH-SY5Y 细胞的损伤；图4为加入G418后7_10天，镜下观察细胞克隆的形成；图5为转染PCBPl重组质粒对6-0HDA损伤细胞的保护作用；图6为转染PCBPl重组质粒后BDNF的表达情况；图A、C显示的是B、C细胞对应的核染色，红色是BDNF的荧光抗体着色；图B是对照质粒转染的SH-SY5Y细胞，图D是PCBPl重组质粒转染的细胞；图7为psNAVl.0-PCBPl重组质粒酶切产物电泳结果；psNAV-PCBPl重组质粒经Sal I和Bgl II酶切后的产物电泳，包括两个条带:
8.5kb左右的线性质粒，Ikb左右的PCBPl图8为对照组和空病毒注射组第一周行为学测试结果；图9为对照组和空病毒注射组第二周行为学测试结果；图10为对照组和空病毒注射组第三周行为学测试结果；图11为对照组和空病毒注射组第四周行为学测试结果；图12为对照组和空病毒注射组第五周行为学测试结果；图13为模型组与病毒治疗鼠第一周行为学测试结果；
模型组为单侧注射空病毒+双侧注射6-0HDA组；病毒治疗组为单侧注射PCBPl重组腺相关病毒+双侧注射6-0HDA组；图14为模型组与病毒治疗鼠第二周行为学测试结果；图15为模型组与病毒治疗鼠第三周行为学测试结果；图16为模型组与病毒治疗鼠第四周行为学测试结果；图17为模型组与病毒治疗鼠第五周行为学测试结果；图18为模型组与病毒治疗鼠第六周行为学测试结果。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1PCBPl在预防或抗帕金森病中的应用1材料SH-SY5Y细胞，购自美国标准生物品收藏中心(ATCC，CRL-2266);包含hnRNPEl序列的重组质粒PCBPl-pcDNA 4/His C (我室构建保存)；质粒pEGFP_N2 (GeneBankAccession#:U57608)购自 Invitrogen 公司;人源 PCBP IcDNA 的开放阅读框(ORF) (nt292-1362) (GenBank accession#genbank:NM 006196)经克隆重组形成 PCBPl_pEGFP_N2 表达载体，PCBP1-ORF具体序列如序列表SEQ ID N0.1所示。所用试剂:TRIZ0L试剂购自 Invitrogen 公司；转染试剂:lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；PCR反应试剂及内切酶购自TaKaRa ;各种细胞培养基购自Gibicol公司；抗体包括PCBPl及BDNF —抗及其相应的荧光二抗和核染料Hoechst 33258购自Santa Cruz 或 Sigma0 腺相关病毒载体pSNAVl.0购自本元正阳，引物由上海生工合成。行为学测试采用TRUSCAN动物活动检测系统(美国C0ULB0URN INSTRUMENTS)。其余试剂也均为进口或国产闻质量广品。2实验方法2.1重组质粒的表达和构建首先，采用PCR从重组质粒PCBPl-pcDNA 4/His C上扩增目的序列；引物包含限制性的酶切位点EcoR I。便于插入pcDNA 4/His C载体。PCBPl的ORF (SEQ IDN0.1所示)用下面的寡核苷酸引物来扩增:上游引物:5，TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG3，；下游引物:5’TTCTAGAATTC AACCTACACTGTTCTAGCTGCACC 3，。PCR 反应混合物包括 2.5μ I IOXPfu 反应缓冲液，2.0 μ I IOmM dNTPs, 1.5μ I25mMMg2+，0.5μ I 引物(50ng/μ I)混合物，2.5 μ I 模板 DNA，0.25 μ I Pfu 聚合酶(2.5U/μ I)，加水补足到25 μ I。PCR反应的程序为:95°C,4min ;之后行30个循环包括95°C lmin，52°C lmin, 72°C lmin ;最后72°C再延伸5min。多聚酶链反应片段产物用EcoR I消化并连接到pCDNATM4/His C载体上。阳性克隆通过酶切筛选，琼脂糖凝胶电泳检测以及测序鉴定。2.2SH-SY5Y细胞培养、神经毒素6-0HDA的加入SH-SY5Y 细胞用含 15%FBS，1% 青 / 链霉素，IOmM HEPES 的 RPMI 1640 培养基 37°C，5%C02常规培养，隔天换液。将SH-SY5Y细胞按2 3X IO4个细胞/孔接种到24孔培养板中，24h后，细胞密度需达到70 80%汇片，并将细胞培养上清液更换为没有抗生素、无血清的培养基18h，再更换全培养基24h后分别加入不同剂量的6-OHDA，筛选其毒性剂量。2.3PCBP1表达质粒转染及PCBPl稳定转染细胞系的建立转染前一天，将SH-SY5Y细胞按3.5 4X IO6个细胞/瓶接种到T175培养瓶中，在转染时，细胞密度需达到70 80%，并将细胞培养上清液更换为没有抗生素的培养基。取
24μ g PCBP l-pEGFP-N2质粒或pEGFP_N2与5ml opt1-MEM混匀，同时将72 μ I的脂质体与5ml opt1-MEM混勻，室温孵育5min后再分别将两种质粒混勻室温放置20min。之后,将混合物加入细胞培养基中，轻轻晃动混匀。转染8h后更换全培养基。转染前先选择出抗性药物作用7-10天后，全部靶细胞死亡的G418的剂量。即空白目的细胞(SH-SY5Y)接种一个 12 孔板，按照 O, 200ng/ μ I，400ng/ μ I，600ng/ μ I，800ng/μ l,1000ng/y I的G418浓度梯度进行筛选，选择7-10天刚好能杀死空白细胞的最低G418浓度。然后把PCBPl的表达载体(或空载体)转染到靶细胞SH-SY5Y细胞后，加入选定剂量的抗性药物G418。7-10天后，G418剂量减半，镜下观察细胞在培养瓶中会慢慢形成许多单克隆。继续分别培养挑选出来的不同单克隆细胞，进行PCBPl基因表达的检测。按PCBPl表达强度用预实验确定浓度的6-0HDA (25 μ Μ)选择相应克隆进行后续实验。2.4rAAV2-PCBPl-EGFP 质粒构建为了成功转染在体动物组织(实验中指神经系统)，我们采用腺相关病毒载体psNAVl.0-EGFP构建含PCBPl的重组表达载体，同样，首先采用引物5’ -TTCTAGTCGACATG GAT GCC GGT GTG ACT GAA `AGTG 和 5，-TTCTA AGATCT CTAGCT GCA CCC CAT GCC 从PCBPl-pcDNA 4/His C上扩增含有腺相关病毒载体psNAVl.0-EGFP上插入酶切位点(Sal I和Bgl II)的PCBPl的序列，之后行PCR反应，反应程序同前。多聚酶链反应片段产物用Sal I和Bgl II酶切消化并连接到psNAVl.0-EGFP载体上。阳性克隆通过酶切筛选，琼脂糖凝胶电泳检测以及测序鉴定。2.5rAAV2-PCBPl-EGFP注射纹状体对帕金森病大鼠的行为学效应检测2.5.1动物模型的制备健康雄性成年SD大鼠60只，随机分为三组，治疗组25只，损伤组25只，对照组10只。治疗组:左侧纹状体6-0HDA+PCBP1重组腺相关病毒，右侧纹状体6-0HDA ;损伤组:左侧纹状体6-0HDA+EGFP空病毒(其中10只仅注射空病毒，用来和对照组大鼠行为学比较)，右侧纹状体6-0HDA ;对照组:不做任何处理。操作过程:动物适应环境一周后，治疗组左侧纹状体注射PCBPl重组病毒2X4 μ 1，损伤组左侧纹状体注射对照空病毒2X4 μ I (浓度均为2.5X 10nVg/ml)。定位参数以前囟和颅骨中线为参照。注射部位在前囟前1.0mm，SPAP=+1.0mm (囟后为负，囟前为正)，旁开3.0mm,即ML=+3.0mm (右为负，左为正)，硬脑膜下即DV=-4.5/5.5mm, I μ 1/min,留针5分钟后慢慢退出。术后两周两组大鼠(治疗组25只，损伤组15只)左右侧纹状体各注射24ug 6-0HDA/只注射。步骤:动物称重，10%水合氯醛麻醉，0.33、.35ml/100g体重；将动物固定于立体定位仪上，用镊子拉出舌头，上牙齿挂好，插入耳杆，两侧耳杆坐标相等，夹紧鼻夹，调整齿杆-2.3mm(SD);用酒精湿润毛发，剃刀剃去毛发，碘氟消毒皮肤；用力切开皮肤，约f 1.5cm长，用刀柄钝性分离皮下组织，暴露颅骨，3%H202烧灼，直至看清囟门(前囟为十字缝，后囟为人字缝)；在囟门处用记号笔打一记号，调整立体定位仪，注射器针尖对准记号处，下降触及颅骨，读取横纵坐标；根据纹状体坐标AP=+1.0mm，ML=±3.0mm (右为负，左为正)调整坐标杆，用记号笔打记号；在记号处钻孔，注射器留1μ I气泡，然后抽药，4 μ I 6-OHDA (6 μ g/μ I)，总量为24 μ g ;进针至硬脑膜下，读取深度坐标，缓缓进针至纹状体坐标处DV=-4.5/5.5mm,勻速进药,I μ 1/min,留针5分钟；缓慢上升针头，沾少量生理盐水湿润切口，用生理盐水浸泡明胶海绵，挤干后封孔，撒少量青霉素，缝合皮肤，腹腔注射青霉素(0.5ml/只)。一周后开始每周一次的行为学检测，连续检测5-6周。2.5.2行为学测试随机取正常组和空病毒组大鼠各5只，病毒注射一周后开始检测，每隔一周检测一次，连续检测5周，检测过程尽量保证各批次检测大鼠的生理活动状态一致。另外，治疗组与损伤组各取十只大鼠放入TRUSCAN箱中，实验开始前确认箱内是否清洁，彻底清理托盘上实验留下的大鼠的粪便、尿液等)，在操作软件中记录大鼠的编号、日期，实验动物提前运送到行为学实验室专用临时笼架，适应环境30min左右以减少动物紧张。将大鼠从笼内取出(背向实验者)放置在箱内，迅速、轻柔关闭箱体；打开录像记录系统，记录大鼠在箱内的活动，前15min适应时间记录数据弃去不用，后30min实验数据整理保存。实验结束后将大鼠放回笼内，流水冲洗托盘后用75%乙醇擦，并用纸巾擦干开始下一批动物实验测试。检测如下八个活动指标:DFP——平面监测指标

活动注解:这些指标代表平面上的X-Y坐标改变,包括刻板样活动。FP MOVES:FP_总活动，指在平面上的总活动情况。一次活动指在至少一个采样间隔内，坐标位置的一连串连续的改变，即没有停顿(同一坐标)。FP MOVE ΜΕ:FP_总活动时间，在平面上的总活动的所有时间之和。(见移动时间)FP DISTANCE:FP_总活动距离，平面上所有坐标改变向量的总和。(见移动距离)FP AVG DIST/MVT:FP_单次活动平均距离，总活动距离除以该间期内的活动次数。2) VP-垂肓面监测指标VP_ENTRIES:VP-进入次数，动物身体的任一部分进入垂直面的总次数。VP ΜΕ:VP-时间，动物身体的任一部分处于垂直面内的总时间。VP-MOVES:VP-总活动，垂直面内的总活动。每次活动指的是，在至少一个采样间隔内，发生不停顿的(同一坐标)的一连串连续的坐标改变。VP DISTANCE:VP-总活动距离，在平面上的所有坐标矢量改变之和用GraphPadPrism 4软件(GraphPad公司)进行统计分析，使用One way ANOVA方法统计，并作图。数据表示为均数土标准误。结果1.PCBPl-pEGFP-N2 重组质粒构建:如图1，第2、3泳道为EcoR I酶切鉴定的重组质粒，泳道I为空载体。2.PCBPl重组质粒瞬时转染SH-SY5Y细胞后的生长现象:如图2所示(IOX)，将PCBPl重组质粒转染SH-SY5Y细胞中时，发现细胞加速生长，常规铺板I X IO4个SH-SY5Y细胞/孔后，到第6天会发现细胞汇片达到95%以上，计数细胞均值为铺板时的6.06倍(图2A-6d)，而转染了 PCBPl重组质粒的SH-SY5Y细胞在第三天就达到了铺板时的6.8倍(图2B-3d)。3.5-100 μ mol/L6-0HDA损伤SH-SY5Y细胞的剂量:如图3所示，实验发现100 μ mo I/L 6-0HDA可致细胞第二天全部死亡，50 μ mo I/L 6-0HDA也使得95%以上细胞死亡，随着6-0HDA剂量的下降，细胞存活的数量在增多，但5 μ mo I/L 6-0HDA仍显示出一定的
毒性作用。4.克隆筛选:将PCBPl-pEGFP-N2重组质粒或pEGFP_N2空质粒转染SH-SY5Y细胞后，加入筛选药物的G418后7-10天，如图4所示，倒置荧光显微镜下可观察到克隆形成。5.PCBPl对帕金森病细胞模型的保护作用:转染PCBPl重组质粒形成克隆，挑选培养鉴定后，血清饥饿18h后加入不同剂量6-0HDA，加入6-OHDA 24h后开始计数细胞(第一天)发现PCBPl对低于全死亡剂量的6-0HDA均有不同程度的抵抗作用，图5中显示的是
25μ M的6-0HDA损伤细胞后，转染了 PCBPl重组质粒的细胞生长速度显著超过对照组，第6天达到高峰(ρ〈0.01)。6.增加BDNF的表达:我们发现PCBPl的表达增强可使脑源性神经营养因子(BDNF)的分泌`增多，体现在神经元细胞内的BDNF表达也会增加。如图6D所示，转染PCBPl会使BDNF的表达增加(与图6Β比较，B, D所用荧光强度相同)，BDNF的增加会使神经元的活性增强。7.pSNAVl.0-PCBPl重组质粒酶切鉴定psNAV-PCBPl重组质粒经Sal I和Bgl II酶切后的产物电泳，包括两个条带:
8.5kb左右的线性质粒条带以及Ikb左右的PCBPl片段条带，psNAVl.0-PCBPl重组质粒酶切产物电泳结果如图7所示。8.行为学测试结果:对照组和空病毒注射组每周进行行为学测试结果均无统计学差异(图8-图12)，且大鼠每天不同时间段的自身行为活动能力的差异，另外，参测仪器需要在开启后测完同一批所有的大鼠才能关闭，为缩短每周检测的时间(每组大鼠检测需要时间是60min)，保证检测结果的可比性。故在观察PCBPl腺相关病毒的疗效时，选择比较PCBPl重组腺相关病毒治疗组和6-0HDA模型组间的差异。8.1正常组与空病毒组行为学比较(图8-图12):，实验结果表明，正常组大鼠与空病毒注射组大鼠的行为学统计结果无差异。即空病毒对大鼠无效用，也就是病毒载体注入的大鼠组与对照组间无显著差异，这样可在排除病毒载体对大鼠不利影响的同时，进一步确实了该重组病毒抗帕金森病的效应是来自于PCBPl (条图右侧为治疗组,每周8个条图分别代表不同的测量参数，参见具体实施过程)。8.2病毒治疗组与模型组行为学比较(图13-18):PCBPl病毒组大鼠运动情况在各周均优于模型组，其中以垂直方向的改善更为明显(条图右侧为治疗组，每周8个条图分别代表不同的测量参数，参见具体实施过程)。因本实验是PCBPl重组病毒注射先于神经毒素6-0HDA的注射，因此认为，PCBPl某种程度上具有抗神经毒素的损害或者说具有一定的预Kro的作用。结论:PCBP1可起到预防或抗帕金森病的作用。以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本 发明的保护范围内。
权利要求
1.聚胞嘧啶结合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制备预防或治疗帕金森病药物中的应用。
2.按权利要求1所述的应用，其特征在于所述的多聚胞嘧啶结合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或 (b)将SEQID NO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。
3.聚胞嘧啶结合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制备提高脑源性神经营养因子(BDNF)的表达药物中的应用。
4.按权利要求3所述的应用，其特征在于所述的多聚胞嘧啶结合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或 (b)将SEQID NO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。
5.聚胞嘧啶结合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制备促进人源多巴胺能神经细胞的生长药物中的应用。
6.按权利要求5所述的应用，其特征在于所述的多聚胞嘧啶结合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或 (b)将SEQID NO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有多聚胞嘧啶结合蛋白1 (PCBPl)功能的蛋白衍生物。
7.聚胞嘧啶结合蛋白1(PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制备抑制由H)毒性物6-0HDA导致的神经细胞的损伤药物中的应用。
8.按权利要求7所述的应用，其特征在于所述的多聚胞嘧啶结合蛋白I(PCBPl)或其保守序列未发生变化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物含有以下(a)或(b)的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或 (b)将SEQID NO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有多聚胞嘧啶结合蛋白I (PCBPl)功能的蛋白衍生物。
全文摘要
本发明涉及多聚胞嘧啶结合蛋白1(PCBP1)在制备预防及治疗帕金森病(PD)药物中的应用。本发明经过建立帕金森病细胞模型，发现外源导入的PCBP1能促进人源多巴胺能神经细胞(SH-SY5Y细胞)的生长，同时，外源PCBP1具有抑制PD毒性物6-OHDA导致的神经细胞的损伤；共聚焦分析表明，PCBP1可以提高PD模型细胞中BDNF的表达水平。另外，在帕金森病动物模型上，预先注入PCBP1对疾病动物模型的行为改善作用进一步体现了该蛋白多肽的预防及抵抗帕金森病作用。因此，PCBP1这种多靶点的蛋白多肽或结构与其类似的蛋白多肽可有望开发为抗PD作用的多肽生物制剂，在临床应用中具有重要价值和应用前景。
文档编号A61K38/17GK103083646SQ201210555379
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者霍丽蓉, 王晓民, 王兰英, 梁建涛 申请人:首都医科大学附属复兴医院