专利名称：利用rna干扰文库筛选肿瘤转移抑制基因的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种利用RNA干扰文库和免疫缺陷小鼠细胞在体移植肿瘤转移模型筛选 肿瘤转移抑制基因。
背景技术：
肿瘤转移是指肿瘤细胞从原发部位扩散到机体其它部位的现象。统计表明，超过90%的 肿瘤患者死亡源于肿瘤转移。肿瘤转移包括1、肿瘤细胞迁移通过肿瘤组织基底膜；2、进 入循环系统，在其中存活并转运；3、在肿瘤继发部位滞留；4、从循环系统渗出；5、浸入 肿瘤继发部位并增殖形成新的肿瘤等过程。由于其复杂性，尽管己对其进行了广泛的研究， 肿瘤转移仍然是迄今了解得最少的肿瘤生物学过程。肿瘤转移这一复杂过程是由多种基因调 节的。其中有些基因促进肿瘤转移的发生，叫做肿瘤转移促进基因。多年来，利用各种基因 过表达手段，人们找到了一些肿瘤转移促进基因，例如，Amf, Hgf/sf, TGF-p, MMP, UPA, p-catenin等。
另一类基因抑制肿瘤转移的发生，叫做肿瘤转移抑制基因。通常，肿瘤转移抑制基因能 抑制肿瘤转移而对原发肿瘤生长无影响，在转移病灶中常通过甲基化或转录翻译后修饰等一 系列机制表现为表达下调。为了更好地了解肿瘤转移，人们试图进一步揭示肿瘤转移抑制基 因在肿瘤转移发射过程中的作用。显而易见，寻找肿瘤转移抑制基因需要通过降低肿瘤转移 抑制基因表达来实现。但是，由于没有可靠的降低表达手段，长期以来只确定了非常有限的 肿瘤转移抑制基因，目前只有NM23、 KNIl、 KISS1、 MKK4、 BrMSl、 Gasl等有限的基因 符合肿瘤转移抑制基因的定义标准，其中最为明确的是NM23和KNI。从而使得对肿瘤转 移抑制基因的研究、开发、利用无法进行，极大地限制了对肿瘤转移的了解、诊断和治疗。
美国科学家安德鲁 法尔和克雷格 梅洛1998年发现了 RNA干扰机制，2006年他们两 分享了诺贝尔生理学和医学奖。 一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的肯定， 足见RNA干扰在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。这一可以使得基因在体降低表达
的机制，也为寻找肿瘤转移抑制基因提供了条件。
最近，有人利用细胞离体培养模型和RNA干扰文库进行肿瘤转移抑制基因的筛选，一 些肿瘤细胞株在凝胶基质上进行离体三维细胞培养时，迅速形成与原始细胞团分开的卫星细胞集落。这一过程可以离体模拟肿瘤转移的几个关键步骤1、从肿瘤组织迁移出去；2、在 肿瘤继发部位滞留；3、浸入肿瘤继发部位并增殖形成新的肿瘤等。RNA干扰文库使得人类 基因组的各种基因分别在肿瘤细胞株任意地降低表达。这样，在肿瘤转移抑制基因降低表达 的细胞，进行凝胶基质离体三维细胞培养时，形成卫星细胞集落的能力大大增强，通过克隆 形成卫星细胞集落的基因可以确定新的肿瘤转移抑制基因。这一筛选的优点是1、部分地 模拟了肿瘤转移的过程、操作相对简单；2、由于RNA干扰文库可以有效地降低肿瘤转移抑 制基因，有利于肿瘤转移的形成，从而有利于筛选到肿瘤转移抑制基因。缺点是由于离体模 型不能完全模拟在体肿瘤转移的各个环节和环境的影响，因而1、筛选到的候选基因只是 影响肿瘤转移的部分过程，可能出现假阳性肿瘤转移抑制基因；2、不能筛选到一些影响模 型未能模拟的肿瘤转移环节的肿瘤转移抑制基因。
也有人利用免疫缺陷小鼠细胞在体移植肿瘤转移模型和基因过表达文库进行肿瘤转移促 进基因的筛选。由于肿瘤转移是多种步骤的的在体过程，其复杂性是任何细胞模型所不能模 拟的。因而人们建立了在体研究肿瘤转移的动物模型--免疫缺陷小鼠细胞异体移植模型。就 是将肿瘤细胞通过尾静脉注入免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)体内，由于毛细血管丰富，肿瘤 细胞在肺部滞留并增殖形成新的肿瘤。这一过程可以在体模拟肿瘤转移的几个关键步骤 1、进入循环系统，在其中存活并转运；2、在肿瘤继发部位滞留；3、从循环系统渗出；4、 浸入肿瘤继发部位并增殖形成新的肿瘤等。过表达文库使得人类基因组的各种基因分别在肿 瘤细胞株任意地过表达，肿瘤转移促进基因过表达细胞形成转移的能力大大增强。这样，在 对照细胞不能形成肿瘤转移的条件下，过表达文库处理的肿瘤细胞也形成了肺肿瘤。通过分 离肺肿瘤，并克隆肺肿瘤的过表达基因可以确定新的肿瘤转移促进基因。这一筛选的优点 是1、模拟了体内肿瘤转移的发生过程和环境；2、由于过表达升高肿瘤转移促进基因，有 利于肿瘤转移的形成，从而有利于筛选到肿瘤转移促进基因。缺点是过表达升高肿瘤转移抑 制基因后，不能形成肿瘤转移抑制基因失活引起的肿瘤转移，因而不利于筛选到肿瘤转移抑 制基因。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种利用免疫缺陷小鼠细胞在体移 植肿瘤转移模型比细胞模型更好地模拟肿瘤转移发生的优势，和RNA干扰文库使得人类基因 组的各种基因分别在肿瘤细胞株任意地降低表达的优势，进行筛选肿瘤转移抑制基因的方法。几年来，通过利用人类基因组的RNA干扰文库，结合免疫缺陷小鼠细胞异体移植模型发 明了一种肿瘤转移抑制基因筛选的新技术，并率先进行了尤文氏肉瘤(Ewing' s sarcoma) 细胞的肿瘤肺转移抑制基因筛选，确定了一批真正的肿瘤转移抑制基因。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，本发明利用免疫缺陷小鼠细胞在体移植肿 瘤转移模型比细胞模型更好地模拟肿瘤转移发生，利用RNA干扰文库使得人类基因组的各种 基因分别在肿瘤细胞株任意地降低表达，使得其中肿瘤转移抑制基因降低表达的细胞形成肿 瘤转移的潜能大大增强，这样，将RNA干扰文库处理的细胞注入免疫缺陷小鼠体内后，在对 照细胞不能形成肿瘤转移的条件下，肿瘤转移抑制基因降低表达的细胞可以形成肺肿瘤，通 过分离肺肿瘤，并克隆肺肿瘤内的降低表达基因可以确定并筛选新的肿瘤转移抑制基因。 本发明对所述肿瘤细胞进行如下表型筛选
a. 注入小量肿瘤细胞到免疫缺陷小鼠体内后，对照和RNA文库处理细胞都不形成肺肿 瘤；
b. 注入适量肿瘤细胞到免疫缺陷小鼠体内后，对照细胞不形成肺肿瘤，而RNA文库处理 细胞形成肺肿瘤；
c. 注入大量肿瘤细胞到免疫缺陷小鼠体内后，对照和RNA文库处理细胞都形成肺肿瘤， 两者相比较，RNA文库处理细胞形成更多肺肿瘤；
本发明对表型筛选后的肿瘤细胞进行如下候选基因的鉴定
a. 从存活下来的肿瘤内提取基因组DNA;
b. PCR扩增从RNA干扰文库中插入的DNA片段；
c. TA克隆法克隆PCR扩增的DNA片段；
d. 挑选克隆，纯化DNA;
e. 基因测序确定筛选基因。 本发明对筛选基因对肿瘤转移的影响作如下分析
a. 利用RNA干扰降低基因表达作Loss-of-function分析；
b. 利用过表达作Gain-of-function分析；
c. 利用生化实验分析筛选基因影响肿瘤转移的机制。 本发明对筛选基因在转移肿瘤内的状态作如下分析
a.检测筛选基因是否在转移肿瘤细胞和样品中突变；b. 检测筛选基因是否在转移肿瘤细胞和样品中低表达；
c. 检测筛选基因是否在转移肿瘤细胞和样品中被修饰，如甲基化等。 本发明的有益效果是从整个基因组水平筛选肿瘤转移抑制基因，并用于
(1) 进一步研究肿瘤转移的发生、发展及其作用机制；
(2) 发用此类基因作为肿瘤的生物标志，在诊断时，用于指导肿瘤治疗方案的制定；在诊 断之后，用于评估治疗效果和检测复发；
(3) 用做肿瘤靶向治疗的靶标，通过增强肿瘤转移基因的功能达到防止、治疗肿瘤转移的 目的。
具体实施例方式
本发明的主要技术内容是由于免疫缺陷小鼠细胞在体移植肿瘤转移模型比细胞模型更
好地模拟肿瘤转移发生，而RNA干扰文库使得人类基因组的各种基因分别在肿瘤细胞株任意
地降低表达，使得其中肿瘤转移抑制基因降低表达的细胞形成肿瘤转移的潜能大大增强，这
样，将RNA干扰文库处理的细胞注入免疫缺陷小鼠体内后，在对照细胞不能形成肿瘤转移的 条件下，肿瘤转移抑制基因降低表达的细胞可以形成肺肿瘤，通过分离肺肿瘤，并克隆肺肿 瘤内的降低表达基因可以确定新的肿瘤转移抑制基因。
本发明所具有的特征是
A、 与过去从离体细胞模型着手不同，从在体动物模型着手，更好地模拟了肿瘤转移发
生的过程；
B、 利用降低基因表达的RNA干扰文库，可以在哺乳细胞稳定地低表达各种基因。
本发明采用如下技术路线
A、 表型筛选
a. 注入小量肿瘤细胞到免疫缺陷小鼠体内后，对照和RNA文库处理细胞都不形成肺肿 瘤；
b. 注入适量肿瘤细胞到免疫缺陷小鼠体内后，对照细胞不形成肺肿瘤，而RNA文库处 理细胞形成肺肿瘤；
c. 注入大量肿瘤细胞到免疫缺陷小鼠体内后，对照和RNA文库处理细胞都形成肺肿 瘤，两者相比较，RNA文库处理细胞形成更多肺肿瘤；
B、 候选基因鉴定a. 从存活下来的肿瘤内提取基因组DNA;
b. PCR扩增从RNA干扰文库中插入的DNA片段；
c. TA克隆法克隆PCR扩增的DNA片段；
d. 挑选克隆，纯化DNA;
e. 基因测序确定筛选基因。
C、 分析筛选基因对肿瘤转移的影响
a. 利用RNA干扰降低基因表达作Loss-of-function分析；
b. 利用过表达作Gain-of-function分析；
c. 利用生化实验分析筛选基因影响肿瘤转移的机制。
D、 分析筛选基因在转移肿瘤内的状态
a. 检测筛选基因是否在转移肿瘤细胞和样品中突变；
b. 检测筛选基因是否在转移肿瘤细胞和样品中低表达；
c. 检测筛选基因是否在转移肿瘤细胞和样品中被修饰，如甲基化等。 实施例1
免疫缺陷小鼠尾静脉注射尤文氏肉瘤细胞TC71形成肿瘤肺转移是一种稳定、容易操 作、并被广泛应用的肿瘤转移研究模型。结合利用本发明技术，我们己经进行了尤文氏肉瘤 细胞的肿瘤肺转移抑制基因筛选，分别筛选到了一批尤文氏肉瘤细胞的肿瘤肺转移抑制基因
(另外申请产品专利)。以此为例介绍
具体实施例方式
一、利用RNA干扰文库DNA转染菲尼克思(Phoenix)反转录病毒包装细胞 第一天准备菲尼克思反转录病毒包装细胞
1、 转染之前18-24小时，按3xl07l0厘米平板接种菲尼克思细胞到平板上；
2、 让细胞贴壁10-24小时；
3、 当细胞密度达到2/3时， 一个10厘米平板大约有5xl(T细胞。这时的包装细胞最容 易转染并产生最高滴度的病毒37°C。
*培养基DMEM， 10%胎牛血清，1%青_链霉素，1%谷氨酰胺。 第二天转染
1、准备好转染用的DNA并溶解在HEPES溶液中；2、 转染之前大约5分钟，在平板中加入25微摩氯喹(氯喹的储藏浓度为50毫摩)； *氯喹通过中和胞内转运微泡内的pH而抑制溶酶体内的DNA酶；
3、 在一个15毫升的试管内，加入(以10厘米平板为例、室温条件) 20微克文库DNA和20微克辅助质粒DNA; 62.5微升2摩尔的氯化钙(手指轻弹混匀)；
加无菌双蒸水至500微升总体积。
4、 快速加入500微升2倍的HEPES缓冲液，然后利用全自动移液枪激烈吹气泡5-15
秒；
5、 转染之前大约5分钟，给包装细胞换已预热至、含终浓度25微摩氯喹的培养液9毫
升；
6、 20分钟之后，将HEPES/DNA混合液逐滴、快速加入平板。 注意
*在显微镜下观察，应该看到一些大小均一、分布均匀的细小黑色颗粒； *将平板放入37。C孵箱，前后左右轻轻转动平板使DNA/CaP04颗粒均匀分布； * HEPES购于Sigma (商品目录号:H-7006) *氯化钙购于Mallinkrodt (商品目录号H-4160)
*由于pH非常重要，可分别配制pH 6.95、 pH 7.00、 pH 7. 05的缓冲液进行测试； *使用之前将所有的试剂复苏到室温。
第三天转染后24小时，换液、准备好感染细胞TC71
1、 转染后24小时，给包装细胞换预热至37°C的培养液10毫升(不要让氯喹在培养液 中影响细胞超过24小时)；
2、 将感染靶细胞分盘，细胞密度为2xl06/10厘米平板，培养液DMEM， 10%胎牛血 清，1%青-链霉素，1%谷氨酰胺。
第四天转染后24小时，用含反转录病毒的上清感染耙细胞TC71
1、 用移液枪从转染后的包装细胞中吸取上清并置于15毫升的试管内，1500转/分钟离 心5分钟以除去细胞碎片；
2、 用0.45微米滤膜过滤；3、 从靶细胞培养板内吸除2毫升培养液；
4、 在靶细胞培养板内加入5微升polybrene (polybrene的1000倍储藏浓度为5毫克/ 毫升)，混匀；
5、 在靶细胞培养板内加入2毫升含反转录病毒的上清，置于32-37°C，轻轻混匀；
6、 每隔4-6小时进行重复感染。
第五天吸除含反转录病毒的上清感染后24小时吸除含反转录病毒的上清，加入新 鲜的培养基DMEM， 10%胎牛血清，1%青-链霉素，1%谷氨酰胺。并加入5微升puromycin (puromycin的1000倍储藏浓度为5毫克/毫升)筛选24小时。
二、 处理(表型筛选)
第六天感染后48小时(puromycin作用24小时)，靶细胞TC71可用于各种处理，进 行表型筛选。
1、 用胰酶消化收集感染靶细胞，并作成浓度不同的PBS悬液；
2、 选择6周龄大小SCID小鼠30只，分成三组，按0. 25、 0. 5、 lxl07200nl/只浓度分 别进行尾静脉注射RNA干扰文库处理细胞和对照细胞。
三、 挑肺肿瘤
6周后，利用C02杀死实验用鼠，打开胸腔取出肺脏，拍照后挑取肿瘤块。
四、 基因鉴定
1、 剪碎肿瘤块，利用Roche生产的High Pure PCR Template Preparation试剂盒(商 品目录号11796828001)从收集的肿瘤样品中提取基因组DNA;
2、 以基因组DNA为模板，通过PCR扩增插入细胞基因组DNA的RNA干扰文库特异片段
(1) 扩增引物
RNAi clone 1: 5， -gag ggc eta ttt ccc atg at-3， (20bp)
RNAi clone 2: 5， -gta ata cga etc act ata ggg cct ctt egg aga tea get tc-3， (41bp)
(2) PCR反应体系
H20 13. 0 pi
10xPCR Buffer 2. 5 pi25mM MgCl2 2. 0
2. 5mM dNTP 2. 0 pi
lOpM primer F2. 0 pi
10|aM Primer R 2. 0 |al
Taq 0. 5 pi
Template 1. 0 jul
Total 25. 0 pi
(3) PCR反应条件
1. 94。C 3:00
2. 94°C 0:15
3. 60°C 0:45
4. 72。C 2:00
5. Go to 2 35X
6. 72°C 4:00
7. 40C forever
(4) PCR反应结果在0.8%琼脂糖凝胶水平电泳，观察一0.6kb条带。
3、 利用Irwitrogen Life Technologies生产的T0P0 TA克隆试剂盒(商品目录号-K4600-01)将PCR扩增的插入细胞基因组DNA的RNA千扰文库特异片段克隆；
4、 挑选得到的克隆，置于含2毫升青霉素抗性的LB内，37T振荡培养16小时；
用Sigma-Aldrich生产的G匿Elute Plasmid Minipr印试剂盒(商品目录号:PLN350)提 取质粒；
5、 将质粒送测序公司测序，测序引物为反向M13;
6、 利用公用的NCBI Blast程序(http:〃blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)确定 基因；
对候选基因作生物信息学分析，了解基因的基本情况及其已知的功能。
12种肿瘤转移抑制基因被鉴定出来。
五、肿瘤转移抑制基因影响肿瘤转移的鉴定
1、分别构建肿瘤转移抑制基因的基于反转录病毒载体的RNA干扰和过表达质粒；2、 利用RNA文库同样的技术和步骤分别建立稳定的RNA干扰和过表达肿瘤细胞；
3、 检测各细胞的肿瘤转移能力
(1) 免疫缺陷小鼠细胞在体移植肿瘤转移模型检测
选择6周龄大小SCID小鼠20只，分成两组，按0. 5xl07200)al/只浓度分别进行尾静脉 注射稳定的RNA干扰肿瘤细胞和对照细胞，6周后，利用C02杀死实验用鼠，打开胸腔取出 肺脏，拍照、记数肿瘤数量和肿瘤块大小。实验组有更多的肺肿瘤形成，形成的肿瘤块体积 更大；
选择6周龄大小SCID小鼠20只，分成两组，按1. Oxl07200nl/只浓度分别进行尾静脉 注射稳定的过表达肿瘤细胞和对照细胞，6周后，利用C02杀死实验用鼠，打开胸腔取出肺 脏，拍照、记数肿瘤数量和肿瘤块大小。实验组有更少的肺肿瘤形成，形成的肿瘤块体积更 小。
(2) 正常小鼠细胞在体移植肿瘤转移模型检测
由于免疫缺陷小鼠细胞在体移植肿瘤转移模型不能模拟从肿瘤组织迁移出去这一起始步 骤，经免疫缺陷小鼠细胞在体移植肿瘤转移模型证实后，我们继续进行更严格的检测，即利 用正常健康小鼠，进行足底注射，然后观测自发肿瘤转移的发生。
选择6周龄大小C57BL/6小鼠20只，分成两组，按1. Oxl07200pl/只浓度分别进行足 底皮下注射稳定的RNA干扰肿瘤细胞和对照细胞，当肿瘤块达到100 mm3时，割除肿瘤块，4 周后利用C02杀死实验用鼠，打开胸腔取出肺脏，拍照、记数肿瘤数量和肿瘤块大小。实验 组有更多的肺肿瘤形成，形成的肿瘤块体积更大；
选择6周龄大小C57BL/6小鼠20只，分成两组，按2. 0xl07200(al/只浓度分别进行足 底皮下注射稳定的过表达肿瘤细胞和对照细胞，当肿瘤块达到100 mm3时，割除肿瘤块，4 周后利用C02杀死实验用鼠，打开胸腔取出肺脏，拍照、记数肿瘤数量和肿瘤块大小。实验 组有更少的肺肿瘤形成，形成的肿瘤块体积更小。
六、实验材料和仪器
1、 各种实验室常规仪器；
2、 细胞培养箱(Forma Scientific, Inc.,美国);
3、 超净工作台(Forma Scientific, Inc.,美国)；
4、 分光光度计(BIO-TEK INSTRUMENTS, Inc.,美国)；5、 Z1-颗粒计数器(BECKMAN COULTER,美国)；
6、 倒置显微镜(尼康，日本)；
7、 解剖显微镜(尼康，日本)；
8、 PCR仪(Bio-Rad，美国)。
权利要求
1、一种利用RNA干扰文库筛选肿瘤转移抑制基因的方法，该方法是利用免疫缺陷小鼠细胞在体移植肿瘤转移模型比细胞模型更好地模拟肿瘤转移发生，利用RNA干扰文库使得人类基因组的各种基因分别在肿瘤细胞株任意地降低表达，使得其中肿瘤转移抑制基因降低表达的细胞形成肿瘤转移的潜能大大增强，这样，将RNA干扰文库处理的细胞注入免疫缺陷小鼠体内后，在对照细胞不能形成肿瘤转移的条件下，肿瘤转移抑制基因降低表达的细胞可以形成肺肿瘤，通过分离肺肿瘤，并克隆肺肿瘤内的降低表达基因可以确定并筛选新的肿瘤转移抑制基因。
2、 根据权利要求1所述的利用RNA干扰文库筛选肿瘤转移抑制基因的方法，其特征在 于所述的肿瘤细胞进行如下表型筛选-a. 注入小量肿瘤细胞到免疫缺陷小鼠体内后时，对照和RNA文库处理细胞都不形成肺肿 瘤；b. 注入适量肿瘤细胞到免疫缺陷小鼠体内后时，对照细胞不形成肺肿瘤，而RNA文库处 理细胞形成肺肿瘤；c. 注入大量肿瘤细胞到免疫缺陷小鼠体内后时，对照和RNA文库处理细胞都形成肺肿 瘤，两者相比较，RNA文库处理细胞形成更多肺肿瘤；
3、 根据权利要求2所述的利用RNA干扰文库筛选肿瘤转移抑制基因的方法，其特征在 于所述的对表型筛选后的肿瘤细胞进行如下候选基因的鉴定a. 从存活下来的肿瘤内提取基因组DNA;b. PCR扩增从RNA干扰文库中插入的DNA片段；c. TA克隆法克隆PCR扩增的DNA片段；d. 挑选克隆，纯化DNA;e. 基因测序确定筛选基因。
4、 根据权利要求3所述的利用RNA干扰文库筛选肿瘤转移抑制基因的方法，其特征在 于所述的对筛选基因对肿瘤转移的影响作如下分析a. 利用RNA干扰降低基因表达作Loss-of-function分析；b. 利用过表达作Gain-of-function分析；c. 利用生化实验分析筛选基因影响肿瘤转移的机制。
5、根据权利要求3所述的利用RNA干扰文库筛选肿瘤转移抑制基因的方法，其特征在 于所述的对筛选基因在转移肿瘤内的状态作如下分析a. 检测筛选基因是否在转移肿瘤细胞和样品中突变；b. 检测筛选基因是否在转移肿瘤细胞和样品中低表达；c. 检测筛选基因是否在转移肿瘤细胞和样品中被修饰，如甲基化等。
全文摘要
一种利用RNA干扰文库筛选肿瘤转移抑制基因的方法，它是利用免疫缺陷小鼠细胞在体移植肿瘤转移模型比细胞模型更好地模拟肿瘤转移发生，利用RNA干扰文库使得人类基因组的各种基因分别在肿瘤细胞株任意地降低表达，使得其中肿瘤转移抑制基因降低表达的细胞形成肿瘤转移的潜能大大增强，这样，将RNA干扰文库处理的细胞注入免疫缺陷小鼠体内后，在对照细胞不能形成肿瘤转移的条件下，肿瘤转移抑制基因降低表达的细胞可以形成肺肿瘤，通过分离肺肿瘤，并克隆肺肿瘤内的降低表达基因可以确定并筛选新的肿瘤转移抑制基因；本发明从整个基因组水平筛选肿瘤转移抑制基因，并用于(1)进一步研究肿瘤转移的发生、发展及其作用机制；(2)发用此类基因作为肿瘤的生物标志，在诊断时，用于指导肿瘤治疗方案的制定；在诊断之后，用于评估治疗效果和检测复发；(3)用做肿瘤靶向治疗的靶标，通过增强肿瘤转移基因的功能达到防止、治疗肿瘤的转移的目的。
文档编号A61K49/00GK101455848SQ20091009526
公开日2009年6月17日 申请日期2009年1月5日 优先权日2009年1月5日
发明者罗如意, 黄行许 申请人:黄行许;宋建华