专利名称：狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及克隆获得的狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用。
背景技术：
狐狸是一种经济价值很高的毛皮兽，其生长主要受垂体产生和释放的生长激素来控制，在达到体成熟后，生长激素的产生和释放随之减少。而生长激素又受到动物本身下丘脑产生的生长激素释放激素和生长激素释放抑制激素的双重控制。其中生长激素释放激素促进垂体产生和释放生长激素，而生长激素释放抑制激素则抑制生长激素的产生。二者协调作用，共同维持狐狸的生长速度。生长激素释放激素在丘脑下部的弓状核和腹内侧核产生，合成后即经轴突运输并分泌到正中隆起，由此经垂体门脉系统到达腺垂体。然后刺激腺垂体产生生长激素。以人的生长激素释放激素为例加以说明人生长激素释放激素的前体是由108个氨基酸残基组成的多肽链，其中N端前20个氨基酸残基为信号肽序列，在穿膜时被切除，经过再加工，成熟的人生长激素释放激素含有44个氨基酸残基，44肽的顺序为 NH2-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-A Ia-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Ar g-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-COOH。该成熟蛋白经垂体门脉系统到达腺垂体，并与分泌GH 的嗜酸性细胞的膜上GHRH受体(GHRH-RP)结合，GHRH与受体结合后先激活一种对霍乱毒素敏感的(is蛋白，进而(is激活膜上的腺苷酸环化酶(AC)，使ATP转变为cAMP，导致cAMP 水平上升。而cAMP水平的上升又会促进cAMP依赖性蛋白酶激酶A的调节亚基构象的改变并活化，促进相关蛋白的磷酸化，进而影响到细胞的活性。cAMP引起的GH分泌有Ca2+依赖性，当GHRH作用到生长激素分泌细胞时，60秒内会使Ca2+的浓度提高，从而促进GH分泌。 有证据表明Ca2+的阻断可以终止cAMP对GH的释放作用。由此可见GHRH对GH的分泌是通过cAMP与Ca2+介导的，通过该过程调节GH的合成与释放[1]。由于GHRH呈脉冲式释放， 相应的垂体的GH也呈脉冲式波动。生长激素释放激素(GHRH) —般为44个氨基酸的多肽，完整的生物学活性决定于氨基酸的第1- 个氨基酸，半衰期7-50分钟，可见其作用时间之短。不同动物的生长激素释放激素分子大小略有不同，猪、牛、狗、人和绵羊等几种动物的GHRH蛋白发挥作用的活性形式是44个氨基酸残基的小肽。它们的同源性很高。如下所示狗YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNREQGAKVRL猪YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGARVRL牛YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL人YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL绵羊YADAIFTNSYRKILGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL相对应的不同动物生长激素释放激素的cDNA核苷酸序列的大小也有所不同，人的生长激素释放激素最早在1974被分离纯化并鉴定出来β]。目前很多动物包括人的生长激素释放激素cDNA基因已经被克隆并公之于众。人的cDNA序列为327个核苷酸，小鼠312，
3大鼠315，狗、牛、猪均为321个。多数序列都进行了专利保护。如中国专利02100065. 4保护了羊的生长激素释放激素的cDNA基因及其表达产物的应用。00813372. 7(超级活性的猪生长激素释放激素类似物)保护了优化了的猪GHRH的
核苷酸和氨基酸序列。03822291. 4 (GHRH类似物)保护了优化了的人GHRH的核苷酸序列和氨基酸。200610017214. 5保护了促进仔猪生长、提高仔猪免疫力的GHRH药物及制备方法。200510061609. 0保护了一种能促进人体长高的GHRH药物及其制剂。200710068659. 0保护了鹿茸促生长释放因子(DEER GHRF)提取及其制备方法。CN1615151 (用于治疗慢性病个体的质粒介导的补充)和CN1649496 (改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法)保护了根据不同动物基因序列进行了优化的GHRH的人工序列。CN1635898对具有超级活性的猪生长激素释放激素类似物进行了保护。美国专利7，351，815和7，361，642均对犬的生长激素释放激素的核苷酸序列和氨基酸序列进行了保护。早在1997年，Draghia-Akli等通过肌肉注射猪GHRH表达质粒，实现了促进猪体重增加的效果[3]后续的实验也进一步证实了同样的结果[4’5’6]。在狗[7]、绵羊[8]体内也获得了较成功的实验结果。

发明内容
本发明的目的是提供一种克隆获得的狐狸生长激素释放激素cDNA及其应用。为达到上述目的，我们根据其他动物GHRH的保守序列设计了一对引物上游引物为(如 SEQ ID No. 5 所示)5' ATGCCACTCTGGGTGTTC 3'，下游引物为(如 SEQ ID No. 6 所示)5' TCATCCTTGGGAGTTCC 3'。然后制备狐狸下丘脑的总RNA，然后进行反转录，再进行PCR，最后克隆获得了狐狸GHRH的cDNA。其全序列如SEQ IDNo. 4所示，其中GHRH成熟肽的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，它们分别编码的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 2和 SEQ ID No. 1 所示。根据本发明提供的狐狸GHRH成熟肽的cDNA，可以其为目的基因，采用真核表达载体如常用的PVAX1，将目的基因插入载体中，构建成真核表达载体，肌肉注射入狐狸腿部肌肉中，可获得狐狸生长速度加快，体重增加明显的结果。也可利用本发明提供的狐狸GHRH 全序列，将其在常规表达系统中大量表达，获得狐狸GHRH，用于制备可促进经济动物狐狸的生长的活性物质。


图1为本发明实施例构建的重组质粒的PCR鉴定图，其中1 :DL-2000plus Marker (5kb, 3kb, 2kb, Ikb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；2，3 阴性克隆；4，5 阳性克隆。图2为本发明实施例构建的重组质粒pMD19-GHRHS酶切鉴定图，其中1 :DL_2000 Marker (2kb, Ikb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；2 质粒 pMD 19-GHRHS ；3 :PCR 鉴定；4 阴性对照；5 =BamH I 单切；6 =Sph I 单切；7 =Sph I+BamH I 双切。
图3为本发明实施例构建的重组质粒pVAXl-GHRHS酶切鉴定图，其中1 :DL_2000 Marker (2kb, lkb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；2 :质粒 pVAXI-GHRHS ；3 =BamH I 单切；4 : Not I单切；5 :PCR鉴定；6 阴性对照；7 =Not I+BamH I双切。
具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以狐狸GHRH成熟肽的核苷酸序列为目的基因，以pVAXl为真核表达载体，将目的基因插入载体中，构建成真核表达载体，肌肉注射入狐狸腿部肌肉中，可获得狐狸生长速度加快，体重增加明显的结果。载体构建过程如下用PCR方法将人生长激素的信号肽基因序列与狐狸生长激素释放激素的成熟肽基因序列串联，连接到T载体上(pMD19-GHRHS)，再用BamH I和EcoR I 分别双切T载体上的目的基因和pVAXl空载体。将目的基因克隆入pVAXl载体中，经PCR 和测序鉴定后(参见图1)，再将PMD19-GHRHS和pVAXl-GHRHS载体进行酶切鉴定(参见图 2和3)。证实获得了 pVAXl-GHRHS表达载体。将纯化后的表达载体以50 μ g-100 μ g/只， 分别注射入20只2-4月龄的幼狐腿部肌肉，在取皮时称重，结果实验组比对照组平均增重高达800g。其中含人生长激素信号肽的上游引物ATGGCTACAGGCTCCCGGAC(如SEQ ID No. 7 所示)；下游引物CTATCAGAGTCGTACCTTTGCT (如 SEQ ID No. 8 所示)；PCR 反应条件 950C IOmin, 94°C 30sec，53°C 30sec，72°C 30sec30 个循环；72°C IOmin ；酶切条件37°C。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。参考文献1. Gracia-Navarro F, Castano JP, Malagon MM, Sanchez-Hormigo A, Luque RM, Hickey GJ, Peinado JR, Delgado Ε, Martinez-Fuentes AJ. Research progress in thestimulatory inputs regulating growth hormone (GH) secretion. Comp BiochemPhysiol B Biochem Mol Biol.2002 132(1) :141-50.2. Currie B. L, Johansson K. N. , Greibrokk T. , Folkers K. , Bowers C. Y. Identification and purification of factor A-GHRH from hypothalami which releasesgrowth hormone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974,60(2) :605_9o3. Draghia-Akli R, Fiorotto ML. A new ρIasmid-mediated approach tosupplement somatotropin production in pigs. J Anim Sci. 2004 82(13_suppl) E264-9。4.陈理银，郭荣富，相振田，冯宇。猪生产中pGRF基因质粒应用研究，猪业科学， 2006 8 :14-6.5.张勇，周安国，吴德，朱宇旌，王康宁，杨凤。仔猪骨骼肌注射pGRF基因质粒的促生长及代谢调控效应研究，畜牧兽医学报，2003 34(2) :147-51.6.张利宇，孙宝忠，王敏，种京华。生长激素释放因子(GRF)基因质粒的研究进展，黑龙江畜牧兽医，20069 :19-21.7. Draghia-Akli R, Cummings KK, Khan AS, Brown PA, Carpenter RH. Effectsof plasmid-mediated growth hormone releasing hormone supplementation in young, healthy Beagle dogs. J Anim Sci.2003 81(9) :2301-10.8. Meng QY,Chen ZQ,Yu ZQ,Xie QF,Li N. Increased body weight viainjecting myogenic Expression gowth hormone-releasing hormone (GHRH) ρIasmidDNA into sheep. Anim Biotech. 2004 15(2) :175-92.
权利要求
1.一种狐狸生长激素释放激素，其特征在于，其成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所7J\ ο
2.如权利要求1所述的狐狸生长激素释放激素，其特征在于，包括其前体肽的完整的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.编码权利要求1所述的狐狸生长激素释放激素的成熟肽的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
4.编码权利要求2所述的狐狸生长激素释放激素的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 4 所示。
5.含有权利要求3或4所述cDNA的表达载体。
6.含有权利要求5所述表达载体的宿主。
7.权利要求3或4所述的cDNA在制备可促进狐狸生长的活性物质中的应用。
8.含有权利要求1或2所述的狐狸生长激素释放激素的活性物质，其可促进狐狸生长。
全文摘要
本发明公开了狐狸生长激素释放激素cDNA基因的全长核苷酸序列和成熟肽的核苷酸序列以及其分别编码的蛋白质的氨基酸序列。狐狸的生长激素释放激素的cDNA序列是一个完整的开放阅读框，共321个核苷酸序列，共编码106个氨基酸；其成熟肽由132个核苷酸序列编码，共编码44个氨基酸残基。本发明可用于狐狸等经济动物的促生长。
文档编号A61K38/25GK102399284SQ20101028638
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月17日 优先权日2010年9月17日
发明者刘维全, 刘芃芃, 王吉贵, 齐顺章 申请人:中国农业大学