专利名称：乙型肝炎病毒表面l蛋白相关肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防、治疗こ型肝炎病毒(human hepatitis B virus, HBV)感染的HBV表面L蛋白衍生肽、去除这些多肽抗原性的筛选方法以及通过该方法筛选得到的去抗原性衍生肽。特别是本发明涉及来源于B基因型adw血清型、C基因型adr血清型以及D基因型ayw血清型HBV的L蛋白pre_Sl区多肽。同样特别地，本发明涉及去除HBV表面L蛋白衍生肽抗原性的筛选方法以及通过该方法获得的可阻断HBV感染却不与抗体结合的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽。该去抗原性衍生肽可与抗HBV表面L蛋白抗体协同抑制HBV感染。
背景技术：
I. HBV的流行病学HBV感染是全球最为严重的公共卫生问题之一，是仅次于性病和水痘的第三常见疾病。全球约有20亿人感染过HBV，75%的世界人ロ生活在こ型肝炎高发区，慢性HBV感染者超过3. 5亿。每年与HBV感染相关的死亡人数高达100万(I)，每年新增感染估计是HIV新增感染的2. 5 4倍。世界上75%的HBV慢性感染者集中在亚洲(约为2. 87亿)，中国是こ型肝炎的高流行区，70年代末和90年代初两次全国肝炎流行病学调查的数据显示，我国感染过HBV者6. 9亿，感染率为57.6%，全国长期携带HBV者I. 2亿，HBV表面抗原携带率9. 75%，现有的慢性こ型肝炎患者2000余万，且自1995年开始，中国人群こ型肝炎发病比例呈逐年升高趋势，因此在卫生部《2005年卫生工作要点》中已将こ型肝炎列入我国需要重点控制的四大疾病之一。2. HBV感染的预防与治疗现状HBV的重要性早已在世界范围内得到广泛公认，其预防和治疗也被置于优先地位。但迄今尚缺乏可清除体内HBV的药物，疗效相对确切的抗病毒药物主要是α干扰素和核苷类似物(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和特必夫定等)。α干扰素主要通过免疫调节和诱生靶细胞内抗病毒蛋白而发挥抗病毒作用；核苷类似物则作用于HBV逆转录酶，抑制病毒DNA链的合成，从而抑制HBV DNA的复制。经过I年的标准疗程治疗，约33%的α干扰素治疗患者和约16%的拉米夫定治疗患者可获得彻底或部分血清学应答(HBsAg转阴、HBeAg均转阴、出现或不出现抗-HBe抗体)、完全的病毒学应答(HBV DNA转阴)和生化应答(丙氨酸氨基转移酶间隔I个月连续2次检测均正常，肝功能复常)。自从1970年Krugman获得最早的こ型肝炎疫苗后，各国相继利用无症状HBsAg携带者的血浆提取血源性HBsAg制备HBV疫苗。血源性HBV疫苗经过长期使用被证明安全有效，但由于其来源有限，制备成本高昂，已被基因重组HBV疫苗取代。目前主要的重组疫苗包括酵母和中国仓鼠卵巢细胞表达的重组こ肝疫苗。这些疫苗免疫原性強，3针全程免疫后抗HBsAg抗体阳转率不低于85%。但其主要缺点是抗体应答较迟，HBV感染产妇的新生儿初次免疫若超过7天以上，则失去HBV疫苗对新生儿阻断垂直传播的作用。而且10% 15%接种者不产生应答或低应答，该人群仍可被HBV感染。こ型肝炎免疫球蛋白(HBIG)系用经こ型肝炎疫苗免疫健康人后，采集的高效价血浆或血清分离提取制备的免疫球蛋白制剂，其抗体效价在100IU/ml以上。适用于突发意外感染人群、免疫功能低下者以及HBV感染产妇新生儿的被动免疫预防。我国的慢性HBV感染者约有30%-50%通过母婴传播，为阻断HBV母婴围产期传播，普遍将HBIG与こ肝疫苗联合应用，虽然保护率可达80%以上，但HBIG提供的阻断贡献并不明显，联合应用仅较こ肝疫苗单用提高5% 10%的阻断率，而且联合应用后HBV感染产妇新生儿HBV感染率仍较健康产妇新生儿高4倍。近年发现，宫内感染可能是母婴传播的重要途径，HBV感染孕妇引产胎儿肝脏或血液的HBV感染标志检出率可达40%，HBsAg阳性母亲的婴儿的宫内感染率约16%。因此国内有些医院在妊娠的最后3 4个月中对HBV感染孕妇每月一 次注射大于200IU的HBIG，以期预防胎儿HBV宫内感染。但该方法宫内传播阻断效果并不理想，且可能导致HBVS区变异株的出现和免疫复合物病理免疫反应的发生。HBIG还广泛应用于こ型肝炎相关肝移植术后HBV感染复发的预防。在没有预防措施的情况下，こ型肝炎相关肝移植术后6个月内HBV再感染率高达约40%，2年内再感染率高达约60%。多数再感染病例历经急性、慢性肝炎而发展为肝硬化、肝功能衰竭，远期预后不佳，需再次肝移植。単独采用拉米夫定预防肝移植术后こ型肝炎复发，其长期HBV-DNA、HBeAg及HBsAg转阴率约60 70%，且易发生HBV基因突变，YMDD耐药变异率高达21%。加之患者移植前多长期使用抗病毒药物，多数出现抗病毒药物抵抗现象，増加了移植后病毒感染复发率和预防的难度。因此国外加用大剂量HBIG以预防こ型肝炎相关肝移植术后こ肝复发。肝移植术后没有接受HBIG治疗的受者中，术后早期体内出现不同滴度的HBsAb，随后血清HBsAb逐渐消失，而使用HBIG的患者血清HBsAb能长期维持较高滴度。高剂量无限制性HBIG单一治疗能阻止65% 80%患者复发，但HBIG价格昂贵，费用每年高达约130万元人民币。国内采用拉米夫定与小剂量HBIG联合应用阻止移植后HBV感染复发的疗效虽然显示良好，但未经大样本临床试验证实。且长期应用HBIG带来的免疫压カ会造成HBV基因变异而出现免疫逃逸现象，使HBIG用于こ型肝炎相关肝移植术后HBV再感染的预防受到很大限制。综上所述，目前用于防治HBV感染的手段主要限于核苷酸类似抑制物、抗病毒细胞因子和中和性抗体的主动被动免疫，缺少对HBV病毒其他感染环节的抑制手段。本发明所涉及的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽则可直接作用于HBV与肝细胞表面受体结合的最初感染环节，直接阻断病毒对肝细胞的感染，为HBV感染的治疗和预防提供新的手段。 3. HBV 病韋学I)概述HBV属嗜肝DNA病毒科非细胞溶破性病毒。其基因组为部分双链的环状DNA，仅长约3. 2kb，是已知最小的DNA病毒。高度重叠的4个基因区编码至少8种蛋白，即S区基因编码的L、M、S表面抗原HBs ；C基因编码的pre-C、HBc, HBe ；P基因编码的聚合酶和X基因编码的HBx。通常情况下HBV的感染和复制不引起肝细胞明显的病理性改变，产生的病毒颗粒以分泌方式释放。HBV产生的相关颗粒主要有3种形态，包括直径42-47nm的Dane颗粒、丰度高于Dane颗粒10，000-1, 000，000倍的20nm球状颗粒和少量直径20nm长度不等的丝状纤维。其中只有Dane颗粒由基因组DNA、病毒DNA聚合酶、核衣壳和被膜构成，是HBV唯一具有感染活性的病毒性颗粒。2) HBV基因型、血清型及其流行病学分布目前HBV存在血清型和基因型两种不同的分型体系。1972年Lebouvier等根据HBV表面蛋白HBsAg的共同抗原决定簇a以及相互排斥的两对抗原决定簇d/y和w/r，将HBV分为adw, adr, ayw和ayr四个血清型。1978年Courouce Pauty等又将抗原决定簇w分为wl 4,加上新发现的抗原决定簇q,将HBV进ー步分为aywl, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2,adw4, adrq+和adrq-等9个血清型(2)。1988年以来，依据HBV全基因系统进化分析的结果，以全基因核苷酸异源性彡8%为分型标准，将HBV分为8个基因型(A H) (3，4)。各基因型之间的组合还可产生A/D、B/C、Ba和Bj等不同重组体。HBV血清 型和基因型之间的对应关系见表I。虽然HBV感染在世界各地均有不同程度的流行，国家间和国内地区间却存在非常明显的差异(表I)。我国A、B、C、D等基因型HBV感染均呈不同程度的存在，北方地区以C基因型为主，由北至南B基因型感染率逐渐增高，深圳B基因型和C基因型感染率比例相当，西藏等少数民族地区D基因型有较高的感染率。我国adr、adw2、ayr、aywl、ayw2和ayw3等血清型HBV均有分布，但以adr和adw2为优势血清型。在我国B基因型与adw2血清型、C基因型与adr血清型存在明显对应关系。表I. HBV基因型和血清学亚型、HBV蛋白、PC/BCP突变的关系及主要流行地域基因型血清学型基因组长度(nt) HBVsAgPre-Sl氨基酸数主要流行地域
权利要求
1.ー种HBV表面L蛋白的多肽，其特征在于，所述多肽为B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的第13到第59个氨基酸序列，其中，所述多肽的N末端被豆蘧酰化。
2.如权利要求I所述的多肽，其特征在于，所述B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
3.如权利要求I所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自SEQID N0:3-7，其中SEQ IDNO :3-7的第I个氨基酸甘氨酸被豆蘧酰化修饰。
4.ー种HBV表面L蛋白的多肽，其特征在干，该多肽具有通式y-ζ，其中， y表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白的第2到第32个氨基酸序列，其中，y的N末端被豆蘧酰化； z表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白第33到第47氨基酸序列，或自该序列C末端缩短的序列或完全缺失。
5.如权利4所述的多肽，其特征在于，所述D基因型ayr血清型HBV病毒表面L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
6.如权利4或5所述的多肽，其特征在于，所述多肽的序列为SEQID NO :9，其第I位氨基酸甘氨酸被豆蘧酰化修饰。
7.—种蛋白去抗原性衍生肽的筛选方法，用于去除抗原性而保留蛋白的特定属性，其特征在于，该方法包括 (A)在待筛选的病毒蛋白中引入随机序列，建立该蛋白特定区域或全部蛋白随机编码的重组病毒库； (B)在待筛选蛋白抗体存在的条件下，筛选仍具有感染能力的重组病毒亚群，并获得该重组病毒亚群中该蛋白的氨基酸序列，即获得该蛋白去抗原性候选肽序列； (C)按获得的去抗原性候选肽序列合成相应的去抗原性候选肽，筛选可调节病毒感染能力却不与该病毒蛋白抗体结合的去抗原性的多肽，即获得蛋白去抗原性衍生肽。
8.—种HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，它通过权利7所述方法对权利I所述的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白多肽进行筛选而得到，其特征在干，它具有通式 α - β 式中， α表示HBV表面L蛋白的第I到13位氨基酸序列，或自该序列N末端缩短的序列或仅为第13位氨基酸甘氨酸，其中，所述N末端和/或第13位氨基酸甘氨酸可被修饰； β表示应用权利要求7所述的筛选方法对B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到第58氨基酸序列进行筛选获得的氨基酸序列，其中，所获得的氨基酸序列的N末端可被修饰和/或其C末端可被缩短或修饰。
9.ー种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求I 一 6中任一项所述的多肽或权利要求8所述的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽和药学上可接受的载体。
10.权利要求I一 6中任一项任ー项所述的多肽或权利要求8所述的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽在制备预防和/或治疗こ型肝炎的药剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及用于预防、治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的HBV表面L蛋白衍生肽、去除这些多肽抗原性的筛选方法以及通过该方法筛选得到的去抗原性衍生肽。HBV表面L蛋白pre-S1区含有病毒黏附细胞表面受体的关键性氨基酸序列以及与抗L蛋白抗体结合的抗原性氨基酸序列。本申请提供的HBV表面L蛋白pre-S1区的多肽可抑制HBV对细胞的感染。本发明同时提供了去除这些多肽抗原性的筛选方法，并筛选出既可抑制HBV感染又不与抗体结合的去抗原性衍生肽，不仅解决了天然L蛋白衍生肽与抗L蛋白抗体之间在抑制HBV感染时的相互干扰，而且使去抗原性衍生肽与抗HBV表面L蛋白抗体发挥协同抑制HBV感染的作用。
文档编号A61K39/29GK102675430SQ201210177978
公开日2012年9月19日 申请日期2005年8月12日 优先权日2005年8月12日
发明者刘宏利, 尹颖, 汪裕 申请人:上海贺普生物科技有限公司