专利名称：一种甘露聚糖修饰的携带hTRT基因腺相关病毒诱导的靶向树突状细胞DC疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于医学生物工程技术领域，它涉及一种新型树突状细胞(DC)疫苗制备技术。该方法将hTRT基因插入腺相关病毒(AAV)，并对其进行甘露聚糖表面修饰，使其能体外靶向感染DC细胞。随着hTRT基因在DC细胞内的稳定表达，可使DC细胞获得持续、大量的hTRT抗原肽刺激。由于hTRT抗原为广谱肿瘤相关抗原，在几乎所有的肿瘤细胞均有表达，而正常细胞几乎不表达hTRT，因此该DC疫苗刺激的淋巴细胞几乎对所有肿瘤细胞均产生强大杀伤作用，避免了治疗的毒副作用。
背景技术：
近年来，随着对肿瘤免疫逃逸机理的认识以及肿瘤相关抗原的发现及鉴定，以树突状细胞(DC)抗肿瘤疫苗为代表的主动免疫治疗成为肿瘤防治研究的热点。DC是人体内抗原递呈能力最强、唯一能在体内活化静息T淋巴细胞的抗原递呈细胞，是机体免疫应答的始动者。DC细胞是以主要组织相容性复合物MHC I、II类肽复合物的形式递呈抗原，具有促进T、B淋巴细胞增殖的能力，在天然免疫和获得性免疫中发挥着极其重要的作用。因此被广泛应用于肿瘤疾病疫苗研究。研究表明，肿瘤的发生、发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，特别是晚期肿瘤患者，其体内往往存在体液免疫和细胞免疫功能的普遍低下，导致免疫功能低下的原因之一是人体内DC细胞功能的下降。实验证实，从外周血分离出的淋巴细胞仍对多种抗原刺激保持很好的反应能力。因此，通过体外制备DC瘤苗有望成为治疗肿瘤的理想疗法。如何选择肿瘤抗原并有效地将其导入DC细胞成为问题的焦点。目前肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)，TSA只存在于某种肿瘤细胞，缺乏广谱表达，而TAA在肿瘤组织中广泛表达，能够诱导针对多种肿瘤CTL杀伤效应，故成为肿瘤DC疫苗研究热点。研究发现，人体90 %的肿瘤存在端粒酶的活化，被激活的端粒酶在肿瘤的发生发展过程中起着非常重要的作用，而端粒酶催化亚基(hTRT)是端粒酶的蛋白亚单位，与细胞端粒酶的活性密切相关，也是迄今报道表达最广泛的肿瘤相关抗原之一，因此选择hTRT 作为癌症治疗DC疫苗的抗原具有重要价值。如何能有效地将肿瘤抗原成功加载并导入DC细胞是获得良好活性DC的关键。目前抗原加载常用两种方法一是抗原肽直接导入DC细胞，二是病毒载体携带抗原基因感染 DC细胞。抗原肽直接冲击存在以下不足(1)抗原肽半衰期短，易降解；(2)目前使用的抗原肽大多来源于细菌表达的基因工程产品，递呈的抗原信息缺乏特异性。而采用病毒携带抗原基因感染DC制备瘤苗可以克服上述不足(1)抗原基因通过特定的载体转染DC细胞后，可整合于DC染色体内，从而实现抗原基因长期稳定表达；(2)将抗原基因感染DC细胞后，可以在蛋白翻译后做进一步的修饰，保证抗原信息的完整及特异。目前携带抗原基因感染DC细胞常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)。这三种病毒载体中，AAV用于感染DC细胞更具有优势=(I)AAV全长仅为51Λ左右，自身免疫原性低，避免了腺病毒较高免疫原性的缺点；( 可将携带基因定向整合于人类的第19号染色体上，保证基因长期稳定表达，不存在逆转录病毒载体随机整合易诱发癌变的危险，具有很高的安全性；(3) AAV感染谱广，既可感染分裂细胞，又可感染非分裂细胞，且能上调DC细胞表面标志⑶80、⑶83、⑶86等的表达，从而上调DC细胞的功能。研究表明，甘露糖受体(MR)属于C2型凝集素家族成员，是DC细胞和巨噬细胞所特有的膜受体，能有效捕获甘露聚糖糖基化的分子。未成熟的DC细胞表面高水平MR，能识别甘露聚糖修饰的病毒表面上的多种糖分子，介导高效的抗原识别与摄取作用，因此AAV 甘露聚糖修饰后对DC细胞具有很强的靶向性，从而大大提高了对DC细胞的感染效率。综上所述将hTRT基因插入腺相关病毒(AAV)，然后对其进行甘露聚糖表面修饰， 使其能体外靶向感染DC细胞。随着hTRT基因在DC细胞内的稳定表达，可使DC细胞获得持续、大量的hTRT抗原肽刺激。经致敏后DC细胞刺激的CTL几乎对所有肿瘤可产生强大杀伤作用，而对正常组织无损伤，该发明制备的以甘露聚糖修饰携带hTRT基因的AAV病毒转染的DC疫苗，具有诱导作用强、安全性高、价格低廉、易于大规模生产、临床应用广等特点。

发明内容
本发明要解决的问题是克服现有方法制备的DC疫苗存在体外抗原肽转染DC半衰期较短、转导效率低、靶向性差、活化免疫效应细胞能力弱的缺点。提供一种甘露聚糖修饰的携带hTRT基因腺相关病毒诱导的靶向树突状细胞DC疫苗及其制备方法。本发明通过甘露聚糖修饰携带hTRT基因的重组腺相关病毒体外靶向感染DC细胞，随着hTRT基因的在DC细胞内的稳定表达，可使DC细胞获得大量、持续hTRT抗原肽刺激，经致敏后DC细胞活化淋巴细胞，产生的CTL几乎对所有肿瘤可产生强大杀伤作用果，具有更好的抗肿瘤效果。本发明技术方案如下包括甘露聚糖修饰的携带hTRT基因的重组腺相关病毒 AAV/hTRT的制备；采集并分离患者外周血单个核细胞，培养于6孔板，贴壁3h，轻轻洗去悬浮T细胞并冻存备用；取贴壁细胞每孔加入AAV/hTRT病毒液0. 5ml (1.0X108eg)，感染 5h后更换为新鲜含有重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)SO万U/L、白细胞介素 4(IL-4)100RU/LAIM V培养基即获得未成熟的肿瘤相关抗原DC疫苗；第6天，取原先冻存的T细胞与培养所得的DC细胞按DC T= 1 20比例混合，以AIM V为培养基，同时加 Λ GM-CSF (80 万 U/L)，IL-4 (100 万 U/L)、IL-2 (1 万 U/L)及 TNF- α (20 μ g/L)，共育 7 天， 诱导获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。本发明所述的培养基为AIM V培养基且添加10%自身血浆。患者外周血单个核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法收集。所述的DC细胞是采用细胞因子GM-CSF、IL-4、 TNF- α诱导分化所得。所述的GM-CSF终浓度为80万U/L，IL-4终浓度为100万U/L及 TNF- α终浓度为20 μ g/L。DC细胞经重组腺相关病毒感染致敏后与原先冻存的T细胞按比例混合，共育7天后诱导获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。综上所述甘露聚糖表面修饰的腺相关病毒(AAV)，能体外靶向感染DC细胞。该发明制备的以甘露聚糖修饰携带hTRT基因的AAV病毒转染的DC疫苗，具有诱导作用强、安全性高、价格低廉、易于大规模生产、临床应用广等特点。
具体实施例方式下面用实施例来具体说明本发明，但本发明并不受实施例的限制。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。实施例1 甘露聚糖修饰的重组腺相关病毒AAV/hTRT的制备1、通过RT-PCR技术获取一段人源性的TRT基因(hTRT，全长3. 5kb)；2、将hTRT基因克隆入腺相关病毒载体AAV(dl6-95)，构建重组质粒AA(dl6_95) (简写为AAV/hTRT)，pSH3包装系统制备AAV/hTRT病毒；3、AAV/hTRT扩增和纯化AAV/hTRT病毒反复感染裂解293细胞扩增病毒。超速离心法，收集获得纯化病毒带。PBS液透析脱盐后置于-80°C保存备用。病毒滴度测定采用半数组织培养感染量(TCID 50)方法；4、AAV/hTRT的甘露聚糖修饰0. lmol/L PBS液(pH6. 0)溶解甘露聚糖至终浓度为 Hmg/mL，加入0. 01mol/L的高碘酸钠于4°C氧化60min，形成氧化型甘露聚糖。加入10 μ L 乙二醇于4°C再孵育30min。反应物加入至kphadex-G25层析柱，收集洗脱出的氧化型甘露聚糖。将纯化后的腺相关病毒与氧化型甘露聚糖溶液混合，室温孵育过夜。产物保存于-80"C。实施例2 未成熟DC细胞制备血细胞分离机无菌条件下采集患者抗凝血，1500rpm/min离心10分钟吸取上层血浆，56°C灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释血细胞沉淀，比重为1. 077的人淋巴细胞分离液与稀释血按1 1. 5的比例加入离心管中，2000rpm/min离心12分钟，小心抽取白细胞层，用生理盐水清洗两次，低速离心后得到PBMC。培养池，洗去悬浮T细胞，取贴壁细胞置于含有新鲜含有GM-CSF (80万U/L)，IL-4 (100万U/L) AIM V的培养液中，37°C、5% CO2的培养箱中孵育后，可得到未成熟的DC细胞。实施例3 甘露聚糖修饰的AAV/hTRT感染DC细胞并诱导获得CTL甘露聚糖修饰的AAV/hTRT感染贴壁细胞，5h后更换为AIM V培养基(含GM-CSF、 IL-4)，诱导DC细胞，即获得肿瘤相关抗原DC疫苗；第6天，取原先冻存的T细胞与培养所得的DC细胞按DC T = 1 20比例混合，以AIMV为培养基，同时加入GM_CSF(80万U/ L)，IL-2 (1万U/L)及TNF- α (20 μ g/L)，共育7天，诱导获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。实施例4 1. AAV/hTRT基因表达、整合及DC细胞表面标志检测培养第6天显微镜观察成熟DC细胞形态；探针检测hTRT基因表达情况；PCR分析 AAV染色体整合情况；流式细胞仪分析DC细胞表面标志⑶80、⑶86、⑶40的表达情况。AAV/ hTRT感染DC前体细胞后，hTRT阳性细胞率为91. 4%，说明hTRT在DC前体细胞内表达良好。流式细胞仪分析结果显示，病毒感染组DC细胞共刺激因子⑶80 (B7-1)、⑶86 (B7-2)、 ⑶40的表达比例分别为78%、83%、79%，均明显高于对照组DC细胞的15%、64%、53%。2. DC激活的hTRT抗原特异CTL抗肿瘤活性检测2. 1激活的CTL细胞表面标志分析培养第13天，流式细胞仪检测CTL群体中⑶8/⑶4和⑶8/⑶56的比值，感染组的 ⑶8/⑶4和⑶8/⑶56分别为3. 15和5. 45，均明显高于对照组DC细胞激活的CTL细胞的 1. 30 和 0. 75。
2. 2激活的CTL细胞因子表达分析培养第14天，收集CTL，流式细胞仪检测细胞内因子IFN-Y和IL_4的表达情况， 与对照组IFN-Y表达(18. 5% )、IL-4表达(13. 6% )相比，病毒感染组的IFN-γ明显高表达(XL 5% ), IL-4明显低表达(1. 5% )。2. 3CFSE/P I双标法检测CTL杀伤靶细胞的MHC I类限制性将靶细胞株(肾癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、肾小管上皮细胞、人肺成纤维细胞)与1/1000 anti-HLA I类抗体共育7天，封闭靶细胞的MHC I类抗原后，CFSE (终浓度为1.25ym0l/L)标记靶细胞，经孵育、离心、洗涤、悬浮后，按效应细胞与靶细胞比为20 1混合，处理后置于上样管中，分析前加PI至终浓度为1.5mg/L，流式细胞仪检测CTL对各类靶细胞的杀伤效率。病毒感染组CTL对肿瘤细胞株均有明显的杀伤，而对人正常的肾小管上皮细胞以及人肺成纤维细胞细胞没有杀伤，当靶细胞封闭MHC I 类抗原后，其杀伤明显下降，这说明CTL对肿瘤细胞的杀伤具有明显的MHC限制性，对照组 CTL对各类靶细胞均无明显杀伤。
权利要求
1.一种甘露聚糖修饰的携带hTRT基因腺相关病毒诱导的靶向树突状细胞DC疫苗，其特征在于甘露聚糖修饰的携带肿瘤相关抗原hTRT基因重组腺相关病毒rAAV能够靶向感染DC细胞，并能获得广谱的抗肿瘤DC疫苗。
2.—种权利要求1所述的靶向树突状细胞DC疫苗的制备方法，其具体步骤如下(1)获取全长约3.5kb的人源性hTRT基因，构建重组质粒，利用pSH3包装系统制备 AAV/hTRT 病毒；(2)病毒AAV/hTRT的甘露聚糖修饰将纯化后的AAV/hTRT与氧化型甘露聚糖溶液混合，室温孵育过夜；产物保存于-80°C ；(3)Ficoll密度梯度法分离患者外周血单个核细胞(PBMC)；培养池后保留贴壁细胞， 洗去悬浮T细胞并冻存备用；(4)AAV/hTRT感染贴壁细胞，感染证后更换为含有GM-CSF (80万U/L)、IL-4 (100万U/ L)的AIM V培养基诱导DC细胞分化，即获得未成熟的肿瘤相关抗原DC疫苗；(5)第6天，取冻存的T细胞与培养所得的DC细胞按比例混合，加入GM-CSF(80万U/ L)，IL-2 (1万U/L)及TNF- α (20 μ g/L)，共育7天，诱导获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
3.如权利要求1所述的肿瘤相关抗原疫苗，其特征在于DC疫苗由甘露聚糖修饰的携带hTRT基因的重组腺相关病毒(rAAV)靶向致敏。
4.如权利要求2所述的靶向树突状细胞DC疫苗的制备方法，其特征在于AAV可定向整合宿主细胞且没有诱发癌变的危险，能使携带的基因长期稳定表达，具有高安全性。
5.如权利要求2所述的靶向树突状细胞DC疫苗的制备方法，其特征在于rAAV携带的 hTRT基因翻译的hTRT蛋白，是一种广谱肿瘤相关抗原，是端粒酶的蛋白亚单位，其表达与端粒酶激活密切相关，在不同类型的肿瘤组织中广泛表达。因此以其制备的瘤苗几乎对所有的肿瘤细胞均产生强大杀伤作用。
6.如权利要求2所述的靶向树突状细胞DC疫苗的制备方法，其特征在于使用甘露聚糖修饰rAAV，使其能靶向感染DC细胞；甘露聚糖即甲氨酸甲基化甘露聚糖 (chol-AECM-marman)，是一种被胆固醇部分修饰的多聚糖化合物，易与病毒形成多聚甘露糖复合体，未成熟的DC细胞和巨噬细胞表面高表达甘露聚糖受体，因此可以增加病毒靶向性，提高感染DC细胞效率。
7.权利要求1所述的DC疫苗能刺激产生有效杀伤肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞 CTL，所产生的CTL具有抗肿瘤广谱性，几乎对所有肿瘤细胞具有杀伤作用。
全文摘要
本发明属于医学生物工程技术领域，它涉及一种新型树突状细胞(DC)疫苗制备技术。该技术将人端粒酶催化亚基(hTRT)基因插入腺相关病毒(AAV)，然后对其进行甘露聚糖表面修饰，使其能体外靶向感染DC细胞。随着hTRT基因在DC细胞内的稳定表达，可使DC细胞获得持续、大量的hTRT抗原肽刺激。由于hTRT抗原为肿瘤相关抗原，因此该DC疫苗刺激的淋巴细胞几乎对所有肿瘤细胞均产生强大杀伤作用。该发明制备的疫苗具有诱导作用强、安全性高、价格低廉、易于大规模生产、临床应用广等特点。解决了现有体外抗原肽转染DC细胞存在的半衰期短、转导效率低、活化免疫效应细胞能力弱的问题。
文档编号A61K39/00GK102552892SQ201110459368
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者刘俊杰, 张宝福, 张青, 李慧忠, 李连涛, 杨洁, 章龙珍, 裴冬生, 郑骏年 申请人:郑骏年