专利名称：用于局部施用和经皮肤递送肉毒杆菌毒素的组合物和方法
用于局部施用和经皮肤递送肉毒杆菌毒素的组合物和方法本申请要求于2005年3月3日申请的美国暂时专利申请案No. 60/658，434的优先权。美国专利申请No. 60/658，434在这里通过全文引入作为参考。
背景技术：
皮肤保护身体的器官免受外界环境威胁并用作维持体温的恒温器。它由几个不同的层组成，每一层具有专门的功能。主要的层包括表皮层、真皮层和皮下组织。表皮层是在真皮层上的分层的上皮细胞，真皮层由结缔组织组成。表皮层和真皮层都进一步由内层脂肪组织的皮下组织支持。表皮层(皮肤的最上层)只有0. 1-1. 5毫米厚(Inlander，Skin, New York, NY People' s Medical Society，1-7 (1998))。它由角质形成细胞组成并基于它们的分化状态分为若干层。表皮层可进一步分为角质层和有活力的表皮，表皮由颗粒状melphigian和基底细胞组成。角质层是吸湿性的并且需要至少10%重量的水分来维持它的弹性和软度。 吸湿性可部分地归因于角蛋白的持水能力。当角质层丧失它的软度和弹性时，它变得粗糙和易裂，导致干性皮肤。紧接在表皮层下面的真皮层为1.5-4毫米厚。它是皮肤的三层中最厚的层。另外，真皮层还是大部分皮肤结构的所在地，包括汗腺和脂腺(其通过皮肤中称为毛孔或粉刺的开口分泌物质)、毛囊、神经末梢，以及血液和淋巴管(Inlander，Skin, New York, NY People' sMedical Society，1-7 (1998))。但是，真皮层的主要成分是胶原蛋白和弹性蛋白。皮下组织是皮肤的最深层。它担当用于身体热量保存的隔热体并担当用于器官保护的减震器(Inlander, Skin, New York, NY =People' s Medical Society，1-7 (1998))。另外，皮下组织还存储脂肪用于能量储备。皮肤的PH通常在5和6之间。该酸度是由于存在两性氨基酸、乳酸，以及皮脂腺分泌的脂肪酸。术语“酸性外膜(acid mantle)”指在皮肤的大部分区域上水溶性物质的存在。皮肤的缓冲能力部分归因于皮肤角质层中储藏的这些分泌物。皮肤的其中一项主要功能是为可能对正常内环境稳定有害的水和物质的运输提供一个屏障。如果没有坚韧的、半渗透性的皮肤，身体将会迅速脱水。皮肤有助于防止有害物质进入身体。皱纹是衰老的一个指示迹象，可通过从环境损害积累的生物化学、组织学和生理学变化弓丨起(Benedetto, International Journal of Dermatology, 38 :641-655 (1999))。 另外，存在能引起面部皱纹的特征性褶、沟和皱褶的其它次要因素(Stegman等，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery,2nd ed. , St. Louis, MO :Mosby Year Book :5_15 (1990))。这些次要因素包括皮肤受到重力的持续拉力、频繁且持续的位置压力(即在睡觉过程中)，以及由面部肌肉收缩引起的重复的面部运动(Stegman等，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery,2nd ed. , St. Louis, MO Mosby Year Book :5-15 (1990))。已经采用不同的技术以可能减轻一些衰老迹象。这些技术从含有α羟酸和维生素A的面部增湿剂到手术操作以及注射神经毒素。例如，在1986年，Jean和Alastair Carruthers (由眼整形外科医师和皮肤科医师组成的夫妻团队)开始发展A型肉毒杆菌毒素的美容用途，用于处理眉间区域中与运动相关的皱纹(Schantz and Scott, In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum, New York :Academic Press,143-150(1981))。 Carruthers将A型肉毒杆菌用于处理皱纹的使用导致他们在1992年开创性地发表了该方法(Schantz and Scott,In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum,New York Academic Press，143-150 (1981))。到1994年，该小组报道了对面部上其它运动-相关皱纹的体验Gcott，Ophthalmol，87 1044-1049 (1980))。这接下来导致美容性A型肉毒杆菌处理时代的诞生。除了 A型肉毒杆菌(botul inum)，存在血清学相关但不同的7种其它的肉毒杆菌毒素。总的来说，肉毒杆菌毒素(也称为肉毒杆菌毒素或肉毒杆菌神经毒素)是通过革兰氏阳性细菌肉毒杆菌(Clostridium botul inum)产生的神经毒素。它们通过阻止突触传递或释放乙酰胆碱跨越神经肌接点来产生肌肉麻痹，并认为也可以以其它的方式起作用。它们的作用基本上阻断了通常会引起肌肉痉挛或收缩的信号，导致麻痹。在这8种血清学相关的肉毒杆菌毒素中，有7种能引起麻痹，即肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。这7种的每种通过类型特异性抗体的中和作用区分。但是，对于所有7种这些活性肉毒杆菌毒素血清型，肉毒杆菌毒素蛋白质分子的分子量都是约150kD。 正如通过细菌释放的，肉毒杆菌毒素是含有所讨论的150kD肉毒杆菌毒素蛋白质分子连同相关非毒素蛋白质的复合体。A型肉毒杆菌毒素复合体可由梭菌属细菌以900kD、500kD和 300kD的形式产生。B和C型肉毒杆菌毒素显然只作为700kD或500kD的复合体产生。D型肉毒杆菌毒素作为300kD和500kD的复合体产生。E和F型肉毒杆菌毒素只作为约300kD 的复合体产生。据认为所述复合体(即分子量大于约150kD)含有非毒素血凝素蛋白质以及非毒素且无毒的非血凝素蛋白质。在摄入毒素时，这两种非毒素蛋白质(其连同肉毒杆菌毒素分子一起构成了相关的神经毒素复合体)可用于提供对抗肉毒杆菌毒素分子变性的稳定性和当其被消化时保护其对抗消化性酸。另外，有可能较大的(大于约150kD分子量)肉毒杆菌毒素复合体可导致肉毒杆菌毒素以较慢的扩散速率离开肉毒杆菌毒素复合体的肌内注射位点。不同血清型的肉毒杆菌毒素在它们感染的动物种以及它们引起的麻痹的严重性和持续时间上不同。例如，如通过在大鼠中测量产生的麻痹速率，已经确定A型肉毒杆菌毒素比B型肉毒杆菌毒素有效500倍。另外，已经确定B型肉毒杆菌毒素在剂量为480U/ kg(约为A型肉毒杆菌毒素的灵长类LD5tl的12倍)时在灵长类中是无毒的。由于肉毒杆菌毒素的分子大小和分子结构，它不能够通过角质层和下面的皮肤结构的多个层。全身性肉毒杆菌毒素曝露引起的中毒症状(称为肉毒中毒)自古代以来就在欧洲存在。在1895年，Emile P. van Ermengem首次从生的咸猪肉分离出厌氧性产芽孢杆菌，所述的猪肉从在比利时死于肉毒中毒的猪的死后组织获得。Van Ermengem发现该疾病是由他所命名的肉毒芽孢杆菌产生的细胞外毒素引起(Van Ermengem, Z Hyyg Infektionskr, 26 1-56 ；Rev Infect (1897)) 该名称在1992年更改成肉毒杆菌。名称梭状芽孢杆菌用于反映这种微生物的厌氧特性以及它的形态特征(Carruthers和Carruthers，Can J Ophthalmol, 31 :389-400 (1996))。在20世纪20年代，在多次爆发食物中毒后粗产物形式的A型肉毒杆菌毒素得以分离。旧金山加利福尼亚大学的Herman Sommer博士第一次尝试纯化该神经毒素(Borodic 等，Ophthalmic Plast Recostr Surg，7 :54-60 (1991))。在 1964年，Edward J. Schantz博士和他的同事分离出结晶体形式的上述神经毒素(Schantz 等，In Jankovi J, Hallet M(Eds)Therapy with Botulinum Toxin, New York, NY :Marcel Dekker，41-49 (1994))。到1949年，Burgen和他的同事能够证明肉毒杆菌毒素阻断了跨越神经肌肉接点的神经冲动(Burgen 等，J Physiol, 109 10-24(1949)) 1973 年，Allan B. Scott首次在猴中使用肉毒杆菌毒素A(BTX-A)。Scott证明了持续3个月的可逆的眼肌麻痹(Lamanna, Science, 130 :763-772 (1959))。不久之后，报道了 BTX-A 是一种对人的斜视、脸痉挛和痉挛性斜颈的成功的疗法(Baron等，In =Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM(Eds), Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology, St. Louis, MO :Mosby Year Book,504-523 (1994) ；Carruthers 禾口 Carruthers，Adv Dermatol, 12 :325-348 (1997)； Markowitz, In :Strickland GT(Eds)Hunters Tropical Medicine, 7th ed.Philadelphia W. B. Saunders，441-444(1991))。A型肉毒杆菌毒素据说是人类已知的最致命性的天然生物制剂。肉毒杆菌的孢子在土壤中发现并能够在不正确消毒的且密封的食物容器中生长。 该细菌的摄入可导致肉毒中毒，这可能是致命的。同时，肉毒杆菌毒素的肌肉-麻痹效应已经用于治疗目的。肉毒杆菌毒素的受控施用已经用于提供肌肉麻痹来治疗病症，例如表征为机能亢进的骨骼肌的神经肌肉障碍。已经用肉毒杆菌毒素治疗的病症包括半侧面痉挛、成年型痉挛性斜颈、肛裂、脸痉挛、 脑性麻痹、宫口梗阻性难产、偏头痛、斜视、颞侧下颂关节障碍(temperomandibular joint disorder)，以及多种类型的肌肉痛性痉挛和痉挛。更近一些时候，已经利用肉毒杆菌毒素的肌肉-麻痹效应用于治疗性和美容性面部施用例如处理皱纹、皱眉引起的皱纹，以及面部肌肉痉挛或收缩的其它结果。考虑到肉毒杆菌毒素的毒性以及它的治疗用途潜力，开发用于安全施用该毒素的组合物和方法将是所期望的。肉毒杆菌毒素的局部施用因为下列原因而将会提供更安全且更理想的治疗备选方案施用的无痛性质、可覆盖的更大治疗表面积、制备具有更高比活性的纯毒素的能力、应用肉毒杆菌治疗所需训练的减少、产生理想效果所需的量更少，以及不需要大量毒素来达到治疗性的临床效果。用于经皮肤递送肉毒杆菌毒素的有效手段，以及用于施用肉毒杆菌毒素治疗或预防不需要注射的许多病症的有效手段因而是非常理想的。发明概述本发明涉及含有肉毒杆菌毒素的新的组合物，更特别涉及这样的组合物，其能够通过皮肤或上皮组织输送或递送(也称为“经皮肤递送”)肉毒杆菌毒素，并因此可局部施用来提供肉毒杆菌毒素给受试者，用于如在此描述的多种治疗、美容和/或美学目的。本发明的一方面是提供含有肉毒杆菌毒素和载体的组合物。该载体具有连接有带正电荷的分支基团的聚合主链。载体和肉毒杆菌毒素之间的连接是非共价的。本发明还提供了施用肉毒杆菌毒素给受试者的方法，该方法包括局部施用给受试者的皮肤或上皮组织与有效量载体结合的肉毒杆菌毒素。该载体具有连接有带正电荷的分支基团的聚合主链，并且与肉毒杆菌毒素非共价结合。本发明的另一个方面是提供制剂，所述的制剂含有肉毒杆菌毒素、带正电荷的主链，以及至少一种选自分配剂(partitioning agent)、寡聚-桥(oligo-bridge)和聚阴离子桥(polyanion bridge)的成员，这样肉毒杆菌毒素与带正电荷的主链非共价地复合。该制剂可用于通过施用制剂至皮肤区域来处理皱纹。如果需要，可在施用该制剂后施用遮蔽剂(occlusion agent)0本发明的制剂还可用于治疗多汗症。本发明考虑的治疗方法包括施用给皮肤区域本发明制剂以及随后任选施用遮蔽剂。本发明的另一方面是提供用于施用肉毒杆菌毒素给受试者的试剂盒。该试剂盒包含以用于其经皮肤递送的有效量存在的肉毒杆菌毒素，以及载体，所述载体具有连接有带正电荷的分支基团的聚合主链。载体和肉毒杆菌毒素之间的结合是非共价的。然而，本发明的另一方面是提供用于施用肉毒杆菌毒素给受试者的试剂盒。该试剂盒包含用于递送肉毒杆菌毒素至皮肤的装置和含有载体的组合物，所述载体具有连接有带正电荷的分支基团的聚合主链，所述的分支基团选自-(glyL-brg、、HIV-TAT及其片段，以及Antermapedia PTD，其中下标nl是0至约20的整数，并且下标n2独立地是从约5 至约25的奇整数。在一个方面，本发明涉及含有肉毒杆菌毒素(如在此定义的)和载体的组合物，所述载体包含具有带正电荷的分支或效应基团的带正电荷的“主链”，如在此描述的。最优选地，带正电荷的载体是长链带正电荷的多肽或带正电荷的非肽基聚合物，例如聚亚烷基亚胺。本发明进一步涉及用于通过局部施用有效量的这种组合物优选至需要这种治疗的受试者或患者的皮肤而产生生物效应的方法，所述的生物效应例如是肌肉麻痹、减少分泌过多或出汗、治疗神经性疼痛或偏头痛、减少肌肉痉挛、预防或减少粉刺，或者减少或增强免疫应答。本发明还涉及用于产生美容或美学效果的方法，例如通过局部施用肉毒杆菌毒素至面部而不是通过注射进面部肌肉。本发明还提供了用于制备或配制组合物的试剂盒，所述的组合物包含载体和肉毒杆菌毒素，以及产生可使用的制剂或可依次用于产生这种制剂的预混合物所需的另外的物质。备选地，该试剂盒包括用于分别施用，但是协同作用，施用肉毒杆菌毒素和载体给受试者的手段。附图简述

图1显示了一个实验的结果，该实验证明了用含有肽主链的本发明组合物经皮肤递送肉毒杆菌毒素的效力。图2是描述小鼠的后肢状态的照片，其中一个后肢区域用本发明的组合物处理， 而另一后肢区域用不含根据本发明的载体的另一种含有肉毒杆菌毒素的组合物处理。图3是描述在用Revance’ s肉毒杆菌制剂局部处理之前和之后受试者前额上的皱纹的照片。图4显示了(A)在用Revance’ s肉毒杆菌制剂局部处理皱纹之后以及(b)在处理之前前额的Mikrosil印迹(cast)。这些Mikrosil印迹清楚地显示未处理的一侧具有更深的皱纹，所述的Mikrosil印迹是有用的，因为它们使可能来自给真实受试者照相的人为因
素最小化。图5 图5显示描述在处理之前于受试者前额上进行的Minor’ s淀粉/碘试验的照片。图6 图6a显示描述在施用Revance’ s肉毒杆菌制剂(A)和对照制剂(B) 5天后Minor' s淀粉/碘试验的照片。对照制剂含有分子量约21，000并具有TAT分支基团的带正电荷的多聚赖氨酸主链。这些照片在施用2分钟后获得。图6b与图6a相同，除了它们在经过4分钟后获得以外。图7 显示在腋下多汗症试验中使用的给药区域。注意到，该给药区域的范围超过了腋毛覆盖的皮肤区域1厘米。图8 图8a显示了一个试验结果，该试验证明了肉毒杆菌毒素治疗人受试者的腋下多汗症的效力，所述的肉毒杆菌毒素作为使用短的肽基载体的局部用药剂治疗性地递送穿过完整的皮肤。该图描述了在用Botox加上短的肽基载体或单独用载体处理4周后按重量分析测量到的汗量(mg/5分钟)的显著减少。结果是作为与相同组基准值的比率的4 周的值，显著性通过Wilcoxon分析(P <0.05、N= 10个患者)测定。图8b显示了一个试验结果，该试验证明肉毒杆菌毒素治疗人受试者的腋下多汗症的效力，所述的肉毒杆菌毒素使用短的肽基载体作为局部用药剂治疗性地递送经过完整的皮肤。该图描述了在用 Botox加上短的肽基载体或单独用载体处理4周后按重量分析测量到的汗量(mg/5分钟) 的显著减少。结果是作为对两者时间点的对照值的比率的治疗值，其显著性通过Wilcoxon 分析(P < 0. 05、N = 10个患者)测定。图9显示了描述Minor’ s淀粉/碘试验的照片，所述试验在用Revance’ s肉毒杆菌制剂局部处理来治疗腋下多汗症之前和之后进行。显示了基线和2周时的淀粉碘试验， 其中受试者#12的右侧腋窝用Revance’ s肉毒杆菌制剂处理(a和c)而左侧腋窝施用对照 (b和d)。这些照片说明了在碘淀粉试验中用载体+botox处理后观察到的典型的效果。虽然在对照一侧上观察到一些交叉(与重量分析数据减少25%—致)，但是处理引起显著减少(与经处理的一侧的重量分析数据减少65%—致)。图11 在两个不同动物中局部施用无载体的肉毒杆菌毒素(a和c)或有KNR的肉毒杆菌毒素(b和d) 7天后，通过碘-淀粉染色法(深蓝色的为阳性)显示的小鼠足部汗的产生。图10 图10 (a)显示了在施用对照制剂给雄性OTl小鼠后的肌力(muscle force) 产生。图10(b)显示了在施用局部用“RevanceBotox溶液”后的肌力产生。图12 改良的Franz Chamber。(a)仪器装置，包括贮器、循环式水浴锅、在线蠕动泵、在线Franz chamber和级分收集器。(b)单个的Franz chamber的横截面，显示了输入管和输出管、皮肤膜，以及供体化合物的放置。图13 :K30T相对于对照样品的增加的流通量。(a)K30T对多聚赖氨酸(b)K30T对无载体。图14 在猪皮肤模型中Revance载体递送A型肉毒杆菌毒素穿过皮肤屏障的效力用改良的Franz chamber评估。显示了局部施用后增加的毒素流通量(图13a_f)。每个图描述了以不同载体毒素质量比递送穿过猪的皮肤的局部用毒素的平均值和标准误差百分比。图15 描述链霉抗生物素蛋白染色(蓝色为阳性)的代表性显微照片，所述的链霉抗生物素蛋白染色是在局部施用无载体的生物素化肉毒杆菌毒素(对照组，a-c)，或具有K30T载体的生物素化肉毒杆菌毒素(处理组，d-f)后进行。图16 该图显示了对于含有K15T2的NNX (处理组)、无载体的NNX (对照组)以及NNX注射肌力减少的百分比。图17 该图显示了在局部施用A型肉毒杆菌毒素后减少了前额的皱纹。人受试者 1在顶行并且受试者2在底端行。该图举例说明了处理前(基线)和处理后的状况。图18 比较了根据本发明的制剂和对照制剂的人的腋下多汗症试验。发明详述本发明提供了用于通过局部施用合适的制剂递送、尤其经皮肤递送肉毒杆菌毒素的组合物和方法。根据本发明，具有效应基团的带正电荷的载体分子，如在此描述的，已经发现适合作为肉毒杆菌毒素的运输系统，使得毒素能够经皮肤施用至肌肉和/或其它皮肤相关组织。运输发生，而无需共价修饰肉毒杆菌毒素。“带正电荷的”表示载体在至少一些液相条件下，更优选在至少一些生理学兼容的条件下带有正电荷。更优选地，如在此使用的，“带正电荷的”表示所考虑的基团含有在所有PH条件下带电荷的官能团，例如季胺，或者含有在某些液相条件下，例如在伯胺的情形中PH变化的条件下，可获得正电荷的官能团。更优选的，如在此使用的，“带正电荷的”指具有在生理学兼容条件下与阴离子缔合的行为的那些基团。具有多个带正电荷的部分的聚合物不必是均聚物，这对于本领域技术人员将是显而易见的。带正电荷的部分的其它实例是现有技术所熟知的并可容易地采用，这对于本领域技术人员将是显而易见的。一般而言，带正电荷的载体(也称为“带正电荷的主链”)通常是原子组成的直链， 其链中的基团在生理PH下带正电荷，或带正电荷的基团连接至从主链延伸的侧链上。优选地，带正电荷的主链自身将不具有确定的酶促活性或治疗性生物学活性。线性主链是烃主链，在一些实施方案中，其由选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子间插。大多数主链的原子通常是碳。另外，主链将通常是重复单位(例如，氨基酸、聚(乙烯氧基)、聚(丙烯胺)、聚亚烷基亚胺等)的聚合物但可以是杂聚物。在一组实施方案中，带正电荷的主链是其中许多胺氮原子作为携带正电荷的铵基(四-取代的)存在的聚丙烯胺。在另一个实施方案中，带正电荷的主链是非肽基聚合物，其可以是杂聚物或均聚物例如聚亚烷基亚胺，如聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺，分子量约10，000-2, 500, 000、优选约100，000-1, 800, 000,并且最优选约 500，000-1，400，000。在另一组实施方案中，主链已经连接有多个包含带正电荷的基团(例如铵基、吡啶钱、磷银、锍、胍基团(guanidinium)或amidinium基团)的侧链部分。该组实施方案中的侧链部分可沿主链间隔放置，间隔是一致的或可变的。另外，侧链的长度可以相似或不同。例如，在一组实施方案中，侧链可以是具有1-20个碳原子并在远端(远离主链)以上述带正电荷的基团之一结尾的直或分支的烃链。在本发明的所有方面，载体与生物活性制剂之间的结合是通过非共价相互作用，其非限制性实例包括离子相互作用、氢键结合、范德华力或其组合。在一组实施方案中，带正电荷的主链是具有多个带正电荷的侧链基团(例如赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)的多肽。优选地，该多肽的分子量为约 10，000-1，500，000，更优选约 25，000-1，200，000，最优选约 100，000-1，000，000。本领域的技术人员将理解，当氨基酸用于本发明的这个部分时，在连接的中心，侧链可具有D-或L-型(R或S构型)。备选地，主链可以是多肽的类似物例如类肽(ρ印toid)。 参见，例如 Kessler，Angew. Chem. Int. EcL Engl. 32 :543(1993) ;Zuckermann 等，Chemtracts-Macromol. Chem. 4 :80(1992) MR Simon 等’ Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 89 9367(1992))。简而言之，类肽是其中侧链连接至主链氮原子而不是α-碳原子的多聚甘氨酸。同上，一部分侧链通常将会以带正电荷的基团结尾以提供带正电荷的主链成分。类肽的合成在例如美国专利No. 5，877，278中描述，其在这里通过全文引入作为参考。如在此使用的术语，具有类肽主链结构的带正电荷的主链认为是“非肽”的，因为它们不是由在α -碳位置具有天然存在的侧链的氨基酸组成。可使用多种其它主链，例如采用其中肽的酰胺键用代用品例如酯键、硫代酰胺(-CSNH-)、反向的硫代酰胺(-NHCS-)、氨基亚甲基(-NHCH2-)或反向的亚甲基氨基(-CH2NH-)基团、酮-亚甲基(-COCH2-)基团、次膦酸酯(-PO2RCH2-)、膦酰胺(phosphonamidate)和膦酰胺酯(phosphonamidate ester) (-PO2RNH-)、反向的肽(-NHC0-)、反式-烯基(-CR = CH-)、氟代烯(-CF = CH-)、二亚甲基(-CH2CH2-)、硫醚(-CH2S-)、羟基亚乙基(-CH (OH) CH2-)、亚甲基氧基(-CH2O-)、四唑(CN4)、磺酰氨基 (-SO2NH-)、亚甲基磺酰氨基(-CHRSO2NH-)、反向的磺酰胺基(-NHSO2-)替换的多肽的空间或电子模拟物，以及具有丙二酸酯和/或偕-二氨基-烷基亚单位的主链，例如，通过 Fletcher等人综述的((1998)Chem. Rev. 98 :763)以及通过其中引用的参考文献详细描述的。许多前述的取代产生相对于由α-氨基酸形成的主链近似等排的聚合物主链。在上面提供的每个主链中，可以添加携带带正电荷的基团的侧链基团。例如，磺酰胺-连接的主链(-SO2NH-和-NHSO2-)可具有连接至氮原子的侧链基团。类似地，羟基乙烯基(-CH(OH)CH2-)键可具有连接至羟基取代基的侧链基团。本领域技术人员可容易地修改其它键化学来用标准合成方法提供带正电荷的侧链基团。在一个实施方案中，带正电荷的主链是具有分支基团(也称为效应基团)的多肽。 如在此使用的，效应基团或分支基团是具有促进带正电荷主链运送通过组织或细胞膜的效果的任何物质。所述分支或效应基团的非限制性实例包括-(glyhdardfHIV-TAT或其片段，或Antermapedia的蛋白质转导结构域，或其片段，其中下标nl是0-20，更优选0_8， 依然更优选2-5的整数，并且下标n2独立地是约5-25，更优选约7-17，最优选约7_13的奇整数。更进一步优选的是其中HIV-TAT片段具有式(gly^RGRDDRRQRRlHgly),、(gly) p-YGRKKRRQRRR-fely),或(gly^-RKKRRQRRR-fely),的那些实施方案，其中下标 ρ 禾Π q 各自独立地是从0-20的整数并且所述片段经由该片段的C-端或N-端连接至主链。优选的 HIV-TAT片段是其中下标ρ和q各自独立地是0-8，更优选2-5的整数。在另一个优选的实施方案中，带正电荷的侧链或分支基团是AntermapediWAntp)的蛋白质转导结构域(PTD)， 或其保留活性的片段。优选地，带正电荷的载体包含侧链带正电荷的分支基团，所述分支基团的量为总载体重量的至少约0. 05%，优选约0. 05-45%重量，并且最优选约0. 1-30%重量。对于具有式(glyL-brg)^的带正电荷的分支基团，最优选的量是约0.1-25%。在另一个实施方案中，主链部分是多聚赖氨酸并且带正电荷的分支基团连接至赖氨酸侧链的氨基酸。多聚赖氨酸可具有的分子量为约10，000-1，500，000，优选约 25，000-1, 200, 000,并且最优选约100，000-1, 000, 000。其可以是任何可商业获得的(Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA)多聚赖氨酸，例如 MW > 70, 000 的多聚赖氨酸、MW为70，000-150, 000的多聚赖氨酸、MW为150，000-300, 000的多聚赖氨酸以及MW > 300, 000的多聚赖氨酸。合适的多聚赖氨酸的选择将取决于组合物的剩余部分，并将足以总体提供净正电荷给组合物并提供优选为带负电荷成分的组合长度的1-4倍的长度。优选的带正电荷的分支基团或效应基团包括，例如-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg (-Gly3Arg7)或HIV-TAT。在另一个优选的实施方案中，带正电荷的主链是长链的聚亚烷基亚胺例如聚乙烯亚胺，如分子量为约1，000, 000的聚乙烯亚胺。包含多肽或聚亚烷基亚胺的带正电荷的主链或载体分子是新的化合物并形成本发明的一个方面，所述的主链或载体分子具有上述分支基团。在本发明的一个实施方案中，仅具有带正电荷的分支基团的带正电荷的载体是经皮肤递送肉毒杆菌毒素所需的。在特定的实施方案中，带正电荷的载体是具有多个带正电荷的侧链基团的多肽(如赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)，如上描述的。优选地，所述多肽分子量至少为约10，000。在另一个实施方案中，带正电荷的载体是非肽基聚合物例如分子量至少约100,000的、具有多个带正电荷的侧链基团的聚亚烷基亚胺。这种聚亚烷基亚胺包括聚乙烯-和聚丙烯亚胺。在任一情况中，为了用作经皮肤递送唯一需要的制剂，带正电荷的载体分子包含带正电荷的分支或效应基团，包括-(gly) nl- (arg) n2、HIV-TAT或其片段，或者Antermapedia PTD或其片段，其中下标nl是0_20，更优选0_8，更优选2_5的整数，并且下标n2独立地是约5-25，更优选约7-17，并且最优选约7_13的奇整数。优选地，所述侧链或分支基团具有如上描述的通式-(glyL-brg)^。其它优选的实施方案是其中分支或效应基团是具有式(gly^-RGRDDRRQRRR-fely),、(gly^YGRKKRRQRRR-fely),或(gly) p-RKKRRQRRR-fely),的HIV-TAT片段的那些，其中下标ρ和q各自独立的是0_20的整数并且所述片段通过该片段的C-端或N-端连接至载体分子。在连接中心，侧链的分支基团可具有D-或L-型(R或S构型)。优选的HIV-TAT片段是其中下标ρ和q各自独立地是0_8， 更优选2-5的整数的那些。其它优选的实施方案是其中分支基团是Antermapedia PTD基团或其保持该基团活性的片段的那些。这些在本领域例如从Console等，J. Biol. Chem. 278 35109(2003)得知。优选地，带正电荷的载体包含侧链带正电荷的分支基团，所述分支基团的量是总载体重量的至少约0. 05%，优选约0. 05-45%重量，并且最优选约0. 1-30%重量。 对于具有式_(gly)nl-(arg)n2的带正电荷的分支基团，最优选的量是约0. 1-25%。在另一个实施方案中，载体是具有带正电荷的分支基团的多聚赖氨酸，所述的分支基团连接至赖氨酸侧链氨基上。在该特定实施方案中使用的多聚赖氨酸可以是任何可商业获得的(例如 Sigma Chemical Company, St. Louis,Missouri,USA)多聚赖氨酸，例如 MW > 70，000的多聚赖氨酸、MW为70，000-150，000的多聚赖氨酸、MW为150，000-300，000的多聚赖氨酸以及MW > 300,000的多聚赖氨酸。然而，优选多聚赖氨酸具有至少约10，000 的MW。优选的带正电荷的分支基团或效应基团包括例如-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg (-Gly3Arg7)、HIV-TAT 或其片段，以及 Antermapedia PTD 或其片段。在本发明的另一个实施方案中，载体是相对短的多聚赖氨酸或聚乙烯亚胺(PEI) 主链(其可以是直链的或分支的)并且其具有带正电荷的分支基团。这些载体可用于使治疗组合物中主链和肉毒杆菌毒素不受控制的集聚最小化，该集聚导致运输效率急剧降低。 当载体是相对短的直链多聚赖氨酸或PEI主链时，该主链将具有低于75，000,更优选低于 30，000，并且最优选低于25，000的分子量。然而，当载体是相对短的分支的多聚赖氨酸或 PEI主链时，主链将具有低于60，000，更优选低于55，000，并且最优选低于50，000的分子量。但是，如果如在此描述的分配剂包含于组合物中，则所述分支的多聚赖氨酸和PEI主链的分子量可达到75，000，而直链多聚赖氨酸和PEI主链的分子量可达到150，000。如在此描述的，术语“肉毒杆菌毒素”意指通过细菌或通过重组技术产生的任何已知类型的肉毒杆菌毒素，以及可随后发现的任何类型包括基因工程变体或融合蛋白。如上面提及的，目前，已经鉴定了 7种免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素，即肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，它们的每种通过用类型-特异性抗体中和来区分。肉毒杆菌毒素血清型可从 Sigma-Aldrich 禾口 Metabiologics, Inc. (Madison, Wisconsin)以及从其它来源商业获得。不同血清型的肉毒杆菌毒素在它们影响的动物种以及它们引发的麻痹的严重性和持续时间方面不同。至少两种类型的肉毒杆菌毒素(A型和B型)可商业获得用于治疗某些病症的制剂。例如，A型包含于商标为BOTOX 的Allergan制剂和商标为 DYSP0RT 的Ipsen制剂中，而B型包含于商标为MY0BL0C 的Elan制剂中。本发明组合物中使用的肉毒杆菌毒素可备选地是肉毒杆菌毒素衍生物，S卩，具有肉毒杆菌毒素活性但相对于天然存在的或重组天然肉毒杆菌毒素在任意部分或任意链上含有一个或多个化学或官能改变的化合物。例如，肉毒杆菌毒素可以是经修饰的神经毒素(例如，与天然的或重组产生的神经毒素或其片段或衍生物比较，具有至少一个它的氨基酸缺失、修饰或取代的神经毒素)。例如，肉毒杆菌毒素可以是已经以例如增强它的特性或减少不期望的副作用，但仍然保留期望的肉毒杆菌毒素活性的方式修饰了的肉毒杆菌毒素。肉毒杆菌毒素可以是由细菌产生的任何肉毒杆菌毒素复合体，如上面描述的。备选地，肉毒杆菌毒素可以是用重组或合成化学技术制备的毒素(例如，从不同肉毒杆菌毒素血清型的亚基或结构域制备的重组肽、融合蛋白或杂合神经毒素(例如，参见美国专利 6，444，209))。肉毒杆菌毒素还可以是已经显示具有必需的肉毒杆菌毒素活性的整个分子的一部分，并且在这种情形中可以本身或作为组合物或缀合分子(例如融合蛋白)的部分使用。另外，肉毒杆菌毒素可以是肉毒杆菌毒素前体的形式，其自身可以是无毒的，例如无毒锌蛋白酶，其在溶蛋白性裂解后变成有毒。本发明还考虑肉毒杆菌毒素的组合物和混合物的一般使用，虽然由于它们不同的本质和特性，肉毒杆菌毒素血清型的混合物通常不会在医疗保健或化妆品工业中同时施用。本发明的组合物优选是施用至受试者或患者(即需要该特定治疗的人或其它哺乳动物)的皮肤或上皮组织的产品形式。术语“需要”表示包括药学或健康相关的需要， 例如治疗涉及不期望的面肌痉挛的病症，以及美容和主观需要，例如改变或改善面部组织的外观。通常，组合物通过将肉毒杆菌毒素与载体，并通常与一种或多种另外的可药用载体或赋形剂混合制备。在它们的最简单形式中，它们可包含简单的含水可药用载体或稀释剂，例如缓冲盐水。然而，组合物可包含局部用药物组合物或化妆品组合物中典型的其它成分，包括皮肤学或药学上可接受的载体、赋形物或介质(即与它们将施用的组织相兼容的载体、赋形物或介质)。如在此使用的，术语“皮肤学或药学上可接受的”表示所描述的组合物或其成分适合用于与这些组织接触或适合用于患者，通常没有过度毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答等。如果合适，本发明的组合物可包含在所考虑领域中，并且尤其在美容学和皮肤病学中常规使用的任何成分。组合物还可以包含一些小的阴离子，优选多价阴离子，例如磷酸盐、天冬氨酸盐或柠檬酸盐。关于它们的形式，本发明组合物可包括用于施用至皮肤和可使用该组合物的其它组织的溶液剂、乳剂(包括微乳剂)、混悬剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、粉剂或其它典型的固体或液体组合物。除肉毒杆菌毒素和载体外，这些组合物还可包含通常用于这种产品的其它成分，例如抗微生物剂、增湿剂和水合剂(hydration agents)、穿透剂、防腐剂、乳化剂、天然或合成油脂、溶剂、表面活性剂、去污剂、润肤剂、抗氧化剂、芳香剂、充填剂、增稠剂、蜡、 气味吸收剂、染料、着色剂、粉剂，并任选包括麻醉剂、止痒添加剂、植物提取物、调节剂、遮光或发光剂、闪光剂、保湿剂、云母(mica)、矿物质、多酚类、硅酮或其衍生物、防晒霜、维生素，以及植物药物。在特别优选的实施方案中，组合物包含凝胶剂和/或粘度修饰剂。通常加入这些制剂来增加组合物的粘度，以便使得组合物的施用更容易且更精确。另外，这些制剂有助于防止含水的肉毒杆菌毒素/载体溶液剂干燥，干燥将会导致肉毒杆菌毒素的活性降低。特别优选的制剂是不带电的且不会干扰肉毒杆菌毒素活性或毒素-载体复合物在跨越皮肤中的效力的那些制剂。凝胶剂可以是某些基于纤维素的凝胶剂，例如羟丙基纤维素(HPC)。 在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素/载体复合物配制成具有2-4% HPC的组合物。备选地， 含有肉毒杆菌毒素/载体复合物的溶液剂的粘度可以通过加入聚乙二醇(PEG)改变。在其它实施方案中，肉毒杆菌毒素/载体溶液剂与预混合的粘稠剂例如Cetaphi 1 增湿剂组合。本发明的组合物可任选包含分配剂。如在此使用的，“分配剂”是具有防止或最小化肉毒杆菌毒素与本发明载体的不期望或不受控制的集聚的任何物质或添加剂。分配剂可例如在由于体积限制而必须采用浓缩的肉毒杆菌毒素溶液剂时是有用的。在这些情形中， 分配剂使肉毒杆菌毒素保持分散，从而防止该毒素聚集，否则在没有分配剂时将会发生聚集。通常，分配剂是(1)无刺激性的、( 不会破坏肉毒杆菌毒素、C3)不会使渗透性有任何增加、(4)提供可靠且稳定的粒度、( 是不带电的，以及(6)不会干扰毒素和经皮肤载体的复合物。合适的分配剂的实例是乙醇(EtOH)。在优选的实施方案中，EtOH少于组合物的 20%，并且最优选少于组合物的5%。作为实例，如果体积限制要求重构100U肉毒杆菌毒素于0. 5ml，而不是2. 5ml溶液中，通常观察到肉毒杆菌毒素将会显示出不期望的集聚，并因此降低了活性。然而，通过加入的KOH作为分散剂，甚至在该浓度下M小时后仍保持完全的活性。作为另一个实例，Botox 以1.0ml 0. 9% NaCl重构具有完全活性，而以0.5ml在和5% KOH加上 0.9% NaCl中重构产生具有完全活性的溶液剂。在本发明的某些实施方案中，将寡聚-或聚阴离子桥加入至肉毒杆菌毒素组合物中以提高毒素与带正电荷的主链载体的复合。正如本领域所熟知的，肉毒杆菌毒素实际上是不同蛋白质的复合物，这些蛋白质的一些是带正电荷的，而一些是带负电荷的。因为毒素成分的确切比例取决于毒素来源而不同，所以有可能来自某些来源的肉毒杆菌毒素具有较低的与在此描述的带正电荷的主链复合的倾向。然而，本发明的一方面是发现，通过加入寡聚-或聚阴离子桥至这类肉毒杆菌毒素，局部施用的功率和效力显著增加。这种寡聚_/聚阴离子桥的合适的实例包括磷酸钠(5% ) ,PBS或5%聚-L-天冬氨酸(例如MW为3000)。根据本发明的组合物可以是控制释放或持续释放组合物的形式，其中肉毒杆菌毒素和载体包封于或以别的方式包含于一种物质中，这样它们以控制的方式在一段时间内释放至皮肤上。肉毒杆菌毒素和载体可以包含于基质、脂质体、小囊泡、微胶囊、微球等中，或包含于固体颗粒材料中，选择和/或构建所有上述物质用以使得肉毒杆菌毒素随时间过去释放。肉毒杆菌毒素和载体可以在一起封装(例如，在相同胶囊中)或分开封装(在单独的胶囊中)于胶囊中。使用在此描述的组合物，肉毒杆菌毒素可以以有效量递送至皮肤下面的肌肉，或递送至皮肤内部的腺结构来产生麻痹、产生松弛、减少收缩、防止或减轻痉挛、减少腺的排出量或产生其它期望效果。相对于可注射或可植入材料，以这种方式局部递送肉毒杆菌毒素能使剂量减少、减小毒性并使得能进行更精确的剂量优化来获得理想的效果。施用本发明的组合物以便施用有效量的肉毒杆菌毒素。如在此使用的，术语“有效量”表示如上定义的肉毒杆菌毒素的量，该量足以产生期望的肌肉麻痹或其它生物学或美学效果，但是隐含它是安全剂量，即足够低而能避免严重副作用的量。期望的效果包括松弛某些肌肉，为了例如减少特别是脸上的细纹和/或皱纹的出现，或以其它方式例如使眼睛变宽、提升嘴角、或使从上唇散开的皱纹平滑，或一般性解除肌紧张来调整外观。最后提及的效果(一般性解除肌紧张)可在面部或其它部位实现。本发明组合物可包含合适的有效量的肉毒杆菌毒素用于作为单剂量处理施用，或者可以是更加浓缩的，用于在施用处稀释或用于多次施用。通过使用根据本发明的带正电荷的载体，肉毒杆菌毒素可以经皮肤施用给受试者用于治疗病症例如不期望的面肌或其它肌肉痉挛、多汗症、痤疮或其中肌肉疼痛或痉挛的缓解是所期望的身体其它部位的病症。肉毒杆菌毒素经局部施用来经皮肤递送至肌肉或其它皮肤-相关结构。施用可在例如腿、肩、背(包括下背)、腋窝、掌、足、颈、腹股沟、 手背或脚背、肘、上臂、膝、大腿、臀、躯干、骨盆或期望施用肉毒杆菌毒素的身体的任何其它部位进行。还可以施用根据本发明的肉毒杆菌毒素制剂用于治疗其它病症，包括治疗神经疼痛、预防或减少偏头痛或其它头痛、预防或减少痤疮、预防或减少张力障碍或张力障碍性收缩(主观的或临床的)、预防或减少与主观性或临床多汗症相关的症状、减少分泌过多或出汗、降低或增强免疫应答、或治疗已经建议或实施通过注射施用肉毒杆菌毒素的其它病症。还可施用在此描述的肉毒杆菌毒素或其它治疗性蛋白质用于免疫-相关目的。令人惊讶的是，可以施用在此描述的肉毒杆菌毒素用于减少免疫应答。更具体地说，本发明使得肉毒杆菌毒素能通过改变的施用途径递送，从而改变制剂的复合抗原的呈递。以这种方式，本发明可用于减少对肉毒杆菌毒素抗原的免疫应答，并便于重复施用而没有免疫-相关的活性减少。备选地，可制备并局部施用复合物来增强免疫应答，例如提供关于多种蛋白质的免疫，例如，用于儿童免疫而无需注射。对于与免疫-相关活性相关的使用，“有效量” 指足以使受试者在施用或一系列施用肉毒杆菌毒素后产生对它的免疫应答的肉毒杆菌毒素的量。最优选地，组合物由或在医师或其它保健专家的指导下施用。它们可以以单次处理或在一段时间内以一系列周期性处理施用。为了经皮肤递送肉毒杆菌毒素用于上述目的，将如上描述的组合物局部施用至期望产生效果的一个位置或多个位置的皮肤上。在将含水的肉毒杆菌毒素/载体溶液剂直接施用至皮肤的实施方案中，优选覆盖接受治疗的区域(例如用Cetaphi 1 增湿剂)或用屏蔽物(例如Telfa)遮蔽受治疗的区域，以便防止溶液干燥，溶液干燥将会导致毒素活性减少。由于它们的性质，最优选地，施用的肉毒杆菌毒素的量应该小心应用，以将产生期望效果而不会产生任何不利或不期望结果的施用比率和施用频率施用。因此，例如，本发明的局部用组合物应该以每cm2皮肤面积约1U-20，000U, 优选约1U-10，000U肉毒杆菌毒素的比率施用。这些范围内的较高剂量可优选与控制释放材料一起使用，例如，或者使在去除前在皮肤上停留时间更短。在施用肉毒杆菌毒素/载体组合物之前适当处理皮肤表面对于保持该溶液剂的效力是重要的。例如，在皮肤表面引入表面活性剂以在施用前除去皮肤上的表面油脂令人惊讶地是起反作用的，因为表面活性剂似乎破坏了肉毒杆菌毒素活性。即使随后在施用肉毒杆菌毒素/载体溶液剂前用水多次洗涤皮肤，这也会发生。甚至极其温和的表面活性剂， 例如在婴儿擦剂中的那些，看起来也引起了这种现象。因此，在施用本发明组合物的优选方法中，皮肤仅用清水预先清洗。仅用水清洗看来还适度地提高了肉毒杆菌毒素的经皮肤运输。另外，可在施用肉毒杆菌毒素/载体复合物之前剥离皮肤以减少角质层。原则上， 剥离皮肤的过程应该导致经皮肤运输肉毒杆菌毒素的效力增强。然而，用于剥离皮肤的方法是重要的。例如，丙酮-介导的人或动物中角质层的减少看起来减少了随后施用的肉毒杆菌毒素的活性。比较而言，胶带剥脱(即将胶带粘在皮肤表面并随后移除胶带)看起来使得肉毒杆菌毒素在小鼠模型和人中都能更深渗透并使剂量减少。据推测皮肤表面的磨损 (例如通过使用磨擦垫(abrasive pads))将会引起与胶带剥脱类似的效果。本发明还包括用于经皮肤递送含有肉毒杆菌毒素和载体的组合物的装置，所述载体具有如在此定义的连接有分支基团的带正电荷的主链。这种装置在结构上可与皮肤贴剂一样简单，或者可以是更复杂的装置，包括用于投放和监控组合物投放的手段，以及任选用于监控受试者状态(例如，监控受试者对投放的物质的反应)的手段。应该注意的是，用于构建该装置的材料的选择是重要的。用于构建递送装置的优选材料是不会通过降解或装置表面对肉毒杆菌毒素不期望的吸收而导致肉毒杆菌毒素/ 载体溶液剂活性丧失的那些材料。这种不期望的行为已经在例如当含水溶液剂中的肉毒杆菌毒素/载体接触聚丙烯表面时观察到，但是在肉毒杆菌毒素/载体接触聚氯乙烯(PVC) 表面时未观察到。—般而言，组合物可以预先配制和/或预先安装于装置中或者可以稍后制备，例如使用试剂盒，该试剂盒保存有分开的两种成分(肉毒杆菌毒素和载体)但提供了用于在施用时或施用前将它们混合的手段。载体分子的量或它与肉毒杆菌毒素的比率将取决于选择哪种载体用于所考虑的组合物。在给出的情况中，合适的载体分子的量或比率可容易地确定，例如通过进行一个或多个实验，例如在下面描述的那些试验确定。—般而言，本发明还包括用于施用肉毒杆菌毒素至需要它的受试者或患者的方法。该方法包括局部施用与载体一起的有效量的肉毒杆菌毒素，所述载体具有连接有带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，如在此描述的。“和...一起”表示两种成分(肉毒杆菌毒素和载体)在组合程序中施用，其可包括将它们组合为一种随后施用给受试者的组合物，或者将它们分开施用，但是以它们共同起作用以提供所需要的有效量的治疗性蛋白质的递送的方式施用。例如，可首先施用含有载体的组合物至受试者的皮肤，之后应用含有肉毒杆菌毒素的皮肤贴剂或其它设备。肉毒杆菌毒素可以以干燥形式整合进皮肤贴剂或其它投药装置中，同时带正电荷的载体可以在施用贴剂之前施用至皮肤表面以便两者共同起作用，产生期望的经皮肤递送。因此，这两种物质(载体和肉毒杆菌毒素)联合作用或者可能相互作用而在原位形成组合物或复合物。因此，本发明也包括一种试剂盒，该试剂盒包括用于经由皮肤分配肉毒杆菌毒素的装置以及含有载体或主链的液体、凝胶剂、乳剂等，并且该试剂盒适合应用于受试者的皮肤或上皮组织。用于在保健专家指导下或者通过患者或受试者施用本发明组合物的试剂盒还可以包括适合该目的的定制的涂药器(applicator)。本发明的组合物、试剂盒和方法使得能递送具有更高比活性的纯的肉毒杆菌毒素并潜在地改善了药物动力学。另外，载体可用作减少对外来辅助蛋白(例如，400-600mg的人血清白蛋白或250-500mg的重组血清白蛋白)和/或多糖稳定剂的需要的稳定剂，并可有利地减少了对内毒杆菌毒素的免疫应答。另外，组合物适合在PH约4. 5至约6. 3的生理环境中使用，并因此可具有该PH值。根据本发明的组合物可以在室温下或在冷藏条件下存储。下面是本发明的代表性实施例。它们展示了功能性肉毒杆菌神经毒素复合物跨越皮肤的递送，而不需要共价修饰要递送的神经毒素。
实施例实施例1用Revance肽基载体体内运输肉毒杆菌毒素。该试验展示了 相对于对照，在单次施用后，使用肽基载体转运含有完整的标记蛋白质肉毒杆菌毒素的大复合物穿过完整的皮肤。主链选择带正电荷的主链通过缀合-Gly3Ai^7至多聚赖氨酸(MW 112，000)以18%的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18个与-Gly3Ai^7缀合)装配，该缀合是通过末端甘氨酸与赖氨酸侧链的游离胺结合。所述经修饰的主链称为“KNR”。对照聚阳离子是相同大小且来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸(称为“K”，Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO)。治疗剂:选择Botox 商标的A型肉毒杆菌毒素(Allergan)用于该试验。它具有约 150,000的分子量。样品的制备根据生产商的说明书重构肉毒杆菌毒素。将一等分试样的蛋白质用经计算的 12-倍摩尔过量的硫-NHS-LC生物素(Pierce Chemical)进行生物素化。标记产物称为 “Btox-b”。在所有情形中，过量的聚阳离子用来装配最终的复合物，所述最终复合物如在递送高负电性的大的核苷酸复合物时具有过量的正电荷。净中性或净正电荷防止蛋白质复合物受到高度负电性细胞表面蛋白聚糖和细胞外基质的排斥。对于所有组将Btox-b剂量标准化，同样对要局部施用的组合物的总体积和终PH值标准化。如下制备样品“ JMW-7”组将每等分试样2. 0单位的Btox_b (即总量为20U)和肽基载体KNR以计算的MW比例4 1混合至均勻，并用磷酸盐缓冲盐水将其稀释成200微升。将得到的组合物与1.8ml Cetaphi 1 乳剂混合至均勻并等分成200微升的等份。“ JMW-8”组将每等分试样2. 0单位的Btox_b (即总量为20U)和K以计算的漏比例4 1混合至均勻，并用磷酸盐缓冲盐水将其稀释至200微升。将得到的组合物与1.8ml Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。用于在用肽基载体和标记Btox单次处理后测定经皮肤递送效率的动物实骑:在实施处理过程中，将动物通过吸入异氟烷麻醉。在麻醉后，让C57 black 6小鼠 (每组η = 4)接受局部施用定量的200微升剂量的合适治疗物，所述治疗物施用至头颅部分的背后面皮肤(选择此处是因为小鼠不能用嘴或四肢触及该区域)。动物不进行脱毛。 在初次处理30分钟后，将小鼠通过吸入(X)2安乐死，并由进行该盲法试验的观察者获取完整厚度的受处理的皮肤部分。将受处理部分分成三等份；将头颅部分固定在10%中性缓冲的福尔马林中12-16小时，随后存储于70%乙醇中直到进行石蜡包埋。将中间部分快速冷冻，将其直接用于由进行该盲法试验的观测者按下面概述的进行生物素显影。将受处理的近尾部分速冻用于溶解研究。生物素显影如下进行。简而言之，将每个切片浸入NeutrAvidin 缓冲液中1小时。为了显影碱性磷酸酶活性，将横切片在盐水中洗涤4次，随后将其浸入NBT/ BCIP(Pierce Scientific)中1小时。随后将切片在盐水中冲洗并在具有平面-高度消色透镜的Nikon E600显微镜下对整体拍照。数据处理和统计分析总的阳性染色由进行该盲法试验的观测者采用Image Pro Plus软件(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)进行分批图像分析测定，并将其对总的横断面积标准化以测定每个切片的百分比阳性染色。随后确定每组的平均值和标准误差，用Matview软件(Abacus，Berkeley，CA)在单向ANOVA重复测量中分析95%置信度时的显著性。结果在单次局部施用含有KNR的Btox-b ( “EB-Btox")或含有K的Btox_b ( "nl")后， 生物素化肉毒杆菌毒素阳性的平均横断面积报告为总面积的百分比。结果在下面的表1中给出并在图1中说明。在图1中，在用含有Btox-b和肽基载体KNR的‘‘EB-Btox”以及含有 Btox-b和聚阳离子K的“nl” (作为对照)每天处理一次处理三天后，确定对标记呈阳性的区域对总面积的百分比。描述了每组的平均值和标准误差。表1 在单次局部施用含有KNRCJMW-7)或K(JMW_8)的Btox_b 30分钟后，作为总横切面的百分比的标记肉毒杆菌毒素区域的平均值和标准误差。
组平均值标准误差JMW-7335.333334JMW-88. 6666670.333334P = 0.0001 (99% 时的显著性)实施例2具有肽基载体的局部用肉毒杆菌毒素制剂的治疗效果。实施例1表明肽基经皮肤载体在局部施用于鼠模型的完整皮肤后使得能有效转移肉毒杆菌毒素。然而，该试验未指出复合蛋白质肉毒杆菌毒素在转运穿过皮肤后是否以功能形式释放。因此建立下面的实验用以评估肉毒杆菌毒素是否可用这种肽基载体(同样，没有共价修饰该蛋白质)作为局部用药剂治疗性递送穿过完整的皮肤。带正电荷的主链同样通过以18%的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18个与-Gly3Ai^7结合)将-Gly3Ai^7缀合至多聚赖氨酸(MW 112,000)来装配，所述的缀合是通过末端甘氨酸的羧基与赖氨酸侧链的游离胺结合。所述经修饰的主链称为“KNR”。对照聚阳离子是相同大小且来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸(称为“K”，Sigma Chemical Co.，St. Louis,M0)。使用与实施例1中相同的肉毒杆菌毒素治疗剂，并以相同的方式制备。 样品如下制备“JMW-9”组将每等分试样2. 0单位的肉毒杆菌毒素(即总量为60U)和肽基载体 KNR以计算的MW比例4 1混合至均勻，并用磷酸盐缓冲盐水将其稀释至600微升。将得到的组合物与5. 4ml Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。“JMW-10”组将每等分试样2.0单位的肉毒杆菌毒素(即总量为60U)和K以丽比例4 1混合至均勻，并用磷酸盐缓冲盐水将其稀释至600微升。将得到的组合物与5.細1 Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。“JMW-11”组将无聚阳离子的、每等分试样2. 0单位的肉毒杆菌毒素(即总量为 60U)用磷酸盐缓冲盐水稀释至600微升。将得到的组合物与5.細1 Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。在用At某iH本禾Π肉毒杆菌毒素单次处理后确定治疗效果的云肿勿^龄:在实施处理过程中，将动物通过吸入异氟烷麻醉。麻醉后，给C57black 6小鼠(每组η = 4)局部施用定量的400微升剂量的适当处理物，所述处理物均勻地从脚趾施用至大腿中部。二肢都接受处理，并且处理随机地发生在任一侧。动物不用脱毛。初次处理后30分钟，根据公开的关于在施用肉毒杆菌毒素后足的灵活性的足趾外展(digital abduction) 能力打分来评估小鼠的足趾外展能力[Aoki, KR. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice. Toxicon. 2001 Dec ；39 (12) 1815-20]。也可以主观地评价小鼠的灵活性。数据处理和统计分析足趾外展打分由进行该盲法试验的两名观测者独立地列表显示。随后确定每组的平均值和标准误差，用Matview软件(Abacus，Berkeley, CA)在单向ANOVA重复测量中分析95%置信度时的显著性。结果单次局部施用含有KNR( “JMW-9”)、K( “JMW-10”)或无聚阳离子的稀释剂 (“JMW-11”)的肉毒杆菌毒素后的平均足趾外展打分在表2中显示，并且在下面图2的代表性显微照片中举例说明。相对于两个对照，肽基载体KNR提供了统计上显著的对肉毒杆菌毒素的功能性跨越皮肤递送，这些试验是彼此可比较的。另外独立重复本试验(全部的三个独立试验都有一致的结论统计上显著的麻痹作用来自含有KNR的局部用肉毒杆菌毒素而不是对照)证实了当前的发现，并显示在含有或不含K的局部用肉毒杆菌毒素(即两种对照)之间无显著差别。有趣地是，小鼠一致地移向麻痹的肢体(这在100%受处理的动物发生而0%的来自任一对照组的对照中发生)。如在图2中显示的，用肉毒杆菌毒素加上对照聚阳离子多聚赖氨酸或用无聚阳离子的肉毒杆菌毒素(“仅毒素”)处理的肢可移动足趾(作为提起时的防御机制)，但是用肉毒杆菌毒素加上肽基载体KNR( "Revance' s肉毒杆菌制剂”)处理的肢不能移动。表2:在单次局部施用具有肽基载体KNR的肉毒杆菌毒素(“JMW-9”)、具有对照
17聚阳离子K的肉毒杆菌毒素(“JMW-10”)或单独的肉毒杆菌毒素后30分钟的足趾外展打分。
权利要求
1.制剂在制备产生生物效应的药物的用途，所述的生物效应例如是肌肉麻痹、减少分泌过多、治疗疼痛、皱纹或多汗症、减少肌肉痉挛、预防或减少粉刺，或者减少或增强免疫应答，其中所述的制剂包含肉毒杆菌毒素，包括连接至其上的效应基团的带正电荷的主链，以及寡聚-桥，其中所述肉毒杆菌毒素与所述带正电荷的主链非共价复合。
2.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中所述的寡聚-桥包括聚天冬氨酸。
3.根据权利要求2所述的制剂的用途，其中所述的聚天冬氨酸的分子量为3000D。
4.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中所述效应基团是具有选自如下的序列的氨基酸 Jgly^-RGRDDRRQRRR-fely),、(gly^-YGRKKRRQRRR-fely),和(gly) p-RKKRRQRRR- (gly),，其中所述的下标ρ和q独立地选自0_20的整数。
5.根据权利要求4所述的制剂的用途，其中至少一个所述效应基团具有序列(gly) p-RGRDDRRQRRR- (gly),，其中所述的下标ρ和q独立地选自0_20的整数。
6.根据权利要求4所述的制剂的用途，其中至少一个所述效应基团具有序列(gly) p-YGRKKRRQRRR- (gly),，其中所述的下标ρ和q独立地选自0_20的整数。
7.根据权利要求4所述的制剂的用途，其中至少一个所述效应基团具有序列(gly) p-RKKRRQRRR- (gly),，其中所述的下标ρ和q独立地选自0_20的整数。
8.根据权利要求1所述的制剂的用途，其进一步包括泊洛沙姆。
9.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中所述的制剂用于减少分泌过多。
10.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中所述的制剂用于用于治疗多汗症。
11.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中所述的制剂用于治疗疼痛。
12.根据权利要求11所述的制剂的用途，其中所述疼痛是神经性疼痛。
13.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中所述疼痛是偏头痛。
14.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中所述的制剂用于预防或减少粉刺。
15.根据权利要求1所述的制剂的用途，其中所述的制剂用于减少或增强免疫应答。
全文摘要
公开了用于经皮肤递送肉毒杆菌毒素的改良制剂。该制剂包含，例如，与带正电荷的主链非-共价连接的肉毒杆菌毒素，所述的主链具有分支或效应基团。制剂还包含分配剂、寡聚-桥或多聚阴离子桥，并可任选包含粘度改良剂。该制剂设计用于局部施用于患者的皮肤上并可用于处理皱纹、多汗症和其它与健康相关的问题。用于施用的试剂盒也得以描述。
文档编号A61K47/48GK102499981SQ20111032457
公开日2012年6月20日 申请日期2006年3月3日 优先权日2005年3月3日
发明者J·M·沃, M·D·戴克 申请人:雷文斯治疗公司