专利名称：芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到芸香苷的用途，尤其涉及作为酪氨酸酶抑制剂的应用。
背景技术：
酪氨酸酶(EC I. 14. 18. I, Tyrosinase)是一种含铜的金属酶,广泛分布于微生物、动植物及人体中。酪氨酸酶是皮肤色素合成中具有多重催化功能的重要的酶，该酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，在黑色素合成过程中起关键作用，是黑色素合成过程的限速酶。酪氨酸酶属于第三类铜蛋白家族(I. Yoon J, Fujii S, Solomon EI. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Apr 21 ；106(16) :6585-6590 ;2· Li Y, Wang Y, Jiang H, Deng J. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Oct 6 ； 106 (40) : 17002-17006.)，在活性部位 2 个铜离子分别与3个组氨酸相连，并且这2个铜离子与不同的催化反应直接相关，如单酚羟基化为二酹(甲酹酶活性)和二酹氧化为二醌(邻苯二酹氧化酶活性)(3. Decker, H. and Tuczek,
F.Trends Biochem. Sci. 2000 ；25 :392-397.)。酪氨酸酶的活性与黑色素合成量密切相关，在人体内的活性增高会导致雀斑、黄褐斑等黑色素过度沉积疾病的发生(4. Olivares C，Solano F.Pigment Cell Melanoma Res. 2009 Dec ；22 (6) :750-760 ；5.Jimbow K, Park JS, Kato F, Hirosaki K, Toyofuku K, Hua C, Yamashita T. Pigment Cell Res. 2000Aug ； 13(4) :222-229.)。食物(果蔬、虾蟹等)中的酪氨酸酶会引起食物加工及贮藏过程中的褐变，导致食物变质(6.Kim YJ, Uyama H. Cell Mol Life Sci. 2005Aug ；62(15) 1707-1723 ；7. Rescigno A, Sollai F, Pisu B, Rinaldi A, Sanjust E. J Enzyme Inhib Med Chem. 2002Aug ； 17 (4) :207-218.)。酪氨酸酶在昆虫体内也普遍存在，在昆虫创伤愈合 (8. KanostMR, Jiang H, Yu XQ. Tmmunol Rev. 2004Apr ；198 :97-105 ；9. Lai SC, Chen CC, Hou RF. J Med Entomol. 2002Mar ；39(2) :266-274.)和表皮形成(10. Guerrero,A. and Rosell,
G.Curr· Med. Chem. 2005 ; 12 :461-469.)中起重要作用。由于酪氨酸酶在医药、化妆品和农业上的潜在应用前景，其活性调控研究成为研究的焦点。迄今为止，已研制出多种类型的酪氨酸酶抑制剂，可作为开发美白剂及生物杀虫剂的候选。目前，已有不少来源于化学合成和天然产物的酪氨酸酶抑制剂作为药品、化妆品、 食品添加剂及生物杀虫剂。已普遍应用的酪氨酸酶抑制剂有氢醌、曲酸及其衍生物、壬二酸、熊果苷、黄酮类化合物、维生素C及其衍生物、绿茶提取物、甘草提取物等。但现有的酪氨酸酶抑制剂在抑制效果、稳定性或安全性等多方面存在着不同程度的缺陷，因此继续寻找抑制效果好、安全性高、性质稳定的酪氨酸酶抑制剂仍然具有十分重要的意义。芸香苷，也称3-芸香糖苷-槲皮素，是一种来源于蔬菜和水果的天然物质 (11. Z. Xie, Y. Zhao, P. Chen, P. Jing, J. Yue, and L. L. Yu. J Agric Food Chem. 2011 ； 59 :3042-3049 ；12. R. Slimestad and M. Verheul.J Agric Food Chem.2011 ；59 3180-3185 ；13. S. Tong, J. Yan, G. Chen, and J. Lou. J Chromatogr Sci. 2009 ；47 :341-344 ； 14. J. Kalinova,J. Triska,and N. Vrchotova. J Agric Food Chem. 2006 ；54 :5330-5335.)。在结构上，芸香苷包括一个黄酮槲皮素和通过糖苷键连接的二糖芸香糖。芸香苷被用于许多复合维生素的生产，并可作为中草药的有效成分(15. I. Erlund, T. Kosonen, G. Alfthan, J. Maenpaa, K. Perttunen, J. Kenraali, J. Parantainen, and A. Aro. Eur J Clin Pharmacol. 2000 ；56 :545-553 ；16. ff. Dimpfel. Phytomedicine. 2009 ； 16 :287-294.)。 芸香苷作为生物药物的应用主要是由于其具有抗氧化作用，可用于治疗糖尿病(17. H. D. Je, C. Y. Shin, S. Y. Park, S. H. Yim, C. Kum, I. H. Huh, J. H. Kim, and U. D. Sohn. Arch Pharm Res. 2002 ；25 184-190 ； 18.A.A. Fernandes, E. L. Novelli, K. Okoshi, M. P. Okoshi,
B.P. Di Muzio, J. F Guimaraes, and A. Fernandes Junior. Biomed Pharmacother. 2010 ； 64 :214-219.)，还具有抗炎症(19. K. Nones, Y. E. Dommel s, S. Martel I, C. Butts, ff.
C.McNabb, Z. A. Park, S. Zhu, D. Hedderley, M. P. Barnett, and N. C. Roy. Br J Nutr. 2009 ； 101 169-181.)，抗肿瘤(20· E. Bourogaa, J. Bertrand, M. Despeaux, R. Jarraya, N. Fabre, L. Payrastre, C. Demur, J. J. Fournie, M. Damak, A. E. Feki, and C. Leuk Res. 2011 ；35 1093-1101 ；21. J. P. Lin, J. S. Yang, J. J. Lin, K. C. Lai，H. F Lu, C. Y. Ma, R, Sai-Chuen Wu, K. C. Wu, F. S. Chueh, ff. Gibson Wood, and J. G. Chung. Environ Toxicol Jan. 2011 ； 20. doi 10. 1002/tox. 20662. [Epub ahead of print])和抗血管生成的作用(22. H. Luo, B. H. Jiang, S. Μ. King, and Y. C. Chen. Nutr Cancer. 2008 ；60 :800-809.)。

发明内容
本发明的目的在于提供芸香苷的新用途，即作为酪氨酸酶抑制剂的新应用。本发明所用的芸香苷,其英文名称为Rutin hydrate,分子式为C27H3tlO16 · 3H20,分子量610. 52，为淡黄色或草黄色粉末，溶于二甲基亚砜和吡啶、甲酰和碱液中，常温密封避光贮存，其化学结构式如下所示芸香苷为商品化物质，可以从Sigma等试剂公司直接购买到。酪氨酸酶的英文名称为Tyrosinase，分子量为128X IO3道尔顿，为冻干粉末，购于Sigma公司。以L-3,4- 二轻基苯丙氨酸(L-D0PA)作为底物，米用Lineweaver-Burk 双倒数作图法测得购买的酪氨酸酶的米氏常数Km = 0. 71±0. 04mM,最大反应速度Vmax = 0. 17 ±0. OOSmr1Iiiin'为了更好的理解本发明的实质，下面详细说明芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂使用的机理。I.酪氨酸酶活性测定方法可通过测定酪氨酸酶的邻苯二酚氧化酶活性来计算酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶可催化底物L-DOPA形成多巴醌，而多巴醌在475nm波长处有最大吸收峰。因此通过测定酶催化反应体系的A475随时间的增长直线，该直线的斜率即为酪氨酸酶的活力，即以L-DOPA为底物通过分光光度法在波长475nm处测定多巴醌的产生速度来计算酪氨酸酶活力的大小。 具体测定方法为=ImLL-DOPA底物体系中加入15 μ L酪氨酸酶溶液，迅速混匀，通过岛津公司UV-1800紫外可见分光光度计检测475nm处每分钟吸光值变化来指示反应速度v值，从而表征酶活性的大小。所有动力学反应和检测的缓冲液均采用50mM Tris-HCl，pH8. 8。2.芸香苷对酪氨酸酶抑制作用的测定配制50mM(毫摩尔/升)芸香苷，用缓冲液逐级稀释成不同浓度。将不同浓度的芸香苷30 μ L与等体积的酪氨酸酶液混合，25°C保温3hr后测定酶活力。测定时酪氨酸酶终浓度为2. O μ g/mL，底物L-DOPA浓度为2mM，底物中含相应浓度抑制剂芸香苷。芸香苷浓度与酪氨酸酶活力的关系如图I所示。由图I可知酪氨酸酶活力被芸香苷以浓度依赖的方式显著地抑制，酪氨酸酶活力下降一半时芸香苷的浓度(IC5tl)为6.8±0.3mM(n = 3);当芸香苷浓度高于12mM时，酪氨酸酶被完全抑制。酪氨酸酶抑制剂是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成。在芸香苷存在下进行酪氨酸酶的活性测定，测得的多巴醌V值在475nm波长处每分钟吸光值的变化即v值显著减小，说明酪氨酸酶被芸香苷抑制，这种抑制作用可导致黑色素生成的抑制从而起到美白等作用。由图I可知，当芸香苷浓度高于12mM时酪氨酸酶活性被完全抑制，该浓度可作为酪氨酸酶抑制剂使用时的最低浓度。3.芸香苷对酪氨酸酶的抑制为可逆的抑制作用为了判断芸香苷介导的抑制作用是否为可逆反应，我们在反应体系中，加入不同浓度的芸香苷，当底物L-DOPA浓度不变时，改变酪氨酸酶的加入量，测定酪氨酸酶催化底物氧化的活力随酶量的关系。结果如图2所示v值代表在475nm波长处每分钟吸光值的变化，[E]代表酪氨酸酶的浓度，图2中1-5号芸香苷的浓度分别为0，2. 5,5,7. 5和10mM， 体系中L-DOPA的终浓度为2mM。图中直线均经过坐标轴原点，直线的斜率随着加入芸香苷浓度的增大而下降，证实芸香苷对酪氨酸酶的抑制作用是一个可逆过程。4.芸香苷和Cu2+的紫外/可见光扫描由于芸香苷为多羟基的化合物，可预期其具有较强的铜离子螯合能力。通过紫外扫描光谱发现芸香苷溶液中加入铜离子引起明显的红移现象，即峰值处波长变大，如图3 所示。这说明芸香苷可螯合铜离子，证实芸香苷可在酪氨酸酶的活性位点直接螯合铜离子。 图3所示曲线中芸香苷的测试浓度为O. 05mM, Cu2+的测试浓度为O. 2mM。5.芸香苷对酪氨酸酶的竞争性抑制分析为了评估芸香苷对酪氨酸酶抑制的类型，用Lineweaver-Burk双倒数法作图。竞争性抑制动力学分析的Lineweaver-Burk方程如公式I和公式2所示
权利要求
1.芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂的应用。
全文摘要
本发明涉及到芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂的应用。芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂的作用机理为芸香苷与酪氨酸酶的结合引起了竞争性抑制，但未引起三级结构的明显变化，芸香苷结合残基位于活性中心的凹陷区域，这些残基影响芸香苷在初始阶段的对接，一个位于活性中心与3个组氨酸结合的铜离子在平衡状态直接与芸香苷螯合。芸香苷作为酪氨酸酶抑制剂的进一步研究可开发用于皮肤黑色素生成紊乱的新型美白剂，抑制效果好，并且细胞毒性非常微小。
文档编号A61K8/60GK102579273SQ201210017958
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者尹尚军, 斯越秀, 朴龙斗, 钱国英 申请人:浙江万里学院