专利名称：胃泌素释放肽导向融合蛋白的制作方法
技术领域：
目前治疗癌症有许多手段，其中包括手术、放疗和化疗等，手术是非常有效的一种手段，但受到病种和病程的限制，很多情况下都无法应用，放化疗是治疗癌症最常见的手段，但其副作用很大，效果不尽如人意，所以人们试图找出一种副作用小并且高效的生物治疗方法来替代放化疗法。本发明涉及到一种融合蛋白，以胃泌素释放肽为融合蛋白导向部分，能够特异性地与过量表达胃泌素释放肽受体的肿瘤细胞相结合，以假单胞杆菌外毒素A的缺失体 PE40,并且其C末端5个氨基酸突变为Lys-Asp-Glu-Leu，即为PE40KDEL作为融合蛋白效应部分，特异性地杀死肿瘤细胞。
二.
背景技术：
1.本项目融合蛋白的导向部分胃泌素释放肽(GRP)胃泌素释放肽(gastrin releasing peptide, GRP)是蛙皮素样肽的同系物.，是一种胃肠道激素的有效的促分泌素或调节肽，是正常人脑、胃的神经纤维以及胎儿肺的神经内分泌组织中存在的激素，许多小细胞肺癌细胞株和肿瘤组织中也分泌GRP，且富含GRP 受体(GRPR)。(胃泌素释放肽前体融合蛋白的制备及其在肿瘤研究中的应用。中国药物与临床，2007 年 11 期，828-831)目前的研究表明，胃泌素释放肽受体在许多人类肿瘤细胞中产生高表达，如肺癌、 消化道癌和妇科癌中，胃泌素释放肽受体属于G蛋白藕联受体，其在肿瘤组织中过量表达， 对肿瘤组织具有重要的生长效应，并且其在肿瘤的发生、发展和浸润等方面发挥了重要作用。(胃泌素释放肽受体在妇科肿瘤中的研究进展。国际生殖健康/计划生育杂志，2010， V29(l) :828-831)2.本项目融合蛋白的毒素部分PE40KDEL假单胞杆菌外毒素A (PEA)是一种多肽毒素，它通过和靶细胞表面的PEA受体结合进入细胞，催化延长因子2 (EF-2)的ADP核糖基化，阻止蛋白质合成，而导致细胞死亡。PEA 分子由3个部分组成，包括受体结合结构域、转位(跨膜)结构域和活性结构域。为了消除PEA与细胞的非特异性结合，我们将PEA分子的受体结构域去除，即去除PEA分子N末端 1-252位氨基酸后，得到了 PE40分子，然后我们将PE40分子的C末端5个氨基酸进行突变， 突变为Lys-Asp-Glu-Leu，得到了活性更高的毒素部分，PE40KDEL。3.导向部分与毒素部分的连接通过5肽(-His-Met-Ala-Glu-Glu-)将两部分通过肽键连接起来，顺序为导向部分(GRP)-5肽-毒素部分(PE40KDEL)，融合蛋白序列见SEQ ID NOl。4.本发明融合蛋白的特点基于前面所述，胃泌素释放肽受体在许多人类肿瘤细胞中产生高表达，如肺癌、 消化道癌和妇科癌中，其在肿瘤组织中过量表达，对肿瘤组织具有重要的生长效应，并且其在肿瘤的发生、发展和浸润等方面发挥了重要作用。所以目前有很多报道是针对胃泌素受体进行肿瘤治疗的，包括使用GRP的类似物与紫杉醇藕联，GRP与单链抗体相连，(胃泌素释放肽受体在肿瘤治疗中的研究进展。世界华人消化杂志，2009年，V17(l) :63-67) GRP与光标记或者金属螯合剂藕联(改进的胃泌素释放肽化合物。中国专利，申请号 200710188657. 5)。这些技术在针对肿瘤治疗存在了一定的局限性，比如，GRP与紫杉醇等化疗药相藕联，由于其藕联方式的问题，化疗药容易脱落，造成药物失效，并且化疗药由于不具有选择性，在整体药物到达肿瘤部位之前容易侵害正常细胞；其次，GRP与单链抗体相连，由于单链抗体的作用没有全抗体的作用强，所以其仅仅起到抑制肿瘤细胞的作用，而由于肿瘤细胞增殖的快速性，无法起到有效控制肿瘤的目的；GRP与光标记或者金属螯合剂藕联，目前主要是作为诊断来使用，作为治疗手段无法高效地杀死肿瘤细胞。通过本发明有效地解决了上述各种方法的缺点，本发明是使用GRP作为导向， PE40KDEL作为毒素部分，能够高效地杀死肿瘤细胞。由于二者是通过5肽肽键进行相连，所以不会有药物脱落的问题；并且毒素部分只有在进入肿瘤细胞后，才能够发挥杀死细胞的作用，而正常细胞表面没有GRP受体或含量极低，所以其对于正常细胞的毒性非常小，而是特异性杀死肿瘤细胞，并且由于PE40KDEL杀死肿瘤细胞的高效率，作为治疗手段能够控制肿瘤的发展。本专利发明了一类新型导向药物，是选择GRP以及细胞毒素的小功能片段组成的融合蛋白导向药物，其具有分子量小，用量少和特异性强等特点。
三.

发明内容
本专利中的药物导向部分包括GRP，针对效应部分我们将PEA分子的受体结构域去除，即去除PEA分子N末端1-252位氨基酸后，得到了 PE40分子，然后我们将PE40分子的C末端5个氨基酸进行突变，突变为Lys-Asp-Glu-Leu，得到了活性更高的毒素部分， PE40KDEL。通过5肽(-His-Met-Ala-Glu-Glu-)将两部分通过肽键连接起来，顺序为导向部分(GRP)-5肽-毒素部分(PE40-KDEL)，融合蛋白氨基酸序列见SEQ ID NOl。作为本发明中的融合蛋白，是一类自然界没有的人工蛋白，其特征为GRP和 PE40KDEL组成的融合蛋白，可以使用一种具有序列表中SEQ ID NOl的序列，也可以使用对序列表SEQID NOl中融合蛋白的氨基酸序列加以修饰，如插入，缺失，突变某个或某些氨基酸而得到的序列，只要基本保持原分子的生物活性即可。换句话说，也可以使用采用其氨基酸序列大体上与序列表SEQ ID NOl中融合蛋白氨基酸序列相同的蛋白，即使用氨基酸序列具有大于等于90%序列同一性的变体或其功能性片段。本发明的另一方面，涉及一种药物组合物，其含有本发明所述的融合蛋白，以及任选的药物上可接受的载体。在本发明知，术语“药物上可接受的”意味着制药领域公认的可用于动物，更特别的是可用于人的。术语“载体”指稀释剂、佐剂(例如(完全或不完全)弗氏佐剂)、赋形剂、或用于容纳或施用治疗剂的介质。这些药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物、或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、诸如此类。静脉内施用药用组合物时，水是优选的载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、诸如此类。如果需要， 组合物还可以包含较少数量的润湿或乳化剂如透明质酸钠，或是PH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊粉剂、缓释配方、诸如此类的形式。在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为冻干注射剂形式，其中含有 0. 01% -0. 2%的融合蛋白，以及5%的甘露醇，以及药物上可接受的载体。本领域普通技术人员知晓，所述融合蛋白可以通过基因重组表达的方法或者化学合成的方法制备。在本发明中，所述融合蛋白是通过基因工程重组表达的方法获得的。实例一重组融合蛋白质粒的构建和工程菌的获得以设计好的SEQ ID NOl氨基酸序列为模板，根据中心法则，选择大肠杆菌偏好的密码子，得到融合蛋白的所对应的核酸序列，再使用全基因合成技术得到上述目的基因片段。通过本领域普通技术人员知晓的重组技术获得重组基因载体PUC-GRP2，对插入载体的基因片段进行序列测定。验证其基因序列的正确性后，扩增保存，从该载体上切取下目的基因片段，插入表达载体中，重组质粒命名为PGRP2。然后用CaC12法转化大肠杆菌BL21DE3， 涂布在含有抗生素的筛选平板培养基表面，挑选阳性菌落在液体培养基中培养至0D600为 0. 6-0. 8时加入IPTG 1. OmM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后12% SDS-PAGE电泳时出现一条明显的蛋白表达带，表达量为40%。经天然型PE的单克隆抗体免疫印迹检定， 显示阳性反应，再把重组表达载体导入表达宿主菌中，经培养表达，疏水层析和离子交换层析得到目的蛋白GRP-PE40KDEL，用MTT细胞测活法测定GRP-PE40KDEL的杀伤肿瘤细胞的活性，所获得的高效表达融合蛋白的工程菌命名为PGRP2/BL21DE3。实例二目的蛋白的表达1)摇瓶表达将如上述制备的基因工程菌PGRP2/BL21DE3，在LB培养基中摇瓶过夜培养(37°C，200rpm)，再按体积比1 30接种至LB培养基中，37°C培养3小时后，加入 0. ImMIPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现融合蛋白(43KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的40%。2)大规模发酵表达a.培养基组成a)种子液培养基(LB)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化钠10克/升。b)上罐培养基(15升)磷酸氢二钠250克、磷酸二氢钾110克、氯化钠13.克、氯化铵30克、胰蛋白胨120克。以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。硫酸镁30克、葡萄糖450克、补料(500克/升)葡萄糖。发酵及诱导表达i)种子培养从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升Q50毫升的三角瓶)LB中，36°C、200 转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LB中，36°C、200转/分，培养过夜。ii)发酵及诱导表达过程
将培养好的种子液(0D600 = 5-8)加入罐中，调好各参数，36 °C、150转、溶氧 100%,开始发酵；5小时后开始以2. 5速流加2小时，约加入800毫升补料，加入0. 5克IPTG 诱导(五小时)。实例三目的蛋白纯化(1)疏水层析采用疏水层析介质(Octyl Sepharose 4Fast Flow)，平衡液A采用25mM Tris-HCl，pH8，IM硫酸铵，平衡后，裂菌的离心上清上样(补硫酸铵至1M)，用A平衡5个柱体积后，线性梯度洗脱，0-20个柱体积，1-0. IM硫酸铵，收集融合蛋白峰。(2)阴离子交换层析采用Source 30Q阴离子交换层析介质，平衡液A为25mM Tris-HCl，pH8，平衡，上一步得到的样品用水稀释4倍上样，平衡，线性梯度洗脱，0-20个柱体积，0-0. 5M NaCl，收集目的融合蛋白峰。(3)阴离子交换层析采用 Q Sepharose High Performance 层析介质，平衡液为 20mM PB, pH7. 4，上一步得到的样品用水稀释3倍进行上样，平衡后采用20mM PB，pH7.4，0-lM NaCl，0_10个柱体积的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。实例四活性测定(MTT法)用MTT比色法测定细胞增殖中活细胞的数目，以此确定融合蛋白杀伤各种肿瘤细胞的活力，所选的肿瘤细胞包括SPC (人肺腺癌细胞)、MGC (人胃癌细胞)、PC-3(人前列腺癌细胞)和A549(人肺癌细胞)。取96孔细胞培养板3块，每孔接种细胞数为IX 104、每块培养板每种细胞重复接种20个孔，37°C、5% C02条件下培养，然后分别加入等比稀释的融合蛋白样品，继续培养对，48及7 后，每孔加5g/L MTT 20 μ 1再培养4h，然后去上清液加入二甲亚砜200 μ 1，将培养板放在微量振荡器上振荡lOmin，待MTT被细胞还原形成甲颗粒完全溶解后，立即用酶标仪、波长570nm测定其吸光度，然后通过标准计算公式计算出目的蛋白活性。上述实验重复3次，计算其平均IC50值。结果见表1，表1.实例中的融合蛋白细胞活性
权利要求
1.一种基因工程融合蛋白，具有SEQ ID NOl所示的氨基酸序列。
2.一种多核苷酸序列，其编码如权利要求1所述的融合蛋白。
3.权利要求1中的融合蛋白为主要成分的药物组合物，主要攻击胃泌素释放肽受体异常表达的各类肿瘤细胞。
4.权利要求3中的重组载体的宿主细胞包括细菌、酵母和哺乳动物细胞。
5.权利要求1中的融合蛋白，是使用基因工程重组表达载体经过转化、发酵和纯化而得到。
全文摘要
本发明涉及一种可以定向杀死肿瘤细胞的融合蛋白，是由胃泌素释放肽(GRP)组成的导向部分和由细胞毒素组成的效应部分构成，具有定向到达并杀死过量表达GRP受体的肿瘤细胞的特性。
文档编号A61K47/48GK102250252SQ20101017337
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者李咏梅, 李树民, 莘旭妮 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所