专利名称：腺花素在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医药领域，具体地讲，涉及活性物质腺花素(adenanthin) 在制备预防或治疗多发性硬化症药物中的应用。
背景技术：
多发性硬化(Multiple klerosis，MS)是最常见的神经免疫疾病之一，表现为中枢神经系统的脱髓鞘，约50%的患者在发病后15年后不能独立行走。MS是西欧和南美地区最常见的非外伤所致的神经系统残障的疾病。在我国，据不完全统计，该病患病率也已达约十万分之五，并呈逐年上升趋势。因其在中青年人群中多发，且有较高致残率，对社会和家庭造成极为不良的影响。该病的病变部位在脑部或脊髓，临床特点是病灶播散广泛，病程中常有缓解复发的神经系统损害症状。MS的症状视其所影响的神经组织而定，患者可能出现视力受损(视神经病变)、肢体无力、平衡失调、行动不便、麻木、感觉异常、口齿不清、眩晕、 大小便机能失调等症状，病情反复性加重，致残率高。MS的发病机制迄今不清，目前尚无有效地治疗方法。MS的治疗主要包括急性发作期的对症治疗和慢性迁延期的预防复发治疗。目前 MS疾病治疗的手段主要包括①糖皮质素；②大剂量免疫球蛋白；③干扰素_b ；④免疫抑制剂如环磷酰胺，米托蒽醌等；⑤格拉默(Glatiramer acetate GA);⑥神经营养药物；⑦雷公藤多甙片。临床上多采取联合治疗方法。现有的治疗方法价格昂贵，副作用大，功效相当有限，开发新的治疗药物具有重要价值。现有的多发性硬化的治疗药物价格昂贵，副作用大，功效相当有限。在这一点上， 有着几千年历史的中国草药具有独特的优势，如雷公藤自20世纪80年代以来，便广泛地应用于多种免疫性疾病如类风湿性关节炎及某些肾脏系统免疫性疾病等。但因中药方剂成份较复杂，导致作用机制难以明确，毒副作用难以控制，药物剂量难以规范化，极大限制了其在临床上的推广应用。从已知的对某些疾病有明确作用而且毒性较低的中草药中提取纯化其活性单体成分是发展新的抗炎药物的一条可行途径。腺花素(Adenanthin)(见图1 A)后又在文献中改称为腺花甲素(Adenanthin A)，均为同一个化合物，是从云南产唇形科(Lamiaceae)香茶菜属(Isodon)植物腺花香茶菜(Isodon adenanthus)中分离鉴定的一个对映一贝壳杉烯(ent_kaurenoid) 1，2类二萜化合物，其分子式为C26H34O9，分子量为490，熔点为251-255°C，[a] 13 D -760 (c 0.25， CHCl3) ； UV (EtOH) Imax (log e) 231 (4.07) ； IR (Nujol) nmax 3475，1743，1724， 1645， 1257， 1217， 1030 cm-1； MS m/z 490 (M+)，448，430，380，370，328，310，295，292， 180，162，138。腺花素是一种植物中天然存在的化合物，具有较高的安全性。以往的研究中显示腺花素类化合物如毛萼乙素、冬凌草甲素在肿瘤、炎症等方面疾病的防治中具有广阔的前景。本发明的腺花素安全低毒，药理作用强，预示着很好的药用前景，容易为市场所接受。

发明内容
本发明的目的在于提供腺花素在制药中的应用。本发明的第二个目的在于提供一种NF-kB抑制剂。为实现以上目的，本发明公开以下技术方案腺花素在制备预防或治疗多发性硬化症药物中的应用。一种NF-kB抑制剂，所述抑制剂是腺花素。本发明的优点在于腺花素能够通过多个环节抑制NF-kB的活性(直接抑制 NF-kB/p65的DNA结合，抑制IKKb的激酶活性)，抑制抗原递呈细胞的活化，抑制T细胞的活化及巨噬细胞的活化，从而表现出显著的多发性硬化症预防和治疗作用。本发明的腺花素安全低毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。本发明的腺花素活性物质具有容易吸收、 稳定性好等特点，更加适合作为新型药物、食物、保健品和/或膳食添加剂进行开发。


图IA为腺花素的化学结构。图IB显示NF-kB荧光报告基因实验中，不同浓度腺花素与处理 pGL4. 32-NF-kB-RE-THP-l细胞1个小时后加入10ng/ml TNi^a刺激5个小时，检测荧光素酶的活性，结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制TNFa诱导的NF-kB的活化。图IC显示腺花素抑制TNFa诱导的NF_kB的DNA结合能力，不同浓度腺花素预处理THP-I细胞1个小时后加入lOng/ml TNFa刺激一个小时，提取核蛋白，通过凝胶迁移实验检测NF-kB的DNA结合能力，结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制TM^a诱导的NF-kB的 DNA结合能力。图ID显示腺花素抑制TNFa诱导的NF_kB p65的入核，不同浓度腺花素预处理 THP-I细胞1个小时后加入lOng/ml TNFa刺激30分钟，免疫荧光检测p65的细胞定位。图IE显示腺花素抑制TNFa诱导的NF_kB p65的入核，不同浓度腺花素预处理 THP-I细胞1个小时后加入10ng/ml TNFa刺激30分钟，核浆分离后，WESTERN检测p65、 p50、IaminB 禾口 b-actin。图2A显示4mM、10mM的腺花素处理THP-I细胞1个小时后加入10ng/ml TNi^a刺激 15 分钟后，WESTERN 检测 pi-IKKa/b、IKKa、pi-IkBa、IkBa、pi_p65、p65、p50 和 b-actin。图2B显示4mM、10mM的腺花素处理THP-1细胞1个小时后加入10ng/ml TNFa刺激1个小时后，收取细胞，抽提总的RNA，反转后real-time PCR检测IL_8、IKBa和TRAF1， 结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制TNFa诱导的NF-kB的靶基因的表达。图3A显示NF-kB荧光报告基因实验中，不同浓度腺花素预处理 pGL4. 32-NF-kB-RE-RAW264. 7细胞个小时后加入100ng/ml LPS刺激5个小时，检测荧光素酶的活性。结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制LPS诱导的NF-kB的活化。图;3B显示腺花素抑制LPS诱导的NF-kB p65的入核，不同浓度腺花素预处理 RAW264. 7细胞1个小时后加入lOOng/ml LPS刺激30分钟，免疫荧光检测p65的细胞定位。图3C显示4mM、10mM的腺花素处理7细胞1个小时后加入100ng/ml LPS 刺激1个小时后，收取细胞，抽提总的RNA，反转后real-time PCR检测IL_la、IL_6、IL-23 和TNFa水平。
图3D显示4mM、IOmM的腺花素处理7细胞1个小时后加入100ng/ml LPS 刺激 30 分钟后，WESTERN 检测 pi-IKKa/b、IKKa, pi-IKBa、IKBa, pi_p65、p65、p50 和 b—actin。图4A显示利用化学方法对腺花素的羟基进行修饰，连接上生物素，得到生物素标记的小分子。图4B显示生物素标记腺花素在体外与THP-I细胞裂解液孵育，通过 streptavidin-Agarose beads钓取与生物素标记腺花素相互作用的靶蛋白，未标记的腺花素作为冷探针竞争，WESTERN检测IKKb、IKKa、IkBa、p65和p50，提示IKKb和p65为腺花素的靶蛋白。图4C显示10ng/ml TNFa刺激THP-1细胞1个小时，提取核蛋白，体外加入10mM、 IOOmM的腺花素室温孵育30分钟，通过凝胶迁移实验检测NF-kB的DNA结合能力，腺花素能体外直接抑制NF-kB的DNA结合能力。图4D显示纯化的IKKb体外激酶试验，ImM, IOmM和IOOmM的腺花素体外加入反应体系中，WESTERN检测pi-IkBa (ser3》。腺花素能体外直接抑制IKKb的酶活。图5A显示DMSO生理盐水对照组和腺花素预防组EAE发病情况的比较，腺花素可以明显抑制EAE的发病。图5B显示DMSO生理盐水对照组和腺花素治疗组EAE发病情况的比较，腺花素可以明显抑制EAE的发病。图5C显示取正常小鼠、免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组、腺花素预防组和腺花素治疗组小鼠脊髓腰膨大HE染色(上方)，fast blue染色(下方)。DMSO生理盐水对照组可见大量的炎症细胞浸润包膜及白质且产生大量空泡，腺花素预防和治疗组未见大量的炎症细胞浸润包膜及白质。图6A显示取免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组和腺花素治疗组EAE小鼠淋巴结，WESTERN 检测 pi-IkBa (ser32)、IKBa, pi_p65 和 b-actin，腺花素治疗组明显降低 EAE 小鼠淋巴结中NF-kB的活性。图6B显示取正常小鼠、免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组、腺花素预防组和腺花素治疗组小鼠脊髓腰膨大冰冻切片，免疫荧光检测Pi-IkBa(serf》，腺花素明显降低 EAE小鼠中枢神经系统中NF-kB的活性。图7A显示取正常小鼠、免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组、腺花素预防组和腺花素治疗组小鼠脊髓腰膨大冰冻切片，免疫荧光检测pi-IkBa (ser32)、F4/80。腺花素明显降低EAE小鼠中枢神经系统中巨噬细胞的浸润且降低其NF-kB的活性。图7B显示取正常小鼠、免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组、腺花素预防组和腺花素治疗组小鼠脊髓腰膨大冰冻切片，免疫荧光检测TNFa、F4/80表达情况，腺花素明显降低EAE小鼠中枢神经系统中巨噬细胞的浸润且减少其分泌TNFa。图8A显示取免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组、腺花素治疗组小鼠淋巴细胞在体外对MOG的反应性，腺花素明显降低EAE小鼠淋巴细胞对MOG刺激增殖的反应性。图8B显示取免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组、腺花素治疗组小鼠淋巴细胞， 体外用20mg/ml MOG刺激24小时后，标记⑶lib、⑶80、⑶86和PD-Ll,圈出CDllb+的细胞群分析⑶80、⑶86和PD-Ll等共刺激分子的表达情况，腺花素明显降低EAE小鼠抗原递成
5细胞的共刺激分子的表达。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。实施例1 腺花素在THP-I细胞中抑制TNFa诱导的NF_kB的活化。建立了一个体外筛选NF-kB抑制剂的平台，即在人单核细胞白血病细胞系THP-I 中，电穿孔转入 PGL4. 32 [luc2P/NF-kB-RE/Hygro] Vector (Promega)质粒，通过 Hygro 筛选得到稳转NF-kB报告基因的细胞系。通过加入TNFa活化NF_kB的细胞因子证实此系统是可以很好反应NF-kB的活性(图1 B)。不同浓度腺花素与处理pGL4. 32-NF-kB-RE-THP-l 细胞1个小时后加入lOng/ml TM^a刺激5个小时，检测荧光素酶的活性。结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制TNFa诱导的NF-kB的活化(图1 B)。进一步，不同浓度腺花素预处理THP-I细胞1个小时后加入lOng/ml TNFa刺激1 个小时，提取核蛋白，通过凝胶迁移实验检测NF-kB的DNA结合能力。结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制TNFa诱导的NF-kB的DNA结合能力(图1 C)。通过免疫荧光实验我们发现不同浓度腺花素预处理THP-I细胞1个小时后加入lOng/ml TNFa刺激30分钟，TNFa诱导的P65的入核被抑制(图1 D)。为进一步证实免疫荧光的结果，核浆分离后，WESTERN检测 p65、p50、IaminB和b-actin。我们发现腺花素能抑制TNFa诱导的p65和p50的入核(图 1 E)。实施例2 腺花素通过多个步骤抑制NF-kB的活性及下游靶基因的表达。为了研究腺花素抑制NF-kB的机制，观察腺花素作用于TNFa诱导NF_kB活化的哪个环节。用4mM、IOmM的腺花素预处理THP-I细胞1个小时后加入10ng/ml TNFa刺激15分钟后，WESTERN 检测 pi-IKKa/b、IKKa、pi-IkBa、IkBa、pi-p65、p65、p50 和 b-actin (图 2 Α)。我们发现即低浓度下(4mM)不影响IkBa的磷酸化及降解，高浓度(IOmM)完全抑制IkBa 的磷酸化及降解。与此相一致，NF-kB免疫荧光的结果显示低浓度仅部分抑制NF-kB核转位，而高浓度几乎完全抑制NF-kB核转位。4mM、IOmM的腺花素处理THP-I细胞1个小时后加入lOng/ml TNFa刺激1个小时后，收取细胞，抽提总的RNA，反转后real-time PCR检测 IL-8、IKBa和TRAFl。腺花素抑制NF_kB进而抑制其下游靶基因IL_8、IKBa和TRAFl的表达(图2 B)。以上结果提示腺花素通过多个环节抑制NF-kB的活性及其下游靶基因的表达。实施例3 腺花素在7细胞中抑制LPS诱导的NF_kB的活化。在小鼠巨噬细胞系7 中，电穿孔转入 pGL4. 32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro] VectoKftOmega)质粒，通过Hygro筛选得到稳转NF_kB报告基因的细胞系。通过加入LPS 活化NF-kB的细胞因子证实此系统是可以很好反应NF-kB的活性(图3 A)。不同浓度腺花素与处理pGL4. 32-NF-kB-RE- 7细胞1个小时后加入100ng/ml LPS刺激5个小时， 检测荧光素酶的活性。结果提示腺花素能剂量依赖性的抑制LPS诱导的NF-kB的活化(图 1 B)。进一步，通过免疫荧光实验我们发现不同浓度(4mM、10mM)腺花素预处理 RAW264. 7细胞1个小时后加入100ng/ml LPS刺激30分钟，LPS诱导的p65的入核被抑制 (图3 B)。4mMU0mM的腺花素处理7细胞1个小时后加入100ng/ml LPS刺激1个小时后，收取细胞，抽提总的RNA，反转后real-time PCR检测IL_la、IL-6、IL23和TNFa。 腺花素抑制NF-kB进而抑制其下游基因IL-la、IL_6、IL23和TNFa的表达(图3 C)。4mM、 IOmM的腺花素处理7细胞1个小时后加入100ng/ml LPS刺激30分钟后，TOSTERN 检测 pi-IKKa/b、IKKa、pi-IKBa、IKBa、pi-p65、p65、p50 和 b-actin (图 3 D)，发现低浓度 (4mM)不影响IkBa的磷酸化及降解，高浓度(IOmM)完全抑制IkBa的磷酸化及降解。提示在不同细胞不同刺激的作用下，腺花素都能抑制NF-kB的活性。实施例4 腺花素通过直接结合IKKb和p65蛋白抑制NF_kB的活性。利用一系列的化学反应，从羟基位连接上生物素，得到同样具有活性的生物素标记的腺花素(图4 A)。进而利用生物素标记腺花素在体外与THP-I细胞裂解液孵育，通过 streptavidin-Agarose beads钓取与生物素标记腺花素相互作用的靶蛋白，未标记的腺花素作为冷探针竞争。WESTERN检测IKKb, IKKa, IkBa, p65和p50。提示IKKb和p65为腺花素的靶蛋白(图4 B)。 进一步通过体外实验验证上面的结果，显示lOng/ml TM^a刺激 THP-I细胞1个小时，提取核蛋白，体外加入IOmMUOOmM的腺花素室温孵育30分钟，通过凝胶迁移实验检测NF-kB的DNA结合能力。腺花素能体外直接抑制NF-kB的DNA结合能力 (图4 C)。纯化的IKKb体外激酶试验，ImMUOmM和IOOmM的腺花素体外加入反应体系中， WESTERN检测pi-IkBa(ser3》。腺花素能体外直接抑制IKKb的酶活(图4 D)。腺花素能直接抑制NF-kB的DNA结合能力，也能直接抑制IKKb的酶活。实施例5 腺花素预防组和治疗组均明显改善EAE小鼠的病程。EAE是由于炎症导致的中枢神经系统脱髓鞘，所以炎症的发生早于症状的开始。我们应用预防和治疗两种方案探索腺花素对EAE的疗效，即腺花素在MOG免疫C57/BL6小鼠前3天开始进行腹腔注射治疗(预防组)，腺花素在MOG免疫C57/BL6小鼠后8天开始进行腹腔注射治疗(治疗组)，同时设立空白对照组，每组12-15只小鼠，观察腺花素对小鼠EAE 的效果。通过对小鼠EAE发病的临床分值，与空白对照组小鼠相比，腺花素预防组和治疗组 EAE小鼠发病程度明显减轻(见图5 A B)。取正常小鼠、免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组、腺花素预防组和腺花素治疗组小鼠脊髓腰膨大HE染色(上方)，fast blue染色(下方) (图5 C)，发现对照组EAE小鼠脊髓髓鞘形态遭到破坏，周边蓝色部分有空泡状缺失，为脱髓鞘现象.并伴有大量的炎性浸润。而腺花素预防和治疗组小鼠脊髓髓鞘形态保持完整，未见有明显的脱髓鞘现象，髓鞘中也未见有明显的炎性细胞浸润。实施例6 腺花素体内抑制NF-kB的活性。取免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组和腺花素治疗组EAE小鼠淋巴结，裂解后，WESTERN 检测 pi-IkBa(ser32)、IKBa、pi-p65 和 b-actin (图 6 Α)。腺花素治疗组明显降低EAE小鼠淋巴结中NF-kB的活性。正常小鼠、免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组、 腺花素预防组和腺花素治疗组小鼠脊髓腰膨大冰冻切片，免疫荧光检测Pi-IkBa(ser32) (图6 B)，可见对照组EAE小鼠大量pi-IkBa (ser32)的活化，而腺花素预防和治疗组小鼠 pi-IkBa(ser32)的活化明显降低。腺花素明显降低EAE小鼠中枢神经系统中NF_kB的活性。说明腺花素可以在体内抑制NF-kB的活性。实施例7 腺花素体内抑制EAE小鼠脊髓巨噬细胞的浸润及其分泌TNFa。正常小鼠、免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组、腺花素预防组和腺花素治疗组小鼠脊髓腰膨大冰冻切片，免疫荧光检测pi-IkBa (ser32)、F4/80 (见图7 A)，TNFa、F4/80 (见图7 B)。图中可见对照组EAE小鼠脊髓髓鞘有大量的炎性巨噬细胞浸润，炎性巨噬细胞伴有Pi-IkBa (ser32)的活化，且TNFa的分泌量大大增加。而腺花素预防和治疗组小鼠脊髓未见有明显炎性巨噬细胞浸润，未见有pi-IkBa (ser32)的活化及TNFa的分泌。实施例8 腺花素抑制淋巴细胞在体外对MOG的反应性及明显降低EAE小鼠抗原递成细胞的共刺激分子的表达。取免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组和腺花素治疗组EAE小鼠脾脏，分离单个核细胞后，在体外加入不同浓度的MOG刺激，56小时加入:3H继续培养16小时后，检测的掺入量，进而反映细胞的增殖情况。可见腺花素可明显抑制MOG刺激的淋巴细胞增殖(见图 8 A)。取免疫小鼠14天DMSO生理盐水对照组、腺花素治疗组小鼠淋巴细胞，体外用20mg/ ml MOG刺激24小时后，标记CDllb、CD80、CD86和PD-L1。圈出CDllb+的细胞群分析⑶80、 ⑶86和PD-Ll等共刺激分子的表达情况(见图8 B)。腺花素明显降低EAE小鼠抗原递成细胞的共刺激分子的表达。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.腺花素在制备预防或治疗多发性硬化症药物中的应用。
2.—种NF-kB抑制剂，其特征在于，所述抑制剂是腺花素。
全文摘要
本发明公开腺花素在制备预防或治疗多发性硬化症药物中的应用，以及一种NF-kB抑制剂，所述抑制剂是腺花素。本发明的腺花素安全低毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。本发明的腺花素活性物质具有容易吸收、稳定性好等特点，更加适合作为新型药物、食物、保健品和／或膳食添加剂进行开发。
文档编号A61K31/22GK102462677SQ20101054285
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月15日 优先权日2010年11月15日
发明者刘传绪, 吴英理, 孙汉董, 普建新, 肖伟烈, 阴倩倩, 陈国强 申请人:上海交通大学医学院, 中国科学院昆明植物研究所