专利名称：一株栅藻及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域,尤其涉及一种栅藻ENN34 (Scenedesmus sp.)及其应用。
背景技术：
随着世界化石燃料储备量的逐步耗竭，二氧化碳排放量的不断增加以及全球气候的日益趋暖，人类的生存和发展状况已经面临前所未有的挑战。因此，因此，世界各国都在积极寻找能够替代石油产品的可再生能源，其中，生物柴油就是一种重要的生物能源，然而，常见的油料作物例如玉米和大豆等培育周期较长，占用农田较多，会产生“与人争粮，与粮争地”问题，从而导致“解决了能源危机，却出现粮食危机”的尴尬结果。微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富，生长周期短，光合利用度高的以光
合自养产生能量的低等植物，是自然界起源最早、分布最广、种类和数量最大的生物质资源。在一定条件下许多微藻能够在细胞中大量积累储藏性三酰甘油(微藻油)(类似于植物油)，其最高含量可达到细胞干重的50%以上。与高等陆生油料作物相比，微藻的单位面积油产量是油料植物油产量的数十倍，经过生物冶炼可以生产生物柴油等多种生物燃料，被认为是最有可能最有潜力成为石油替代品的生物质资源。除了油产量非常高之外，微藻还富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、各种氨基酸、维生素、抗生素、高不饱和脂肪酸以及其它多种生物活性物质，因此，在保健食品、医药和饲料等领域也同样具有很好的开发前景。此外，微藻的环境适应能力非常强，对营养的要求也很简单，可在各种严苛环境下生长。例如,微藻可通过光合作用吸收污水中的硝酸盐、亚硝酸盐、铵盐、磷酸盐等无机盐的氮磷合成氨基酸、蛋白质、磷脂等有机物，形成微藻细胞，从而降低水体中的氮磷含量，因此微藻可用于去除污水中的氮磷。微藻还可利用工业废气中的CO2，减少CO2的排放。因此微藻在无论是工业环境保护方面还是城市环境保护方面也都有很好的应用前景。还有一些微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠等不适宜进行耕种的土地进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，被誉为可循环的“绿色油田”，因此发展微藻培养及其相关工业也非常适合土地尤其是耕地资源相对紧缺的我国。目前国内外都积极开展了对于微藻的开发尤其是其在生物能源应用方面的开发，这其中以对小球藻的研究居多。CN101565675公开了一种小球藻及其培养方法和它在生物柴油生产中的应用；CN101824386公开了一株小球藻，及其在生产微藻油脂和固定CO2中的应用；CN102093955公开了一株小球藻及其在利用污水培养与生物柴油转化体系中的应用；CN102229889公开了一株小球藻及其培养方法和在CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸等生物质的生产应用。栅藻是淡水中常见的浮游微藻，极喜在营养丰富的静水中繁殖。许多种类对有机污染物具有较强的耐性，在水质评价中可作为指示生物，并且在水体自净和污水净化中有一定作用，是有机污水氧化塘生物相中的优势种类。它可与细菌同时附着在水中有机物碎片和其他水生植物体上，形成胶质层，吸附有机物。栅藻进行光合作用时，一方面产生氧气供细菌分解有机质的需要，另一方面还可直接利用有机质作为碳源和氮源，使水中有机物迅速降解，从而净化水体。栅藻细胞内含有丰富的蛋白质和维生素，是鱼类很好的饲料，如利用有机污水氧化塘养鱼，可获高产。大量繁殖的藻体也可作家禽的饲料。目前国内外对于栅藻的开发还不是很多，CN102083957公开了一种具有高效去除二氧化碳特征性的凸头状栅藻原变种微藻及其用途，尤其是二氧化碳固定率高的凸头状栅藻原变种微藻及其用途；CN102250773公开了一株栅藻及其培养方法和在CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸等生物质的生产等领域中的应用。尽管微藻具有非常良好的能源、环境保护甚至医药等开发前景，并且相关的研究工作也已经逐渐展开，但是目前已知的微藻，尤其是栅藻，在油脂含量、对CO2的处理能力等方面的性能上还普遍偏低，因此需要有性能更好，更适于工业应用的栅藻。

发明内容
本发明的目的在于提供一种对环境适应能力强，油脂含量高，对CO2的处理能力强的更加适于工业应用的栅藻。为达此目的，本发明采用以下技术方案在第一方面,本发明提供了一种栅藻ENN34 (Scenedesmus sp.),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2012年07月13日，保藏号为CGMCC No. 6348。本发明提供的栅藻ENN34中脂肪酸在藻粉中的含量可以大于40%干重，优选地大于50%干重，更优选地为53°/Γ55%干重。。本发明提供的栅藻ΕΝΝ34可以含有O. 02%干重的虾青素、O. 02%干重的β -胡萝卜素、O. 003%干重的叶黄素、O. 08%干重的玉米黄质和O. 03%干重的角黄素。在第二方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ΕΝΝ34的培养方法，所述方法包括将栅藻藻株ENN 34绿色细胞接种在BGll培养基中，其中光照强度50-500umol/m2. s,优选 100-450umol/m2. S、更优选 150-400umol/m2. S、还更优选 200-350umol/m2. S、最优选250-300umol/m2. s，pH 值 7-9、优选 7. 5-8. 5，更优选 8，温度 15-35°C、优选 20_30°C、更优选25。。。在本发明的栅藻ENN34的培养方法中，光照强度可以为50umol/m2. s、80umol/m2. s、100umol/m2· S、120umol/m2· s、150umol/m2· s、180umol/m2· s、200umol/m2· s、220umol/m2. s、250umol/m2· s、280umol/m2· s、300umol/m2· s、320umol/m2· s、350umol/m2· s、380umol/m2. s、400umol/m2· s、420umol/m2· s、450umol/m2· s、480umol/m2· s 或 500umol/m2. s ；pH 值可以为 7、7· 2、7· 5、7· 8、8、8. 2、8· 5、8· 8 或 9 ;温度可以为 15°C、16°C、17°C、18°C、19°C、20°C、21。。、22。。、23。。、24。。、25。。、26。。、27。。、28。。、29。。、30。。、31。。、32。。、33。。、34。。或 35。。。在第三方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ENN34在脂肪酸生产中的应用，优选地，所述脂肪酸是棕榈酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α -亚麻酸、Y -亚麻酸和/或二十碳五烯酸。在第四方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ΕΝΝ34在生物燃料生产中的应用，优选地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
在第五方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ENN34在环境保护中的应用，优选地所述环境保护为污水处理或CO2减排，所述污水处理包括污水的脱氮、除磷、有机物降解和/或重金属离子吸附。在第六方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ENN34在包含棕榈酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、虾青素、β_胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的药物制备中的应用。在第七方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ΕΝΝ34在包含棕榈酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、虾青素、β_胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的食品、保健品、饲料和/或水产品饵料生产中的应用。在第八方面，本发明提供了如第一方面所述的栅藻ΕΝΝ34在包含棕榈酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、虾青 素、β -胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的化工产品生产中的应用，优选地所述化工产品是色素或化妆品。在本发明中，BGll培养基为本领域中最常用的藻类培养基，其具体组分见下文。本发明的有益技术效果为I、本藻种生长速度快，CO2利用率高，且细胞沉降性好，便于收集，适宜于高密度养殖，适合产业化推广2、本藻种油脂积累快，含油量高，适合用来生产生物柴油3、本藻种能有效去除水中的氮，适宜用于废水处理4、本藻种经诱导后，细胞呈现红色，含有部分有益的色素，适合用于生产饲料。


图I是本发明的栅藻ΕΝΝ34在显微镜下的镜检图片。图2显示本发明的栅藻ΕΝΝ34的18S序列在GenBank数据库中进行BLAST比对的结果。图3是采用邻位相连(Neighbor-joining)算法构建的栅藻ENN34的系统发育进化树。图4是本发明的栅藻ENN34的室内培养生长曲线。图5是本发明的栅藻ENN34中所含色素的色谱图。图6是表示本发明的栅藻ENN34中各色素的含量的柱形图。图7是本发明的栅藻ENN34的室外培养生长曲线。图8是显示本发明的栅藻ENN34对培养基中氮的消耗的曲线图。
具体实施例方式下面结合附图并通过具体实施方式
来进一步说明本发明的技术方案。实施例I筛选产油栅藻藻株在云南滇池中取水样，加入1/3体积的BGll培养基，在25 °C、光照强度为40ymol/m2. s的条件下培养5天左右，取该水样于显微镜下观察，判断水样中存在的主要物种。调整细胞浓度约为1000个/ml，取100 μ I水样涂布于BGll培养基的固体琼脂板上，在25°C、光照强度为40ymOl/m2. s左右的条件下培养10天左右，即可看到单藻落长出，用接种环或无菌牙签挑取单藻落接种于BGll培养基中培养。重复此过程，直到获得纯培养的藻株，本发明中对其编号称为“ΕΝΝ34”。实施例2鉴定藻种及其在进化树上的分类。藻株鉴定采取形态鉴定和分子鉴定相结合的方法。I.形态鉴定(见图I):对上述分离出的藻株ΕΝΝ34在1000倍镜下进行观察，细胞为球形，大小6-10um，色素体周生，一个蛋白核，无性生殖产生似亲孢子。初步鉴定为栅藻。2.分子鉴定A，从分离的藻扩增其18S核苷酸序列
用CTAB法提取培养4天的ENN 34藻基因组DNA。取一定量的细胞，研磨处理后加入适量CTAB缓冲液，匀浆，加入等体积的酚氯仿抽提，等体积异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤后溶于一定体积灭菌双蒸水中，紫外分光光度计检测其浓度和纯度。18S序列扩增采用真核生物18S扩增通用引物(引物合成由上海生工生物工程公司合成)。引物15，CCTGGTTGATCCTGCCAG 3，(SEQ ID NO: I)引物25，TTGATCCTTCTGCAGGTTCA3，(SEQ ID NO:2)取I μ I总DNA为模板。扩增条件如下94°C变性5min，然后94°C 40s, 56°C 40s，72°C 2min 30个循环，最后72°C IOmin0 I. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物，PCR扩增获得约1700bp片断。序列如下(下划线部分为引物序列)CCTGGTTGATCCTGCCAGCTATGTCGACTTCTCTTCTCTAGGTGGGAGGGTTTA ATGAACTTCTCGGCAGACCTGAGGTGTTGCCACCCTAAGCTGCCAATCCGAACACTT CACCAGCACACCCAATCGGTAGGAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGT AATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGACTAATAA TTGCAATAATCTATCCCCATCACGATGCAGTTTCAAAGATTACCCAGACCCTTCGGT CAAGGATAGGCTTGTTGAATGCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAA GGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCATACTTCCATTGACTAAACGCCAATAGTCCC TCTAAGAAGTCAGCCAGCTGCAAAAAGCAACAGAGACTATTTAGCAGGCTGAGGTCT CGTTCGTTACCGGAATCAACCTGACAAGGCAACCCACCAACTAAGAACGGCCATGCA CCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTCACTATGTCTGG ACCTGGTAAGTTTTCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTGGTGG TGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACC CAAAAACTTTGATTTCTCATAAGGTGCTGGCGAAGTCATTGAAAAAACATTCGCCAA TCCCTAGTCGGCATCGTTTATGGTTGAGACTACGACGGTATCTAATCGTCTTCGAGC CCCCAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTAGT TCGTCTTTCATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATGAAATACGAATGCCCCCGA CTGTCCCTCTTAATCATTACTCCGGTCCTACAGACCAACAAGATAGGCCAGAGTCCT ATCGTGTTATTCCATGCTAAAGTATTCTGGCGTAAGCCTGCTTTGAACACTCTAATT TACTCAAAGTAACCACGTCGACTCCGAGTCCCGGACAGTGAAGCCCAGAAGCCCGTC CCCGACAGAAAGGAAGGCCATAGCAGTACTCACCATAGGCGGACCGCTAGAACCCAC CCGAAATCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTAAATATACGCTATTGGAGC TGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATGGATCCTCGTTAAGGG ATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACCAGACATGAAATGCCCGGTATTGTTATTTAT TGTCACTACCTCCCCGTATCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGG ATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATCCTCCGTCAC CCGTTACCACCATGGTAGGCCTCTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATT TGAATGGAACAGCGCCGGCACAAGGCCATGCGCTTCGTGAAGATATCATGATTCACC GCGGGTCGAGCAAAGCTCGGTCGGCCTTTTATCTAATATATACGTCCCTTCCAGAAG TCGGGATTTACGCACGTATTAGCTCTAGAATTACTACGGTTATCCGAGTAGTAAGGT ACCACCAAATAAACTATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAAGC AGTTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATGACTACTGGCA GTCCAAACCCTGAACCTGCAGAAGGATCAA (SEQ ID NO:3)。B，对所克隆的核苷酸序列进行同源性搜索将获得的ENN 34的18S序列在GenBank数据库进行BLAST比对，结果显示与登录号为X74002. I的Scenedesmus rubescens的18S小亚基rRNA的基因序列最为相似，匹配度为99%，覆盖率为99% (图2)。 C，根据上述序列作出进化树。利用NCBI数据库中的BLAST工具对藻株ENN 34的18S部分序列进行序列相似性分析。选取部分同源序列和该藻株的18S部分序列利用clustaLx软件包进行序列同源进化比对，形成一个多重序列匹配排列矩阵。然后，运用Mega4. O软件，采用邻位相连算法，自展数据集bootstraps值为1000构建系统发育进化树,见图3。根据18Sblast的结果，限定ENN34为栅藻属(Scenedesmus)发明人已将所述藻株于于2012年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，简称CGMCC)，其保藏编号为CGMCCNO. 6348。实例3 ENN34藻的室内养殖、油脂积累及色素分析将处在对数生长期的栅藻藻株ENN 34绿色细胞接种在配制好的BGll培养基(配方见表I)中，使细胞密度达到0D750为O. 2-0. 8之间。培养过程光照强度控制在50-500umol/m2. s，在培养期内，通过向培养液中通入I. 5-2%的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的PH值调节在7-9之间，温度调控在15-35°C范围内。培养所使用的反应器为40_内径、长度600_的柱式反应器。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图4。培养进行到第16天，藻液颜色变红时，将藻液收集，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥在进行真空冷冻干燥。表I BGll培养基配方
权利要求
1.一种栅藻ENN34(Scenedesmus sp.),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2012年07月13日，保藏号为CGMCC No. 6348。
2.根据权利要求I所述的栅藻ENN34，其特征在于，所述栅藻ENN34中脂肪酸的含量为大于40%干重，优选地大于50%干重，更优选地为53°/Γ60%干重。
3.根据权利要求I所述的栅藻ΕΝΝ34，其特征在于，所述栅藻ΕΝΝ34含有O.02%-0. 1%干重的虾青素、O. 02-0. 1%干重的β -胡萝卜素、O. 003-0. 01%干重的叶黄素、O. 08-0. 2%干重的玉米黄质和O. 03-0. 1%干重的角黄素。
4.如权利要求I至3中任一项所述的栅藻ΕΝΝ34的培养方法，所述方法包括将栅藻藻株ΕΝΝ34绿色细胞接种在BGlI培养基中，其中光照强度50-500umol/m2. s,优选 100-450umol/m2. S、更优选 150-400umol/m2. S、还更优选 200-350umol/m2. S、最优选250-300umol/m2. s，pH 值 7-9、优选 7. 5-8. 5，更优选 8，温度 15-35°C、优选 20_30°C、更优选25。。。
5.如权利要求I至3中任一项所述的栅藻ENN34在脂肪酸生产中的应用，优选地，所述脂肪酸是棕榈酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸和/或二十碳五烯酸。
6.如权利要求I至3中任一项所述的栅藻ΕΝΝ34在生物燃料生产中的应用，优选地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
7.如权利要求I至3中任一项所述的栅藻ΕΝΝ34在环境保护中的应用，优选地所述环境保护为污水处理或CO2减排，所述污水处理包括污水的脱氮、除磷、有机物降解和/或重金属离子吸附。
8.如权利要求I至3中任一项所述的栅藻ΕΝΝ34在包含棕榈酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、虾青素、胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的药物的制备中的应用。
9.如权利要求I至3中任一项所述的栅藻ΕΝΝ34在包含棕榈酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、虾青素、胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的食品、保健品和/或饲料生产中的应用。
10.如权利要求I至3中任一项所述的栅藻ΕΝΝ34在包含棕榈酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、十八碳四烯酸、α-亚麻酸、Y-亚麻酸、二十碳五烯酸、虾青素、胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和/或角黄素的化工产品生产中的应用，优选地所述化工产品是色素或化妆品。
全文摘要
本发明公开了一株栅藻(Scenedesmus sp.)及其应用，本发明的栅藻具有生长速度快、油脂积累快、含油量高、能够有效去除水中的含氮化合物等优点，并且含有适合部分有益的色素，可用于生物柴油生产，食品、保健品、饲料、水产品饵料生产以及化妆品和色素产品等化工产品的生产。
文档编号A61K8/97GK102943044SQ201210320220
公开日2013年2月27日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者罗少敬, 黄龙耀, 马建源, 吴洪, 邓平 申请人:新奥科技发展有限公司