专利名称：具有神经保护作用的肽及其制备方法、药物组合物和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，具体而言，本发明涉及一种具有神经保护作用的肽、其制备方法、含有这种肽的药物组合物及所述肽的制药用途。
背景技术：
MLK3(混合性谱系激酶，Mixed lineage kinase 3)是MAPKKK(促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶)家族的MLKs亚家族成员，它通过磷酸化作用激活MAPK (促分裂原活化蛋白激酶)通路的丝/苏氨酸蛋白激酶，是JNK3 (c-Jun N末端激酶家族成员)上游重要激酶(Gallo KA 等人，Nature reviews, 2002 年 9 月，3 (9):663-72 ;Ip YT 等人,Curr Opin CellBiol, 1998,10:205-219)。MLK3 由 SH3 (Src homology 3)结构域、激酶结构域、亮氨酸拉链结构域、Cd4c2/Rac相互作用的结构域组成，可以通过277位苏氨酸和281位丝氨酸发生自身磷酸化，又可通过其自身SH3结构域的连接发挥自身抑制功能，MLK3的自身磷酸化和它的激活有着密切的关系(Hua Z 等人，J Biol Chem，2001，276:45598-45603)。研究发现，阻断MLK3-MKK7-JNKS信号通路对脑缺血、β -淀粉样肽(Α β )诱导的神经元损伤有显著的保护作用(Pan J等人，Neuroscience2005 ;131(1):147-59)。以上结果提示，MLK3信号通路参与中枢神经系统疾病，它和许多促凋亡和抗凋亡因子相互作用并最终决定细胞的生与死，这种平衡的失常将会导致各种疾病的发生。因此，MLK3是中枢神经系统疾病新的治疗靶点。目前受体酪氨酸激酶TrkA(酪氨酸激酶)抑制剂K252a虽然可抑制MLK3，以抑制细胞的凋亡，促进细胞的生长发育(Kaneko M等人，J Med Chem, 1997,40:1863-1869)，但K252a并不是特异性的MLK3抑制剂。CEP1347和CEPl 1004虽然是MLK3抑制剂，但它抑制病理状态下过度活化的MLK3的同时也抑制了 MLK3的生理功能，在II期临床实验中失败(Parkinson Study Group PRECEPT Investigators.Neurology 2007 ；69:1480-1490)。研究表明,PSD-95(突触后致密物质 95,postsynaptic density-95)与 MLK3 的特异结合可促进MLK3的活化。PSD-95是组成兴奋性突触的突触后致密物质的一个关键蛋白，它属于膜相关的鸟苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinases,MAGUK)蛋白家族中的一员，又被称为脚手架蛋白，在兴奋性突触的PSD中募集信号蛋白(Kennedy MB, TrendsNeurosci,1997,20:264-268 ；Sheng M.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,2001, 98:7058-7061 ；Sheng M等人，Science，2002，298:776-780 ;Sheng M.J Cell Sci，2001，114 (Pt 7):1251)。PSD-95由N-端3个PDZ (PSD-95/Dlg/Z0-l)结构域，I个SH3结构域和C-端无活性的鸟苷酸激酶(GK)结构域组成(Anderson JM.1996 Curr Biol,6:382-384 ；Gonzalez-MariscalL 等人，Semin Cell Dev Biol, 2000，11:315-324)。PSD-95 通过其 SH3 结构域与 MLK3 的 C末端富含脯氨酸(proline-rich region domain, PRD)的结构域结合形成PSD-95-MLK3复合体(ffhitmarsh AJ 等人，Davis RJ.Science, 1998, 281:1671-1674 ；Savinainen A 等人，JBiol Chem, 2001, 276:11382-11386)。本发明人的研究表明MLK3在生理状态下活性较低，与PSD-95不结合，但病理状态下MLK3与PSD-95结合增加，并且被激活，从而导致下游信号通路激活而引起细胞凋亡，因此阻断MLK3与PSD-95在病理状态下的结合从而阻断下游信号通路的激活对细胞损伤具有保护作用。

发明内容
本发明人研究发现靶向于PSD-95-MLK3复合体的肽对病理状态下过度激活的MLK3有抑制作用，从而可用作神经保护药物。因此，开发这种MLK3特异性肽抑制剂对研究和开发神经元保护药物，预防和/或治疗脑卒中、神经退行性疾病、癫痫以及疾病的免疫炎性反应等的治疗药物具有重要意义。因此，本发明的一个目的为针对现有MLK3抑制剂的不足，提供新型肽，所述肽可以与MLK3竞争性结合PSD95的SH3结构域，从而抑制病理状态下MLK3-JNK3信号通路的过
度激活。本发明的另一个目的为提供可以表达所述肽的核苷酸；此外，本发明的再一个目的为提供包含所述肽的药物组合物；本发明的目的还在于提供所述肽的制药用途。本发明的技术方案如下:一方面，本发明提供一种具有神经保护作用的肽，所述肽的氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1 所示:SEQ.1D.N0.1:Pro Glu Pro Glu Glu Pro Arg Arg Ser Gly Arg Lys Lys ArgArgGln Arg Arg Arg在下文其它部分，S EQ.1D.N0.1所示肽又被简称为P2。P2中未加下划线的部分可以竞争性地结合PSD95，干扰MLK3与PSD-95的结合，抑制神经细胞凋亡过程中MLK3的活化及其下游的细胞信号转导，产生神经保护作用；带下划线部分的序列为穿膜肽序列，其帮助小肽进入细胞。穿膜肽序列是一种带正电荷的短肽，具有穿膜活性，能将外源性的生物学分子如多肽、寡核苷酸、DNA、蛋白、质粒甚至颗粒型物质携带入多种哺乳动物活细胞，并且对细胞不会产生毒副作用，这种设计已被公认(Vives E等人，J Biol Chem, 1997, 272:16010-16017)。P2中的穿膜序列可以是其他任何能帮助该肽进入细胞的序列，因此将其修改为本领域现有或未来开发的穿膜序列而得到的肽都应该在本发明的保护范围之内。下表I列举了一些常用的穿膜序列，除此之外新型穿膜肽或穿膜序列仍在不断被报道，本发明不能--列举。表I现有常用穿膜序列
权利要求
1.一种具有神经保护作用的肽，所述肽的氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
2.编码根据权利要求1所述肽的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ.1D.N0.2所示。
3.根据权利要求1所述肽和根据权利要求2所述核苷酸的制备方法，所述制备方法为生物合成或化学合成方法。
4.一种构建体,所述构建体包含根据权利要求2所述的核苷酸序列。
5.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的肽或根据权利要求2所述的核苷酸序列或者根据权利要求4所述的构建体； 优选地，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的肽。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、调味剂、香味剂等的一种或多种； 优选地，所述药物组合物为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液或注射液。
8.根据权利要求1所述的肽或根据权利要求2所述的核苷酸序列或者根据权利要求4所述的构建体在制备用于预防和/或治疗神经系统疾病、免疫炎性疾病的药物和/或神经元保护药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述神经系统疾病选自神经退行性疾病、癫痫以及脑卒中中的一种或几种； 优选地，所述神经退行性疾病例如包括老年痴呆和帕金森病。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述药物选自片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液和注射液。
全文摘要
本发明提供一种肽、编码所述肽的核苷酸序列、包含所述肽的药物组合物以及所述肽的制药用途。本发明提供的肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。所述肽可以干扰MLK3与PSD-95的结合，抑制神经细胞凋亡过程中MLK3的活化及其下游的细胞信号转导，从而产生神经保护作用，具有良好的药物应用前景。
文档编号A61P25/08GK103159832SQ20111040402
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者侯筱宇, 李婷, 徐珍, 张晓红, 徐岩, 胡斌 申请人:徐州医学院