专利名称：重组人Prx-6蛋白在治疗角膜损伤方面的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体地说，涉及重组人Prx-6蛋白在治疗角膜损伤方面的用途。
背景技术：
眼睛是对紫外辐射最为敏感的部位。研究表明，波长230nm的紫外线可全部为角膜上皮吸收，280nm的紫外线对角膜损伤力最大。紫外线被角膜上皮细胞吸收后,会产生大量的氧自由基，发生脂质过氧化作用，引起细胞死亡，细胞溶解脱落后会释放大量炎症刺激 因子，一般在暴露后6 10小时出现迅即加重的异物刺痛感和随之而来的畏光、流泪等症状，严重的会发生角膜上皮水肿、脱落、透明度下降等。在紫外线辐射较强的地区，上述影响十分明显。如在阳光照耀的海面上或沙漠中长期了望的士兵、海员，常有暗适应能力下降的现象出现；在空气稀薄的雪山高原上，工作人员因受雪面强烈反射的紫外反射的损伤，易患雪盲症；人们在雪地、沙漠或海面上暴露时间过长，因受紫外辐射影响较强，易患日光性眼炎；焊工直接暴露在电弧光下每天累计15分钟，即可发生上述病症,称为电光性眼炎。目前治疗主要为对症、全身用止痛镇静药物，冷敷眼睑，包扎遮光，严重者可在结膜囊内滴入少量局部麻醉药0.5%地卡因，并用抗生素眼药水预防继发感染。大多都没有针对角膜上皮细胞损伤的修复、清除自由基等治疗措施。Peroxiredoxins (Prxs)是新近发现的一类非硒依赖过氧化物酶家族蛋白，广泛存在于各种生物体内。根据Prxs蛋白保守cys个数的不同(I个或2个)，可分为I-Cys或2-Cys亚类。迄今，已在哺乳动物组织中发现了 6种Prxs蛋白。其中Prx 1_5为2_Cys酶，以硫氧还蛋白作为电子供体；Prx-6蛋白是哺乳动物中唯一的I-Cys酶，以谷胱苷肽(GSH)为电子供体(还原剂)。Prx-6蛋白首先是在牛眼睫状体中被分离获得的，又名LTW4、抗氧化蛋白2、Clara细胞蛋白26、p67吞噬细胞氧化酶(phox)结合蛋白、角质化细胞生长因子(KGF)调节基因I等，由224个氨基酸组成，分子量为25. IKDa0分析该蛋白的晶体结构，发现了一个由80个氨基酸组成的硫氧还蛋白折叠，其中包含四个3折叠和两个a螺旋。大量研究表明，硫氧还蛋白折叠结构在一些参与氧化还原反应的蛋白(如硫氧还蛋白、谷氧还蛋白、GPxl蛋白、谷胱甘肽S-转移酶等)中普遍存在。另外，尽管Prx-6和GPxl蛋白的一级结构只有17%的同源性，但是它们的三级结构具有极高的同源性。这种结构上的相似性，预示着这两种蛋白在功能上的相关。从初期细胞实验到近年来动物体内实验，越来越多的研究证明了 Prx-6蛋白具有抗氧化损伤功能。细胞水平的研究表明，过表达Prx-6蛋白能明显减少脂质过氧化作用，降低细胞质膜损伤；抑制Prx-6蛋白的表达，可观察到明显的脂质过氧化、脂膜损伤及细胞凋亡。活体水平研究表明，Prx-6转基因小鼠对高氧损伤有显著的保护作用；Prx-6敲除小鼠的抗氧化损伤能力明显降低。我们在研究人类精子成熟时，发现Prx-6蛋白由人附睾分泌到附睾管腔液中，能够结合在精子赤道、顶体后和主段(编号为HEL-S-128m，已注册于国际人类组织基因库GenBank,登录号EU794652)，具有较强的保护精子细胞抗过氧化损伤的功能，论文发表在美国杂志 Mol Cell Proteomics. 2010. 9(11) : 2517-2528。
鉴于Prx-6自身的生物学特性，我们将其用于烧烫伤的治疗，取得了良好的疗效，并已申请专利(申请号201010573594. 7)。我们推测Prx_6在治疗其他与氧化损伤相关的疾病中也有重要的作用。以往的研究主要是关于Prx-6蛋白在心脏、肺或皮肤组织中的抗氧化损伤作用，并未涉及到Prx-6蛋白在治疗角膜损伤方面的用途。据对青藏高原武警官兵眼晶状体混浊度调查显示，驻拉萨市武警官兵(年龄25岁 以上的志愿兵、机关和基层干部)，眼晶状体混浊发病率高达39. 56%，并且发病率与被调查者进藏的时间增长成正比。可见紫外线对我军官兵的眼睛健康造成了严重的威胁(http://www. ynnw. gov. cn/Modules/Document/infoShowl. aspx kid=80375)。但目前还没有理想有效的治疗药物，为此我们根据Prx-6蛋白的功能，首次进行了保护和治疗紫外线损伤眼睛的治疗性研究，获得了显著疗效。综上所述，本中心首次将Prx-6蛋白用于治疗紫外线造成的角膜损伤并取得了良好疗效，填补了针对角膜损伤病因的治疗药物空白。

发明内容
本发明的目的是提供重组人Prx-6蛋白在治疗角膜损伤方面的应用。在本发明的第一方面，提供了一种Prx-6蛋白在制备治疗角膜损伤的药物中的用途。在另一优选例中,所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的蛋白或其与表达标签(如6XHis)形成的融合蛋白。在本发明的第二方面，提供了一种用于治疗角膜损伤的药物组合物，所述的药物组合物含有Prx-6蛋白以及药学上可接受的载体，并且所述的药物组合物为眼用制剂。在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。在另一优选例中，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。在另一优选例中，所述的眼用制剂是滴眼液、眼用凝胶或眼膏。在本发明的第三方面，提供了一种治疗角膜损伤的方法，包括步骤对需要治疗的对象，将Prx-6蛋白或本发明第二方面中所述的药物组合物滴入或涂入结膜囊内。在另一优选例中，所述的治疗包括抑制角膜新生血管的生成；修复受损的角膜上皮细胞；减轻角膜水肿，恢复角膜透明度及视力；清除自由基抗氧化，促进炎症病变组织恢复。在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物(包括人)。在另一优选例中，所述的施用包括滴入或涂入。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再
累述。


图I显示了 Prx-6基因PCR扩增结果。泳道I :空白对照；泳道2 Prx-6 ; M 分子量标准品。图2显示了 Prx-6蛋白亲和纯化色谱图。峰I :杂蛋白；峰2 Prx-6目的蛋白。
图3显示了 Prx-6蛋白纯化电泳图(12%SDS_PAGE)。泳道I :蛋白分子量标准品 (Fermentas);泳道2 :亲和层析纯化并脱盐后的Prx_6蛋白；泳道3 :峰I ;泳道4 :上样穿出蛋白；泳道5 :破菌上清(上样的样品)。图4显示了重组Prx-6蛋白对HEF细胞的抗氧化保护作用(P〈0. 05)。图5显示了重组Prx-6蛋白对H9C2细胞的抗氧化保护作用(P〈0. 05)。图6显示了用裂隙灯显微镜观察重组Prx-6蛋白治疗大鼠角膜损伤的结果。图中，各图片从左至右依次为对照组(2只)；Prx-6组(2只)。从上至下依次为紫外线照射前；紫外线照射后；治疗4天；治疗8天；治疗12天。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，除了发现Prx-6蛋白具有抗氧化作用可保护ffiF等细胞之外，还首次发现Prx-6蛋白具有修复紫外线造成的角膜损伤的作用。在此基础上完成了本发明。具体地，本发明的重组人Prx-6蛋白可直接滴入结膜囊内，能有效的抑制角膜新生血管的生成；清除紫外线产生的大量氧自由基，修复受损的角膜上皮细胞，促进炎症病变组织恢复，减轻疼痛；减轻角膜水肿，恢复角膜透明度及视力。具有刺激性小、可有效控制感染、疗程短等优点。Prx-6 蛋白
如本文所用，术语“本发明蛋白”、“ Peroxiredoxins蛋白” “prdx6蛋白”、“Prx_6蛋白” “过氧化氧化还原蛋白”等可互换使用，都指具有人Prx-6氨基酸序列的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始的甲硫氨酸。应理解，这些术语既包括人(源)的蛋白，也包括在其他哺乳动物(如狗、牛、羊、猴、啮齿动物(如小鼠))中的具有同种功能的同系物或同源蛋白。此外，该术语包括野生型和突变型Prx-6蛋白。人prx-6基因的 cDNA 序列 GenBank登录号NM_004905. 2，如 SEQ ID NO: I 所示。人Prx-6的氨基酸序列的登录号为NP_004896，如SEQ ID NO: 2所示。应理解，由于人等哺乳动物的prdx6蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本领域常规的DNA重组技术而获得其蛋白。一类特别优选的蛋白是Prx-6类似物，即在其他哺乳动物(如牛、羊、兔、狗、猴、鼠等)中Prx-6的同源蛋白。这些其他物种的同源蛋白的编码序列，可根据prdx6的序列，通过杂交或扩增的方法而获得，进而通过常规重组方法获得这些同源蛋白。药物组合物和施用方法
本发明还提供了药物组合物，它含有安全有效量的本发明prx-6蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、泊洛沙姆、卡波姆及其组合。例如，可将本发明蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为6-8，较佳地pH约为6. 8-7. 6，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)局部给药、结膜下注射等。一种优选的方式是直接滴入或涂入结膜囊内。
药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成滴眼液、眼用凝胶或眼膏的形式，宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。此外，本发明的蛋白还可与治疗角膜损伤的其他治疗剂一起使用。在优选例中，可将本发明蛋白按0. 05-0. 2mg/次的用量直接滴入或涂入结膜囊内。本发明的主要优点包括
(I)开发了人Prx-6蛋白新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。紫外线照射照成的角膜损伤，在滴入或涂入Prx-6蛋白后，能有效的抑制角膜新生血管的生成；清除紫外线产生的大量氧自由基，修复受损的角膜上皮细胞，促进炎症病变组织恢复，减轻疼痛；减轻角膜水肿，恢复角膜透明度及视力。具有刺激性小、可有效控制感染、疗程短等优点。(2) Prx-6蛋白是源自人的蛋白，使用安全无毒副作用，有很好的药用前景。(3)人Prx-6蛋白做成滴眼液、眼用凝胶或眼膏等，使用方便。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。实施例I pET32b(+)/Prx-6表达载体构建
根据编码Prx-6成熟蛋白的基因序列设计并合成了一对特异引物(上游引物5’ - tatccatatgcccggaggtctgcttc - 3’ (SEQ ID NO: 3),下游引物5’ -ttactcgagaggctggggtgtgtagcg - 3’ (SEQ ID NO: 4)),酶切位点分别为 UeI 及ZAoI,
以实验室制备的人附睾cDNA文库为模板，进行PCR扩增。结果见图1，检测到与理论值相符的688bp的扩增片段。用胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目的片段，用RXhol进行双酶切。然后，将经过双酶切的片段连接到已用和通ol切成线性的pET32b(+)表达载体(购自Novagen)中，转化常规的大肠杆菌T0P10F’(购自Invitrogen)。通过菌落PCR的方法筛选阳性克隆，并测序进一步证实序列及表达阅读框的正确性，得到重组表达质粒pET32b (+) /Prx-6。该表达载体所表达的Prx-6蛋白在C端附加8个氨基酸LEHHHHHH，以便于分离纯化。实施例2 Prx-6蛋白的表达
将质粒pET32b (+) /Prx-6转化大肠杆菌Origami B (DE3)(购自Novagen),将阳性克隆接种于含IOOii g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C摇床培养过夜。次日按I :100转接于含IOOii g /ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C摇床培养至菌密度OD6tltl=O. 6 0. 8后，力口A IPTG至终浓度0. 4mM以诱导目的蛋白Prx_6的表达，3_4h后离心收集菌体。实施例3 Prx-6蛋白的纯化
将离心收集的菌体重悬于缓冲液A中(20mM磷酸盐缓冲液，150mM氯化钠，pH7. 2)，冰浴中超声破碎，20000g低温(4°C)离心15min取上清为待纯化的样品。使用缓冲液A平衡镍亲和层析柱后，将样品上柱，然后用含50mM咪唑的缓冲液A冲洗柱子去除杂蛋白(峰I)，用含300mM咪唑的缓冲液A将目的蛋白洗脱下来(峰2)(见图2)。最后用G-25脱盐柱将洗脱的蛋白置换于缓冲液A中以去除咪唑，SDS-PAGE电泳检测。经分析，获得了纯度在95%以上Prx-6蛋白，分子量约26. lkD。(见图3)。实施例4蛋白的抗氧化活性(HEF细胞氧化损伤实验)
HEF细胞为常用的人胚胎成纤维细胞(Zavada et al. , Nature New Biology, 240:124-125 (1972) ^US 7，811，817)。用培养基(高糖 DMEM+5%FBS)复苏细胞，培养 48h，待细胞长至90%汇合后，按照下面实验方法先将实施例3中获得的Prx-6蛋白(Prdx-6-His融合蛋白)加入培养体系中，再加入H2O2，作用30min后，MTT方法检测细胞存活率。实验设计
H2O2 浓度(lmM、0. 5 mM、0. 25 mM、0. 125 mM、0 mM)
Prdx-6-His 浓度(0. 5mg/ml、0. 25 mg/ml >0. 125 mg/ml >0 mg/ml)
各实验组的H2O2和Prdx-6-His浓度如表I所示。表I
权利要求
1.一种Prx-6蛋白在制备治疗角膜损伤的药物中的用途。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。
3.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。
4.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白包括氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示的蛋白或其与表达标签形成的融合蛋白。
5.一种用于治疗角膜损伤的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有Prx-6蛋白以及药学上可接受的载体，并且所述的药物组合物为眼用制剂。
6.如权利要求5所述的药物组合物,其特征在于,所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。
7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是重组蛋白。
8.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的眼用制剂是滴眼液、眼用凝胶或眼膏。
9.一种治疗角膜损伤的方法，其特征在于，包括步骤对需要治疗的对象，将Prx-6蛋白或权利要求5所述的药物组合物滴入或涂入结膜囊内。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的治疗包括抑制角膜新生血管的生成；修复受损的角膜上皮细胞；减轻角膜水肿，恢复角膜透明度及视力；清除自由基抗氧化，促进炎症病变组织恢复。
全文摘要
本发明提供了重组人Prx-6蛋白在治疗角膜损伤方面的用途。具体的，本发明提供了人Prx-6蛋白在制备治疗角膜损伤的药物中的用途。本发明的实验表明，Prx-6蛋白在治疗角膜损伤过程中有抑制角膜新生血管的生成；修复受损的角膜上皮细胞；减轻角膜水肿，恢复角膜透明度及视力；清除自由基抗氧化，促进炎症病变组织恢复等作用。
文档编号A61K38/44GK102793911SQ20111013670
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月24日 优先权日2011年5月24日
发明者李建远 申请人:李建远