专利名称：基因limg编码的蛋白质及其抗体在乳腺癌诊断和/或治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因LIMG编码的蛋白质及其抗体，具体讲，涉及基因LIMG编码的蛋白质及其抗体的在乳腺癌诊断和/或治疗中的应用。
背景技术：
UMG基因位于人9号染色体长臂，全长453个碱基，由5个外显子和4个内含子组成。我们克隆到的LIMG的ORF有453个碱基，编码一个150个氨基酸的蛋白，预测分子量为17kDa。图I为UMG的基因结构示意图，UMG基因ORF为150个氨基酸，下划线部分为EF-hand(52-112aa)结构域，下方所示为LIMG的蛋白序列。 在现有技术的报道中，还没有该基因及其编码的蛋白质的功能的报道，为了进一步研究该基因及其编码的蛋白质的功能，发明人进行了深入的研究。

发明内容
本发明的首要发明目的在于提出基因LIMG、其编码的蛋白质及其抗体在诊断和/或治疗乳腺癌中的应用。本发明的第二发明目的在于提出一种用于诊断乳腺癌的试剂盒。本发明的第三发明目的在于提出基因UMG、其编码的蛋白质及其抗体在丰乳中的应用。为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为本发明涉及基因LIMG、其编码的蛋白质及其抗体在诊断和/或治疗乳腺癌中的应用。其中，所述的检测方法包括定量PCR检测法、免疫检测法；其中，免疫检测法优选电泳法、免疫印迹法、双抗体夹心法。当采用定量PCR法检测基因UMG的表达，用定量PCR仪检测，当待测组的基因LIMG水平为正常参比组基因UMG水平2±0. 05倍及以上时，判定为阳性；采用ELISA免疫检测法检测UMG编码的蛋白时，当待测组的基因UMG编码的蛋白质水平为正常参比组基因LMG水平2±0. 05倍及以上时，判定为阳性。本发明还涉及一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，该试剂盒为定量PCR的试剂盒，包括提取DNA的试剂盒、正常参比组的DNA、UMG基因的引物。本发明还涉及另一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，该试剂盒采用免疫检测法，包括提取蛋白质的试剂盒、LMG抗体包被的孔板、LIMG的单克隆或多克隆抗体、作为浓度参比标准的UMG纯化蛋白、第二抗体、ELISA显色试剂，用于检测的酶标仪，其中，UMG抗体为单抗或多抗。本发明还涉及基因UMG、其编码的蛋白质及其抗体在丰乳中的应用。所述的基因UMG在性激素及类似物的作用下增加表达。
经动物实验表明，当刺激UMG的表达增加时，雌性小鼠的乳腺发育加快。前期试验证明UMG基因直接作用于0ct4等转录因子，这些因子对于细胞的自我更新和繁殖十分重要。LIMG基因为刺激乳腺增长和发育提供了一个新的途径。本发明还涉及基因UMG、其编码的蛋白质及其抗体在检测乳腺发育中的应用。其中，所述的检测方法包括定量PCR检测法、免疫检测法；其中，免疫检测法优选定量PCR、免疫印迹法、双抗体夹心法。下面对本发明的内容做进一步的详细描述本发明涉及基因LIMG、其编码的蛋白质及其抗体在诊断和/或治疗乳腺癌中的应用。其中，所述的检测方法包括定量PCR检测法、免疫检测法；其中，免疫检测法优选电泳法、免疫印迹法、双抗体夹心法。当采用定量PCR法检测基因LIMG的表达，用定量PCR仪检测，当待测组的基因LIMG水平为正常参比组基因UMG水平的2 ± O. 05倍及以上时，判定为阳性；采用ELISA免疫检测法检测UMG编码的蛋白时，当待测组的基因UMG编码的蛋白质水平为正常参比组基因UMG水平的2±0. 05倍及以上时，判定为阳性。通过获得足够量的乳腺癌病例和正常例，用统计学95%可信区间的方法初步设定正常值范围，从而在分子水平上实现乳腺癌的初步诊断。本发明的检测方法简便、快速，可作为大规模筛查使用，也可作为临床上的检测手段，为乳腺癌的检测提供了一种新途径。


图I为UMG的基因结构示意图；图2为在大肠杆菌BL21中表达UMG-GST融合蛋白的电泳图谱；图3为用纯化蛋白作为抗原制备的抗体，Western Blot法可以检测过表达的LIMG ；图4为乳腺肿瘤和远端正常乳腺中LMG表达水平的比较；图5为UMG在小鼠乳腺发育过程中的表达水平的变化。
具体实施例方式实施例I :LIMG抗体的制备利用BL21大肠杆菌细胞表达纯化UMG-GST蛋白质，用此蛋白制备了特异性UMG多克隆抗体及体外蛋白功能检测首先采用PCR的方法扩增出LIMG片段，然后进行琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，再进行酶切及过夜连接，将LMG片段克隆至pGEX4T3质粒，将UMG/pGEX4T3质粒转化入大肠杆菌BL21细胞中，采用经典的IPTG诱导蛋白表达方法，诱导目的蛋白表达，之后裂解大肠杆菌用GST-beads纯化UMG-GST融合蛋白。LIMG/pGEX4T3 质粒合成方法pGEX_4T3购自AmershamBiosciences公司，根据LIMG全长基因序列，设计扩增LIMG截短的基因片段的特异引物。上游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 1所示，
下游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 2所示，SEQ NO ID :1 :5’ GACGCGTGGATCCCCTTTTCCTCCCTGTTGTCCC3’SEQ NO ID :2 :5’ GTCCGCCGAATTCGACCTTTTGTACAAAGAGGGCA3’诱导上游引物L5’端加了限制性内切酶BamHI酶切位点，下游引物R5’端加入限制性内切酶EcoRI酶切位点。用上述引物扩增出截短的UMG基因片段，取5μ I进行1%琼脂糖凝胶电泳。从琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶，按照DNA凝胶纯化试剂盒操作步骤纯化回收目的片段。表达质粒的构建纯化的目的基因片段，经T4DNA连接酶与pGEM-T载体连接，转化感受态DH5 α，筛选出阳性克隆，提取质粒后，经BamHI/EcoRI双酶切反应，回收酶切产物，经T4DNA连接酶与经同样双酶切的pGEX-4T3连接，转化感受态DH5 α，提取质粒后，经BamHI/EcoRI双酶切鉴定，筛选出含目的基因片段的阳性克隆，并测序，得到阳性克隆即为目的质粒。诱导目的蛋白表达的方法将含有目的基因重组表达质粒UMG/pGEX4T3的BL21菌株，接种于含100 μ g/ml氨苄青霉素的2YT培养基中，37°C培养过夜后，按I : 100比例转种于新鲜2YT培养基中，继续培养至对数生长期，加IPTG至终浓度为lmmol/L，诱导4 5h，取菌体用于SDS-PAGE分析。所得的融合蛋白经SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色后，推算的UMG分子量与UMG真核表达推算所得相一致，如图2所示；图2为在大肠杆菌BL21中表达UMG-GST融合蛋白，图为经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，图中1-3列分别为IPTG(O. ImM)诱导2h，3h，4h后纯化的LIMG-GST蛋白。第4列为蛋白marker。用该融合蛋白作为抗原免疫兔子,得到的免疫后血清用免疫荧光染色、WesternBlot, ELISA法可以检测到内源表达的UMG。多克隆抗体制备参考教科书《免疫学》，利迪亚德(Peter M Lydyard) AlexWhelan Michael W Fanger译者林慰慈,魏雪涛,薛彬,2010年,科学出版社。所得的血清抗体可以识别外源表达的UMG蛋白，如图3所示；图3为western检测抗体识别蛋白情况，图为经二抗孵育后的经SDS-PAGE胶转膜后的图，图中上下两幅分别代表使用血清抗体和FLAG标签抗体识别外源UMG蛋白表达情况，从左至右分别为对照组(无外源蛋白表达)和实验组(LIMG蛋白表达)。Western Blot法可以检测到过表达的UMG，证明我们制备的抗体具有特异性。实施例2 :乳腺肿瘤UMG在人乳腺肿瘤中高表达我们检测了正常乳腺细胞系和乳腺肿瘤细胞系中LIMG在RNA和蛋白水平的表达，发现LIMG在肿瘤细胞的表达均高于正常。我们通过提取24例病人的远端正常组织及22例肿瘤组织的RNA进行RT-PCR检测了其RNA水平的差异，发现绝大多数的病人肿瘤组织UMG的表达均高于正常。并且与肿瘤恶性程度分级相关。RNA水平检测采用的是realtime PCR的方法，具体的RT-PCR的条件引物、体系、循环温度和时间等如下上游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 4所示；SEQ NO ID :3 :5’ CTTGTCCATTCTCAGCGACA 3’
SEQ NO ID 4 :5’ ACTCCCTCACACCACTGACC 3’反应体系购于TAKARA 公司SYBR Premix Ex Taq real-time 检测试剂
权利要求
1.基因LIMG、其编码的蛋白质及其抗体在诊断和/或治疗乳腺癌中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的检测方法包括定量PCR检测法、免疫检测法；其中，免疫检测法优选电泳法、免疫印迹法、双抗体夹心法。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用定量PCR法检测基因LIMG的表达，用定量PCR仪检测，当待测组的基因UMG水平为正常参比组基因UMG水平的2±0. 05倍及以上时，判定为阳性； 采用ELISA免疫检测法检测UMG编码的蛋白时，当待测组的基因UMG编码的蛋白质水平为正常参比组基因UMG水平的2±0. 05倍及以上时，判定为阳性。
4.一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为定量PCR的试剂盒，包括提取DNA的试剂盒、正常参比组的DNA、UMG基因的引物。
5.一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用免疫检测法，包括提取蛋白质的试剂盒、LMG抗体包被的孔板、LIMG的单克隆或多克隆抗体、作为浓度参比标准的UMG纯化蛋白、第二抗体、ELISA显色试剂，用于检测的酶标仪，其中，UMG抗体为单抗或多抗。
6.基因LIMG、其编码的蛋白质及其抗体在丰乳中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的基因LIMG在性激素及类似物的作用下增加表达。
8.基因LIMG、其编码的蛋白质及其抗体在检测乳腺发育中的应用。
9.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的检测方法包括定量PCR检测法、免疫检测法；其中，免疫检测法优选定量PCR、免疫印迹法、双抗体夹心法。
全文摘要
本发明涉及基因LIMG编码的蛋白质及其抗体，具体讲，涉及基因LIMG编码的蛋白质及其抗体的在乳腺癌诊断和/或治疗中的应用。当采用定量PCR法检测基因LIMG的表达，用定量PCR仪检测，当待测组的基因LIMG水平为正常参比组基因LIMG水平2±0.05倍及以上时，判定为阳性；采用ELISA免疫检测法检测LIMG编码的蛋白时，当待测组的基因LIMG编码的蛋白质水平为正常参比组基因LIMG水平的2±0.05倍及以上时，判定为阳性。本发明还涉及基因LIMG、其编码的蛋白质及其抗体在丰乳中的应用，以及检测乳腺发育中的应用。
文档编号A61P35/00GK102952849SQ20111023760
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日
发明者李凌松 申请人:李凌松