专利名称：取代的二环[3.3.1]壬烷－2,4,9三酮作为活性药物成分的制作方法
技术领域：
本发明是涉及取代的二环[3.3.1]壬烷-2，4，9三酮的使用，特别是克鲁西(clusianone)或克鲁西的衍生物作为活性药物成分或药剂中的活性成分，特别是用于产生用来预防性和/或治疗性(医疗性)处理肿瘤或癌症疾病以及病毒疾病的药物。即，本发明是涉及取代的二环[3.3.1]壬烷-2，4，9三酮作为药物或药物组合物的药物活性成分，特别是细胞抑制的和抗病毒的组合物(病毒抑制)。本发明进一步涉及取代的二环[3.3.1]壬烷-2，4，9三酮作为拓扑异构酶抑制物和/或端粒酶抑制物以及作为MAP激酶信号转导通路的调控物。
肿瘤或癌症疾病不是一种单一的病理状态，而是对于大量不同类型的恶性疾病的总称。实际上机体的每个组织都可能发生癌性病变，有时甚至是几种不同类型。反过来，每种病症都有其自身的特征。导致这种疾病的原因经常是不同的。
尽管有这种多样性，实际上所有肿瘤或癌性病变都由非常相似的基本分子或细胞过程所产生。过去二十年的研究已经在分子水平使人们对癌症发生和肿瘤发生的基本过程的知识有惊人的进展。
遗传信息是由细胞核内的染色体的DNA分子所携带。仅占细胞中总量的很小一部分的两类基因在癌症的发展中起了重要的作用，即原癌基因(癌基因前体)和抑癌基因(抑制肿瘤的基因)。在它们正常的形态中，它们指导细胞的生命周期，它们控制着过程的复杂顺序，使细胞变得更大，或者如果必要，使细胞分解。这两类基因共同作为人肿瘤中大量的的未受控制的细胞增殖过程的根源例如，在调控区域或在结构区域的原癌基因发生突变，然后可能有大量的生长促进蛋白产生，或者是该生长促进蛋白具有过度的活性；原癌基因已经成为一类刺激细胞能够过度增殖的促进癌症的致癌基因。与之相对比，抑癌基因如果因突变失去活性，会导致癌症的发展；结果细胞失去具有功能的抑癌蛋白，以及能够正常防止细胞不正常增殖的关键性生长阻滞物。
一种针对无限制性增殖的应急机制包括在正常的细胞之中，其还包括一类计数器能够记录每个细胞分裂并在一定数量传代后使之停止。在经历一定数量的细胞分裂或倍增后，该过程可以被大致的预计，正常细胞的生长停止。该过程被称之为细胞的老化或衰老。
在细胞水平负责细胞老化或衰老过程的是染色体末端的DNA片段称之为端粒。它们记录着细胞群经历多少个增殖循环过程，并在特定的时间后，启动衰老或临界。通过这种方式它们限制着细胞群无限制生长的能力。在最健康的人类细胞中，当每次细胞分裂染色体发生复制时，端粒被缩短一个片段。当它们被缩小到特定的临界长度时，这对于细胞是进入衰老阶段的信号；如果细胞忽视这个警告，端粒被进一步缩短直到最终的临界点发生当端粒非常短时，染色体或其片段就相互连接并诱发对细胞致死的遗传紊乱。
正常细胞所经历的老化或衰老过程，即失去分裂的能力，依赖于正常死亡的细胞中染色体在每个细胞分裂后在其端粒末端失去50到200个DNA核苷酸。这些末端核苷酸(端粒)的丢失具有有丝分裂时钟的功能，其记录着细胞分裂的数目。端粒的保留表现出对于细胞逃避衰老过程并能够无限分裂是必须的。
上述的保护性机制在多数癌症和肿瘤细胞的恶化过程中被去活化，特别是通过活化一个包含能够产生端粒酶的基因。这种酶能够系统性的补充被缩短的端粒部分，并永久的维持从而使细胞能够没有限制的分裂。因此，在多数肿瘤或癌症疾病中，细胞的永生性是由于端粒酶的活性产生的短的但稳定的端粒的保留。所产生的细胞潜在的永生性在几个方面都是不利的首先，它对肿瘤变得非常大有作用；第二，它给予前体癌细胞或已经为真性癌细胞以时间去积累进一步的突变使得它们具有能够增殖以及进入其它组织并最终转移的能力。
已经发现在约80％的肿瘤性疾病中，恶化细胞的无限性生长是基于被损害的端粒酶的调控功能。通过端粒酶抑制物治疗肿瘤或癌症疾病表现出可能是对这些疾病的一种有前景的疗法。随后，已在本领域进行许多努力来发展抑制端粒酶的活性成分。
因此，WO 00/74667 A2建议端粒酶抑制物(如AZT)结合能够诱导端粒破坏的活性组分(如紫衫醇)用于癌症的治疗。WO 99/65875 A1和US-A-5 863936建议异二环系统作为端粒酶抑制物用于癌症疾病的治疗。如在欧洲公开的专利EP 0 938 897 A1所描述的儿茶酚可以作为端粒酶抑制物用于癌症治疗。
在肿瘤或癌症细胞内分子或细胞水平通过其它机制也尝试在本领域进行干预。因此，本领域目前用很多烷基化物治疗肿瘤或癌症疾病，通过DNA的烷基化，最终诱导肿瘤或癌细胞DNA的直接破坏(环磷酰胺，异环磷酰胺，卡氯芥，苯丁酸氯芥等)。类似的用于肿瘤或癌症治疗的为通过抑制拓扑异构酶来干涉肿瘤或癌症细胞复制的物质(喜树碱，9-氨基喜树碱，依连洛特肯，阿霉素等)(参照，如佩奇克莱夫<Clive Page>等的《综合药理学》，莫斯比<Mosby>，1997)。
但是，除烷基活化成分外，在临床使用的还有一些拓扑抑制物；目前在不同肿瘤的临床治疗中，没有通过抑制端粒酶或结合抑制拓扑异构酶和端粒酶特性的活性成分。
本发明的目的是来发现和提供适合于治疗肿瘤或癌症疾病的活性成分和药物，但也适用于其它疾病(如病毒性疾病)。
本申请已经令人惊讶的发现取代的二环[3.3.1]壬烷-2，4，9三酮的分子式(I)。
其中·R1，R2，R4和R5，相同或不同，独立的为下述基团中之一 但其附带限制条件为如果自由基R1或R2或R4或R5为苯酰基，这些自由基中的其它则不是苯酰基。
·R3为氢原子。
·R6和R7都同为甲基或同为氢基，R8和R9都同为甲基或同为氢基。
但其附带限制条件为如R6和R7为甲基，则R8和R9为氢基；如R8和R9为甲基，则R6和R7为氢基；以及它们的生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，特别是产生用来预防性和/或治疗性(医疗性)处理肿瘤或癌症疾病以及病毒疾病的药物，特别是对于人和动物，即属于人用及兽用药物部门。
分子式(I)的化合物的生理耐受性或可接受性盐溶液可以为含有如矿物酸，羧基酸或磺基酸的盐溶液；特别优选的例子为含有盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，甲磺酸，乙磺酸，甲苯磺酸，苯磺酸，萘磺酸，乙酸，丙酸，乳酸，酒石酸，柠檬酸，反乙烯丁二酸，马来酸或安息香酸的盐溶液。但是，含有常规的碱的溶液也可以作为生理耐受性或可接受性盐溶液，例如，碱性金属盐(如钠或钾盐)，碱性土壤金属盐(如钙或镁盐)或从氨水衍生的铵盐，或有机盐如二乙胺，三乙胺，乙烷二异丙基乙胺，普鲁卡因，二苄基胺，N-甲基吗啉，二氢松香乙胺，1-麻黄胺，甲基哌啶。
本发明还包括分子式(I)的化合物的水合物。上述分子式(I)的化合物的形式，其根据发明被命名为水化物，在固体或液体状态，通过与水起水合作用形成分子化合物(水化物)。在水合物中，水分子通过分子间作用力特别是通过氢键结合。固态水合物包含以化学计量或非化学计量比例的结晶状态的水，以及与它们的结合状态不是等量相关的水分子。水合物的例子为一个半水合物，一水合物，二水合物，三水合物等。根据本发明分子式(I)的化合物的水合盐也是同等适用的。
本发明也包括分子式(I)的化合物的异构体。用于本发明的异构体的概念也被用作所有可能的异构体的综合命名。本发明的非限定性的异构体的例子特别的为立体异构体，互变异构体和结构异构体。
因此，根据取代模式，分子通式(I)的化合物可以发生在出现在异构体形式中，特别是立体异构体，例如该立体异构体与像和其镜像相关(对映异构体)，或该立体异构体与像和其镜像不相关(非对映异构体)。本发明包括分子式(I)的化合物所有的立体异构体，即包括无论是对映异构体或是非对映异构体，以及其各自的混合物。对映异构体形式能够，如非对映异构体一样，被用已知的方法分别分离成单一的成分。
分子式(I)的化合物也可以存在于互变异构体中。这已为熟练的技术人员所了解，这种化合物也包含在本发明的范围中。互变异构体的例子为，如下述的酮烯醇互变异构体 如果R5为，如苯甲酰基团，则更进一步类型的酮烯醇互变异构体是可能的。
分子式(I)的化合物还可以存在结构异构体，特别是位置异构体(取代异构体)。这已为熟练的技术人员所了解，这种化合物也包含在本发明的范围中。
本发明还包括分子式(I)的化合物的衍生物(举例来说，为醚类如为烷基醚，例如甲基醚，其能够通过互变异构体形式(I′)和形式(I″)的烷化得到)。分子式(I)的化合物的衍生物，其根据本发明为特别优选的，为互变异构体形式(I′)和形式(I″)的聚乙二醇化的衍生物，特别聚亚烷基二醇醚，优选的为聚乙二醇醚(PEG醚)。此外，化学修饰也是可能的，特别是与R1到R9取代相关(如侧面基团衍生作用)。
本发明还同等的包括分子式(I)的化合物的原药和代谢物。上述分子式(I)的化合物的形式，其根据本发明被称为原药，其可以为生物活性的或为非活性的，但能够被转化为合适的生物活性形式(如通过代谢作用，溶解作用或其它方式)。分子式(I)的化合物的产品根据本发明被称为代谢物，其特别的为在代谢作用中由代谢作用或转化作用所产生。
分子式(I)的化合物为天然产物，其能够通过例如从加勒比蜜蜂的蜂胶提取物中用色谱层析去除法得到。蜂胶为微黑黄色到淡棕褐色，树脂状物质能够在指间变得柔软，并且具有香料-香脂状气味，并能够被蜜蜂通过花的蓓蕾来收集并被用在蜂巢内作为巢壁的包被以加固蜂巢。蜂胶具有非常复杂的化学结构并且其组合物依赖于当地的植物区系。蜂胶包含超过200种化学物质，包括相对大比例部分的蜂蜡和树脂，精炼的和芬芳的油类，以及大量的其它化学物质，包括如类黄酮，咖啡酸衍生物以及，如果为加勒比蜂胶，还包括分子式(I)的化合物的组合物。
分子式(I)的化合物还能够直接从不同的藤黄种(藤黄科或产树脂藤黄科家族(如<重瓣克鲁西>Clusia grandiflora，<一种生长于夏威夷观赏性植物>Clusia rosea or<？>Clusia renggerioides))中的植物树液或树脂中分离(如从树脂中，从植物乳胶中，从叶中，从花中等)因此，A.J.Marsaioli等在《完全应用化学》第70，11卷第2116页(1998)上发表的“从化学的角度看由微生物，蜜蜂和藤黄科植物树脂和油类组成的生态系统”。C.M.A.de Oliveira等在植物化学50(1999)第1073-1079页上发表的“从三种藤黄种中得到的两种多异戊二烯化苯氧酚酮”以及A.L.M.Porto等在植物化学55(2000)第755-768页上发表的“从藤黄种中得到的多异戊二烯化苯氧酚酮”描述了通过色谱层析方法从藤黄种(藤黄科或产树脂藤黄科家族)的不同植物的树脂或组分中起始分离得到上述分子式(I)的化合物的不同克鲁西(clusianone)衍生物(树脂与重氮甲烷在二乙醚中反应并随后进行柱状层析，该层析柱装有硅胶和己烷/乙酸乙醚或己烷/乙醚作为洗提液(梯度柱)，随后通过在预先准备的硅胶/硝酸银和苯/乙酸乙醚作为洗提液上进行薄层层析)。
从藤黄科或产树脂藤黄科即聚花克鲁西<Clusia congestiflora>中起始分离克鲁西<clusianone>本身以及其结构的阐明都在L.E.McCandlish et al.“二环(3，3，1)壬烷-2，4，9-三酮两种派生物的结构。一个自然产品克鲁西、C33H42O4及三甲基临苯二酚酸，C18H20O6””in Acta Cryst.(1976)，B32，第1793-1801页中有描述。
M.H.Santos等在巴西制药科学杂志第35卷第2册1999年7月/12月第297-301页上发表的“Efeito de constituintes químicos extraidos do fruto deRheedia gardneriana(bacuparí)sobre bactérias 以及在Acta Cryst.(1998)，C54，第1990-1992页上发表的“Epiclusianon由二环(3，3，1)壬烷-2，4，9-三酮派生的一种新自然产品”中描述了从藤黄科家族中的一种植物Rheedia gardneriana(bacuparí)的花提取物中分离epiclusianone。
F.delle Monache等在植物化学第30卷第6册第2003-2005页(1991)上发表的“Prenylated Benzophenones From Clusia Sandiensis”描述了通过液相色谱层析(随后用预先准备的薄层层析进行柱状层析)从Clusia Sandiensis的植物树脂中起始分离不同的克鲁西衍生物。
与分子式(I)的化合物的制备和分离相关的先前领域的上述文献的全部公开内容作为文献包含于本发明中。
本申请已经令人惊讶的发现分子式(I)的化合物包括其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，表现出未曾预料到的药理学效果，因此适于产生用来预防性和/或治疗性(医疗性)处理各种类型的肿瘤或癌症疾病以及各种类型的病毒疾病的药物。
分子式(I)的化合物包括其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物能够相应优选的用来预防性和/或治疗性(医疗性)处理疾病，优选的为肿瘤或癌症疾病(抑制细胞生长的)以及病毒性疾病(抗病毒组分或抑制病毒生长的)。本发明还进一步关系到药物学组分或药物，特别是抑制细胞生长的抗病毒组分(抑制病毒生长的)，其包括至少一种如上所描述的分子式(I)的化合物以及/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，特别是以药物有效量与药物可接受的，本质是非毒性的载体或赋形剂结合。
本发明申请人令人惊讶的发现分子式(I)的化合物作为拓扑异构酶抑制物特别是作为拓扑异构酶I的抑制物来与其它事物相互作用。此外，它们通常表现出端粒酶抑制效果。最终，分子式(I)的化合物根据本发明可以用来诱导在肿瘤或癌症细胞中DNA的破坏。
根据本发明所使用的分子式(I)的化合物的拓扑异构酶抑制效果和端粒酶抑制效果显著高于本领域已知的化合物。例如，分子式(I)的化合物在体外实验中表现出比常规治疗试剂(如羟基喜树碱)明显更强的对拓扑异构酶I的抑制效果。此外，分子式(I)的化合物也作为在MAP激酶信号转导途径中的调控物。
分子式(I)的化合物将拓扑异构酶抑制作用和端粒酶抑制作用相结合的特性说明它们具有有价值的特性并特别适合用于预防性和/或治疗性(医疗性)处理各种肿瘤或癌症疾病(原发肿瘤，转移肿瘤，癌症的癌前或早期阶段，良性和恶性肿瘤，等)。与之对比，在本领域已知还没有活性成分或药物将拓扑异构酶抑制作用和端粒酶抑制作用同时在一个分子中。
根据本发明所使用的分子式(I)的化合物的活性成分表现出不尽具有抗肿瘤的效果，同时还具有抗转移肿瘤的效果。
根据本发明所使用的分子式(I)的化合物的活性成分令人惊讶的表现出没有预期到的良好的抑制细胞生长的效果，即使在已经表现出对以确定的化学治疗试剂有抵抗力的肿瘤中。此外，还没有观察到对分子式(I)的化合物的活性成分有抵抗力。而且，根据本发明所使用的分子式(I)的化合物的活性成分具有一定优势，即其对已经建立的药物或化学治疗试剂没有交叉抵抗作用。
被提及的疾病作为分子式(I)的化合物能被用于治疗的肿瘤或癌症疾病的非限定性例子为下述肠内癌症(结肠癌)，乳腺癌症(乳癌)，卵巢癌，子宫癌，肺癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，肾癌，膀胱癌，前列腺癌，睾丸癌，骨癌，皮肤癌，卡波西肉瘤，脑瘤，肌肉瘤，成神经细胞瘤(即成视网膜细胞瘤)，淋巴瘤和白血病。
根据本发明，优选的使用下列具有分子式(Ia)，(Ib)，(Ic)和(Id)的化合物，包括它们的生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物。
根据本发明特别优选的是使用下述分子式为(Ic)的化合物，包括其的生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物。
分子式为(Ic)的化合物为一对相互平衡共存的烯醇互变异构体中的一个。
根据本发明对于分子式为(Ic)的化合物特别优选的具有下列构型。
本申请还发现在某些情况下，使用或给予分子式(I)的化合物以及/或它们的生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，同时结合至少一种化学治疗试剂，特别是蛋白酶抑制物，优选的为MAP激酶抑制物是有利的。将分子式(I)的化合物以及/或它们的生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物结合蛋白酶抑制物，优选的为MAP激酶抑制物能够在癌症或肿瘤疾病的治疗中取得良好的结果。这种结合具有惊人的协同效果。
因此本发明还关系到一种药物组合，特别是抑制细胞生长的组合，其包括(A)至少一个如上面所描述的分子式(I)的化合物，以及/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物；以及(B)至少一个化学治疗试剂，特别是蛋白酶抑制物，优选的为MAP激酶抑制物。
本发明的由组分(A)和组分(B)结合的组合能够被同时给予或可顺序给予。药物组合可以包括包含组分(A)和组分(B)作为其功能单元，特别是或以一种混合物或一种配制或一种混合的形式，或者是两者分离的形式(空间上)。
蛋白激酶抑制物，正如其名称所示，抑制效果与蛋白激酶的活性相关，即该酶能够将γ-磷酸基团从ATP转移到酪氨酸或丝氨酸或苏氨酸侧链上。适合于治疗特别是肿瘤和癌症疾病的本发明的药物组合物和本发明的组合治疗为各种类型的蛋白激酶抑制物，如本领域已知的蛋白激酶抑制物(如特定低分子量的杂环抑制物如星形胞菌素，2′-氨基-3′-甲氧氟烷，1，4-双氨-2，3-[2-氨基苯硫]丁二烯，SB 203580，自SmithKline Beecham公司等)。在这些例子中可以观察到协同效应。
特别优选的是使用MAP蛋白激酶抑制物作为本发明的药物组合物以及作为本发明的肿瘤和癌症疾病的组合治疗。MAP蛋白激酶抑制物，如其名称所示，抑制效果与MAP激酶活性相关(MAP＝有丝分裂原活化蛋白)，即在有丝分裂期间具有活性的酶，其将末端的磷酸残基从三磷酸核苷转移到适当的底物上。通过这种方式，MAP激酶抑制物阻止有丝分裂以及癌症或肿瘤细胞的细胞分裂。适合于治疗特别是肿瘤和癌症疾病的本发明的药物组合物和本发明的组合治疗为各种类型的MAP激酶抑制物，即本领域已知的所有MAP蛋白激酶抑制物。根据本发明可以被使用的MAP蛋白激酶抑制物的例子在下述出版物中被作为例子涉及，其全部内容作为文献的方式被包含于此处WO99/32111 A，WO 99/64400 A，WO 98/52941 A，WO 98/52937 A，WO 97/44467 A，WO 98/27098 A，WO 98/52558 A，WO 98/52940 A，WO 99/32110 A，WO99/32463 A，WO 99/58502 A，WO 99/58523 A和WO 99/00357 A。
本申请还令人惊讶的发现上述分子式(I)的化合物还表现出在MAP蛋白激酶信号转导通路中的调控活性，即作为在MAP蛋白激酶信号转导通路中的调控物。
分子式(I)的化合物还适用于治疗病毒性疾病并作为抗病毒组合物(抑制病毒生长)的活性成分(如治疗疱疹病毒疾病或HIV)。如上所描述的，本发明还进一步关系到分子式(I)的化合物，以及生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物用于预防性和/或治疗性(医疗性)处理各种类型的病毒疾病。
本发明还关系到一种用于预防和/或治疗人或动物身体疾病的方法，特别是各种类型的肿瘤和癌症疾病或病毒性疾病，用分子式(I)的化合物包括其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，在治疗有效剂量下，同时在适合时结合另一种活性成分，特别是化学治疗试剂(即蛋白激酶抑制物，如MAP激酶抑制物)。
根据本发明所使用的活性组分或活性组分组合可以依赖于被治疗疾病的性质，被全身性给药或部分给予，特别是局部给予。
根据本发明所使用的适合于给药的活性组分或活性组分组合为所有常规的给药形式。可能的给药途径的例子为口部、舌部、舌下、颊部、肠内或肠胃外(即避开肠部管道，即静脉内，动脉内，心脏内，皮内，皮下，经皮，腹膜内或肌肉内)，并且口部和静脉给药是特别适合；口部给药是更为优选的。表面给药也是可以的(如治疗黑素瘤)。
根据本发明为进行应用，活性成分或活性成分的组合可以用已知的方式转化成常规的剂型，例如各种类型的无包膜药品，包膜药品，药丸，颗粒，气溶剂，糖浆，乳剂，悬浮液，溶液，药膏，油膏和凝胶，特别使用无活性的，本质上非毒性的制药上可适用的载体或溶剂。将活性成分或活性成分的组合引入作为进入脂质体“包装物”也是可以的，即其被包埋或密封到脂质体中，该脂质体也可选择性的被进一步修饰(如用PEG进行酯化)。在这种连接中，根据本发明所使用的活性成分或活性成分的组合可以在各种情况都以治疗有效浓度存在，特别是在完全混合物中重量比从为0.0001到99％的浓度范围内，优选的0.01到95％，即为达到指示的或需要的剂量范围的有效量。然而，适当的偏离上述量也是必须的，特别是作为身体重量或给药类型的一种功能，作为个体对药物反应的一种功能，作为剂型的类型以及给药发生的时间或间隔的一种功能。因此，在一些情况下低于上述最小剂量的为充分的，然而在另一些情况下所述上部限制一定被超过。当多量被给予时，将这些分成多个单一剂量并在一段特定的时间内，如在一天内分别给予是可取的。
剂型可以被延伸，如通过扩展活性成分或活性成分组合与溶剂(举例来说，油类如蓖麻油)和或/载体，当适合使用乳化剂和/或分散剂时，使用这些是可行的，举例来说在适当的有机溶剂作为辅助溶剂处，水可以作为稀释剂。
根据给药的模式，为达到治疗效果，以身体重量的0.0001到500mg/kg特别是0.0001到100mg/kg，有效的为0.01到50mg/kg的剂量给予根据本发明所使用的活性成分或活性成分组合被证明是有利的。然而，适当的偏离上述量也是必须的，特别是作为身体重量或给药类型的一种功能，作为个体对药物反应的一种功能，作为剂型的类型以及给药发生的时间或间隔的一种功能。因此，在一些情况下低于上述最小剂量的为充分的，然而在另一些情况下所述上部限制一定被超过。当多量被给予时，将这些分成多个单一剂量或作为持续给药(举例来说，如持续输注)并在一段特定的时间内，如在一天内分别给予是可取的。在慢性病中的应用(举例来说，如药品形式)是同样可行的。
本发明的进一步精练，修饰和变化能够在熟练的技术人员在阅读本说明书后在不偏离本发明范围内进行确定并直接实施。
本发明可以通过下列实施例来进行说明，但不意味着对本发明的限制。
实施例从加勒比蜜蜂的蜂胶中得到的1-苯甲酰-8，8-2甲基-2-羟基-3，5，7-三羟甲基氨基甲烷-(3甲基-2-丁烯)二环[3，3，1]non-2-双键-4，9-二酮(Ic’))(1-Benzoyl-8，8-dimethyl-2-hydroxy-3，5，7-tris-(3-methyl-2-butenyl)bicyclo[3.3.1]non-2-ene-4，9-dione(Ic’)<non-2-ene-4，9-dione(Ic’)) 分子式(Ic’)的化合物的生理学活性如下所描述。
分子式(Ic’)的化合物存在于分子式(Ic)和(Ic″)结构的互变异构平衡之中。
但是，为了简化，下面只称之为分子式(Ic’)的化合物。
蜂胶溶液的制备从加勒比蜜蜂的蜂巢中收集的蜂胶溶于乙醇中，并通过过滤去除不可溶的蜂蜡。干燥得到一定体积的粉末以一定的浓度重新悬浮在乙醇中。在避光室温的条件下保存溶液。
蜂胶溶液的半制备性HPLC分离用Waters GmbH(Eschborn)(Waters the Separator Module Alliance 2690，Waters PDA 996 Detektor，Waters Millennium Chromatography Manager)提供的RP-HPLC系统进行分离。在40℃用梯度系统用Macherey-Nagel(Nucleosil100-7 C18，250×21mm)提供的分离柱进行分离(表1)。液相由0.01M的甲酸铵溶液组成(pH＝7.00)。
表1梯度系统
在这种方式得到的每8毫升部分(2分钟)被干燥并重新悬浮在乙醇中并在避光室温的条件下保存。
每个分离部分的细胞毒性在媒介中用稀释可比较体积进行检测并按下面描述的SRB实验来研究。其中所使用的目标细胞为人源的肠癌细胞系。(HCT8WT)。
细胞毒性部分的纯化在SRB实验中具有细胞毒性活性的部分要进行进一步纯化。为此目的，梯度稀释系统被用于待纯化部分的极化。在SRB实验中对用制备性RP-HPLC得到的片段进行更新和检测，可以分离均质的物质(Ic’)。物质(Ic’)的纯度通过UV分光光度数据来显示(

图1b)。一个包含修饰的C18相(250mm×4.6mm)水对称柱被选择作为分析分离柱。结果如图1a所示。
图1a显示了物质(Ic’)在254nm，流速＝1毫升/分钟，T＝40℃，梯度系统作为指示的分析性RP-HPLC(纯度检测)中的代表性色谱图。上面的线对应甲醇的浓度(％)，中间的线对应水相的浓度(％，甲酸铵0.01M)。乙腈的浓度(％)维持在稳定的5％(更下面的线)。
图1b显示图1a所示的PDA分析数据。所得到的物质(Ic’)为均质的。在这些洗脱条件下的UV光谱展示了两个最大值(254钠米和308钠米)。
结构阐明分子式(Ic’)的化合物的最初分离和特征描述发生可以不存在任何衍生作用(举例来说，如和重氮甲烷)。蜂胶(在加勒比海收集)的乙醇萃取物可以按照如上所描述的通过RP-HPLC来进行纯化，通过这种方式可以第一次提供分子式(Ic’)的化合物，其为非衍生的形式以进行进一步的NMR光谱研究，特别是在充分高的纯度下(＞98％，LC-MS；用LC-PDA进行的UV光谱研究；MS)。
为进一步确认结构，分子式(Ic’)的化合物被通过和重氮甲烷反应来转化成相应的甲基醚。O-甲基化化合物以40/60的比例被分离(RP-HPLC)。
NMR研究的结果(1H-NMR，13C-NMR，DEPT135，DEPT90，HMQC，HMBC，H，H-COSY90(gs)，1D-NOE差异光谱)如下表所示·DEPT代表通过极化转移的无失真增强。
·COSY代表相关光谱。通过这种常用方法，1H，1H-COSY，也随着其发明者的名字被称为Jeener实验，其代表了在NMR的历史中的第一个2D脉冲序列。
·HMQC代表异核多量子一致。
·HMBC代表异核多键相关。
·NOE代表核Overhauser效应。
图1c，1d和1e为分子式(Ic’)的化合物的1H-NMR光谱(测量频率500MHz，溶剂CD3OD)。
图1f描述了分子式(Ic’)的化合物的13C-NMR光谱(测量频率125MHz，溶剂CD3OD)。
图1g描述了分子式(Ic’)的化合物的13C-DEPT光谱(测量频率125MHz，溶剂CD3OD)。CHs和CH3s点向上，CH2s点向下。
图1h，1i，1j和1k为分子式(Ic’)的化合物的H，H-COSY光谱(测量频率500MHz，溶剂CD3OD)。
图1l描述了分子式(Ic’)的化合物的HMBC光谱(测量频率125MHz，溶剂CD3OD)。
表1a化合物(Ic’)的NMR数据
H，H-COSYH6a-H7，H6e-H7，H7-H29，H7-H29’(w)＝弱，(br)＝宽；
相应的，分子式(Ic’)或(Ic″)或(Ic)的非衍生化合物存在于酮/烯醇平衡中，其由系信号的化学转化和2，4碳原子的13C信号的宽度来确证。

表1b对于甲基醚的NMR数据(II)
H，H-COSYH6a-H7，H7-H29 (w)＝弱

表1c对于甲基醚的NMR数据(III)
H，H-COSYH6a-H7，H6e-H7，H7-H29 (w)＝弱
绝对构型在如上所详细描述的NMR数据的基础上，对分子式(Ic’)或(Ic″)或(Ic)的化合物指定为下列绝对构型是可能的 细胞培养六个特征明确的人源肿瘤细胞系(天然细胞系以及那些被转化为抗性的亚克隆)以及两个非肿瘤细胞系被用于进一步的研究(表2)。
表2细胞系，细胞系的组织学特征及其来源
SRB实验细胞系对于物质的敏感度(Ic’)可以通过被称为磺基若丹明(SRB)的实验来测定。这是在NCI(国家癌症研究所，美国)已经建立的有力并且高度可重复的标准方法(Skehan et al.1990)。
实验的结果显示在表3中。抑制50％细胞生长的物质(Ic’)的浓度(IC50，由半对数剂量对效果的曲线图所决定)被指出。显示在表3中的结果为至少三次独立实验的平均值以及它们的标准偏差。对于所指示的细胞生长抑制活性没有交叉抗性。物质(Ic’)对于非肿瘤细胞系(纤维原细胞系3T3和MCR5)的细胞毒性被证明是非常少的。
表3在不同细胞系中物质(Ic’)的IC50浓度测定
拓扑异构酶I抑制作用的研究物质对拓扑异构酶I的作用效果被通过称之为TopoI解旋实验来研究。此实验是基于螺旋型的pBR322质粒DNA二聚物在拓扑异构酶I的作用下发生的ATP非依赖性解旋。质粒DNA的两种不同的拓扑类型，螺旋型以及未卷绕的松散型被通过琼脂糖凝胶分离。为此目的从肿瘤细胞系的细胞核提取物中得到拓扑异构酶I。
得到细胞核提取物通过Danks等修改的Sullivan的方法可以得到细胞核提取物。
物质(Ic’)对拓扑异构酶I的抑制作用如图3所示(柱1对照)，需要160ng含有拓扑异构酶I的细胞核提取物来将高度缠绕的pBR322质粒DNA二聚物(阴性对照)转变为松散的拓扑型(阳性对照)。物质(Ic’)在100ug/ml的浓度下能够100％的抑制拓扑异构酶I活性。相应的需要20倍该浓度来抑制相应细胞系50％的肿瘤生长(IC50，图2)。和羟基喜树碱的体外抑制活性的数据对照表明，已经在临床确定应用的羟基喜树碱需要1000倍的IC50。图3表明物质(Ic’)对拓扑异构酶I的抑制作用。
细胞周期分析到目前为止，对于物质(Ic’)作用于细胞生长的效果已被证实为改变细胞周期。使用Tsugita M.等的一种适合的方法来进行流式细胞术研究分析。
指数生长的HCT8 WT肠癌细胞被用已确定IC50浓度的物质(Ic’)来处理24小时，然后细胞和BrdU共同孵育。用甲醇固定的细胞经清洁剂(TritonX-100/HCl)处理以使DNA链变性。与荧光标记的抗体(抗-BrdU单克隆抗体，FITC-标记)共同孵育后，加入第二个荧光染色剂(碘化丙啶)。
用Coulter流式细胞仪(Coulter EPICS XL)来测定DNA含量(碘化丙啶荧光)和BrdU的总量(FITC荧光)。实例的结果如图4a和4b所示。
图4a和4b表明HCT8 WT细胞的DNA对BrdU和PI的吸收，未处理(对照，图4a)的和经物质(Ic’)处理的(IC50，24小时，图4b)。图示的结果为n＝3次独立实验的代表。
显然用物质物质(Ic’)处理会导致合成期的抑制。这一点从DNA含量的图看的很清楚(图4a和4b，BrdU吸收)。
DNA降解的分析研究物质(Ic’)对DNA的降解是通过其作用于人的细胞支气管癌(H460WT)和结肠癌(HT29 WT)作为实例来进行的。在用物质(Ic’)处理细胞不同的时间后，用凝胶电泳分析分离的DNA。
DNA双链断裂的测定是用14C标记的DNA来完成的。为此，[14C]d-胸腺嘧叮标记的细胞用不同浓度的物质(Ic’)来处理。DNA用Chia Chiao等的适合的方法进行分离。
在用GeneQuant分光光度计测定分离的DNA的总量和纯度后，用琼脂糖凝胶分离可比较量的DNA。通过凝胶电泳分离的DNA随后用溴化乙啶来染色。
在透射仪上(302钠米)，用提取的方法将在电场中没有迁移的完整的DNA和在凝胶中迁移的片段DNA分开。分离的凝胶和DNA片段在盐酸存在下在80℃使之液化。在加入闪烁剂后，可以用液体闪烁仪(TPI-CARB 2100RT)来测定测定放射活性。标准的放射活性用每分钟裂变次数(cpm)来指示。
图5表明在与支气管癌细胞(H480 WT)孵育6个小时后，物质(Ic’)诱导的双链断裂。图5表明在[14C]d-胸腺嘧叮标记的H460WT细胞在用物质(Ic’)处理6个小时后所诱导产生的DNA双链断裂。结果代表了n＝3次独立实验的平均值和它们的标准偏差。
用超过10倍的已确定的IC50浓度处理肿瘤细胞超过6个小时诱导产生大量的双链的断裂，其对于肿瘤细胞来说明显造成不能全部修复，即使在IC50浓度时也如此，从而诱导了细胞的死亡。
图6表明在肿瘤细胞的DNA中诱导双链断裂的进一步例子，在这个例子中为结肠肿瘤(HT29 WT)。关于支气管癌细胞系，有显著的大量双链断裂，其不能被肿瘤细胞的修复机制所修正，最终作为诱导肿瘤细胞凋亡，即程序性细胞死亡的作用因素。
物质(Ic’)对于人端粒酶的抑制活性的测定物质(Ic’)对于人端粒酶的作用通过基于N.W.Kim等的方法，被称为端粒重复扩增实验(TRAP)ELISA来进行测定。
该方法是基于聚合酶链式反应(PCR)。这使得第一步，一定量的(GGTTAG)序列通过聚合酶的活性被结合到生物素标记的寡核苷酸的3’末端(TS＝端粒酶底物)。第二步中，这种方式延伸的产物被用TS和RP(R＝反向)引物通过PCR技术扩增。在这种方式中，以6个碱基为一“阶梯”的方式增加从而产生产物(初始的尺寸等于50个核苷)。在扩增的过程中，DNP标记的dCTP被包含到PCR产物中。用三文治ELISA方法来对合成的端粒酶产物进行测定和定量是端粒酶酶活性的标准。
端粒酶产物携带生物素标记的TS引物并结合到预先包被有抗生素的微滴度板的表面上。在扩增过程中包含一个结合有POD的抗DIG抗体结合到DNP标记的核苷酸上。在底物TMB加入后，端粒酶的活性通过荧光光度计经酶POD介导的颜色反应的发生变得可以观察。在这种情况下，测定的吸收值直接和端粒酶的活性成比例相关。
物质(Ic’)对人端粒酶活性的作用效果为确保物质(Ic’)对端粒酶的作用效果，物质(Ic’)对DNA聚合酶的作用效果必须被排除。在用TSR8作为内部对照的预实验中，不同浓度水平的物质(Ic’)的作用效果被排除。
TSR8模板的扩增仅依赖于DNA聚合酶。这个酶的每个抑制物可以通过底物来检测。
图7表明用TSR8模板进行的预实验的结果。实验进行三次。图7表明即使用物质(Ic’)的最大浓度，50ug/ml，在此实验中不能导致对Taq聚合酶明显的抑制作用。
研究物质(Ic’)对端粒酶抑制作用的实验如图8所示。所述的浓度范围在10到50ug/ml之间。在50ug/ml的浓度下观察到对人端粒酶的完全抑制。图8表明TRAP实验的结果用物质(Ic’)在结肠癌细胞(HCT8 WT)上取得的对人端粒酶剂量依赖性抑制作用。结果代表三次独立实验的平均值和标准偏差。
ERK1/2的磷酸化作用(MAP蛋白激酶途径)某些信号转导途径的磷酸化在细胞生长和基因表达的调控中扮演关键性的作用。蛋白ERK1/2(MAP蛋白激酶)属于MAP蛋白激酶信号转导途径。
用物质(Ic’)处理人结肠癌细胞(HCT8 WT)导致这种蛋白的磷酸化，其通过Western blot分析来检测(图9)。图9表明ERK1/2蛋白的Western blot分析结果；含有对照的在更下面的线中。
用物质(Ic’)处理导致蛋白ERK1/2的剂量依赖性磷酸化。即使在相应于IC50的剂量，可以展现物质(Ic’)的磷酸化作用。作为此过程的结果-目前文献中解释为活化作用-肿瘤细胞处于细胞周期停止，这通过细胞周期分析来表明(见上)。
为检查这些发现，即通过物质(Ic’)对ERK1/2的活化所得到的结果在多大程度上可被加入ERK1/2抑制物来拮抗，可以用物质(Ic’)和特异性ERK1/2抑制物(MAP蛋白激酶抑制物)共同融合实验。在此例中，肿瘤细胞，举例来说为结肠癌细胞(HCT8 WT)，其在每个例子中与活性成分在不同的剂量中共同融合24小时(图10)。图10代表用物质(Ic’)和特异性ERK1/2抑制物(MAP蛋白激酶抑制物)共同融合实验的细胞毒性。HCT8 WT细胞被共同融合。显示的点代表两种活性成分之间的相应的比率(代表性IC50的浓度的百分比)。
然而，通过这种方式进行的实验导致在任何剂量比例中没有废除标准的细胞毒性。相反的，两个活性成分在共同融合上显著的协同效应是明显的。
所有的剂量组合低于二等分因此其在明确的协同效应范围内。将物质(Ic’)的IC50浓度的30％和特异性ERK1/2抑制物的IC50浓度的30％相结合导致对从结肠癌(HCT8 WT)分离的肿瘤细胞生长的抑制作用。
权利要求
1.分子式(I)的取代的二环[3.3.1]壬烷-2，4，9三酮的应用 其中·R1，R2，R4和R5，相同或不同，独立的为下述基团中之一 但其附带限制条件为如果自由基R1或R2或R4或R5为苯酰基，这些自由基中的其它则不是苯酰基，·R3为氢原子，·R6和R7都同为甲基或同为氢基，R8和R9都同为甲基或同为氢基，但其附带限制条件为如R6和R7为甲基，则R8和R9为氢基；如R8和R9为甲基，则R6和R7为氢基；以及它们的生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，特别是产生用来预防性和/或治疗性(医疗性)处理肿瘤或癌症疾病以及病毒疾病的药物。
2.根据权利要求1中的应用，其特征为分子式(I)的组合物选自下列化合物中的基团
3.根据权利要求1或2中的应用，其特征为分子式(I)的组合物为下列分子式(Ic)的化合物
4.根据权利要求3中的所要求的应用，其特征为分子式(Ic)的化合物具有下列特征
5.根据权利要求1到4中的任何一个所要求的应用是为预防性和/或治疗性处理肿瘤和/或癌症疾病，特别是在原发性肿瘤和转移灶，和/或初癌状态(癌症的早期阶段)。
6.根据权利要求1到5中的任何一个所要求的应用是为预防性和/或治疗性处理良性肿瘤和恶性肿瘤。
7.根据权利要求1到6中的任何一个所要求的应用是为预防性和/或治疗性处理肠内癌症(结肠癌)，乳腺癌症(乳癌)，卵巢癌，子宫癌，肺癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，肾癌，膀胱癌，前列腺癌，睾丸癌，骨癌，皮肤癌，卡波西肉瘤，脑瘤，肌肉瘤，成神经细胞瘤(即成视网膜细胞瘤)，淋巴瘤和白血病。
8.根据权利要求1至6中的任何一个所要求的应用，其特征为分子式(I)的化合物被全身性给药和/或局部给药。
9.根据权利要求1至8中的任何一个所要求的应用，其特征为分子式(I)的化合物抑制和/或停止肿瘤和/或癌细胞的细胞生长和细胞分裂。
10.根据权利要求1至9中的任何一个所要求的应用，其特征为分子式(I)的化合物诱导肿瘤和/或癌细胞的DNA破坏。
11.如上所描述的分子式(I)的化合物，以及其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物作为拓扑异构酶抑制物和端粒酶抑制物的应用。
12.根据权利要求1到11中的任何一个所要求的应用，其特征为如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物与至少一种化学治疗试剂结合使用，特别是蛋白激酶抑制物，优选的为MAP蛋白激酶抑制物。
13.根据权利要求12中所要求的应用，其特征为如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，以及另外至少一种化学治疗试剂或同时或依次的被使用或给药。
14.一种制药组合物或药物，特别是抑制细胞生长或抑制病毒生长的组合物，包含如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，以及一种药剂上可接受的，本质为无毒的载体或赋形剂。
15.根据权利要求14中所要求的制药组合物或药物，包含至少一种处于有效治疗剂量的如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物。
16.根据权利要求14或15中所要求的制药组合物或药物可以全身性和/或局部使用。
17.一种制药组合物，特别是抑制细胞生长的组合，其包括(A)至少一种如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物；以及(B)至少一种化学治疗试剂，特别是蛋白激酶抑制物，有效的为MAP蛋白激酶抑制物。
18.根据权利要求17中所要求的药物组合物，特征为组分(A)和组分(B)存在或者作为功能单元，特别是以一种混合物或一种配制或一种混合的形式，或者是两者分离的形式(空间上)。
19.根据权利要求17或18中所要求的药物组合物，其中组分(A)和组分(B)能够被或同时性或依次性的使用或者给药。
20.根据权利要求17到19中的任何一个所要求的药物组合物，包含分别为治疗有效量的组分(A)和组分(B)。
21.根据权利要求17到20中的任何一个所要求的药物组合物可以全身性和/或局部使用。
22.根据如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物用来预防性和/或治疗性处理疾病。
23.根据如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物作为活性药物成分和/或药物的活性药物成分。
24.根据如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物用于预防性和/或治疗性处理肿瘤和/或癌症疾病，特别是在原发性肿瘤和转移灶，和/或初癌状态(癌症的早期阶段)，特别是肠内癌症(结肠癌)，乳腺癌症(乳癌)，卵巢癌，子宫癌，肺癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，肾癌，膀胱癌，前列腺癌，睾丸癌，骨癌，皮肤癌，卡波西肉瘤，脑瘤，肌肉瘤，成神经细胞瘤(即成视网膜细胞瘤)，淋巴瘤和白血病。
25.根据如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，特别是权利要求22到24中的任何一个所要求的，用来抑制拓扑异构酶和/或端粒酶。
26.根据如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，特别是权利要求22或23中的任何一个所要求的，用来治疗性处理病毒性疾病。
27.根据如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，特别是权利要求22到26中的任何一个所要求的，可以全身性和/或局部使用。
28.根据如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，作为MAP蛋白激酶信号转导途径中的调控物。
29.根据如上所定义的分子式(I)的化合物，和/或其生理耐受性盐，水化物，异构体，特别是立体异构体，互变异构体和结构异构体，衍生物，原药和代谢物，用来产生预防性和/或治疗性病毒疾病的药物。
全文摘要
本发明是涉及取代的二环[3.3.1]壬烷－2，4，9三酮的使用，特别是克鲁西(clusianone)或克鲁西的衍生物作为活性药物成分或药剂中的活性成分，特别是用于产生用来预防性和/或治疗性(医疗性)处理肿瘤或癌症疾病以及病毒疾病的药物。上述组合物可以用于细胞抑制剂的和抗病毒剂(病毒抑制剂)。特别是作为拓扑异构酶抑制物和/或端粒酶抑制物以及作为MAP激酶信号转导通路的调控物，从而可以在细胞水平上对肿瘤或癌细胞增殖和病毒的复制进行干预。
文档编号A61K38/00GK1615127SQ02827411
公开日2005年5月11日 申请日期2002年11月20日 优先权日2001年11月21日
发明者西伯 西格弗雷德, 阿克塞尔 希尔格 拉尔夫, 戴兹卡巴罗 大卫 申请人:西伯 西格弗雷德