专利名称：：蚌肉提取物在制备治疗和预防糖尿病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蚌肉提取物的用途，具体地说，涉及蚌肉提取物以及含蚌肉提取物的药物组合物在制备治疗或预防糖尿病的药物中的应用。
背景技术：
：糖尿病是一种常见的内分泌疾病，主要分为i型糖尿病(胰岛素依赖型)和n型糖尿病(非胰岛素依赖型)，由胰岛素绝对或相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性降低所致，以糖代谢紊乱为主，继发脂肪、水、电解质代谢障碍，导致血糖含量过高，从而诱发神经以及血管方面的疾病。据世界卫生组织统计，2007年全球糖尿病患者近2.5亿，并且不断增长；我国是糖尿病发病的"重灾区"，患者人数占全球患者总数的1/5。糖尿病因其严重的并发症而危害巨大，已经成为导致人类死亡的第四大疾病。现有的治疗糖尿病方法一般采用口服降糖药来达到降血糖、减轻和延缓并发症发生的目的，常见的西药有磺脲类(如优降糖)、双胍类(如降糖灵)等，这类药虽然近期降糖效果好，对治疗糖尿病有一定作用，但长期服用对人体有副作用，表现为对血象、肝功、肾功等的损害。服用此类西药对糖尿病人也会造成一定得心理压力。随着我国传统医药逐渐被人们认识和利用，从天然动、植物中寻找高效、低毒的药物越来越受到重视。蛤(蛘)类的药用在中医临床中具有悠久的历史。我国第一部系统的药学专著《神农本草经》中记载"文蛤，主恶疮，蚀五痔"，"魁蛤，其味咸而性寒，攻效软坚化痰，清热润燥，降气而消积"；李时珍在《本草纲目》中对蚌蛤类药物的应用作了更进一步的阐述，共记载蚌蛤类药29种附方118个，书中记载"牡蛎性味咸，平微寒，无毒，其肉甘，温无毒，煮食治虚损，调中，化痰软化，清热除湿，消疝积块，瘿疾结核"，"蚌肉性味甘，咸冷，无毒，止渴除热，解酒毒，去眼赤"，"蚌粉性味咸，寒，无毒，解热燥湿，明目，止痛痒"；张仲景在《全匮要略》中记载，"消渴小便不利淋病脉证并治第十三指出，渴欲饮水不止者，文蛤散主之"；呕吐下痢脉证治第十七也记载"吐后，渴欲得水者而贪饮者，文蛤汤主之"。因此，蛤(蚌)类软体动物具有极大的药物开发价值。随着对蛤(蚌)类软体动物研究的深入，人们已发现蛤(蚌)类软体动物的提取物具有抗癌、镇痛等功效，例如，CN1067579C公开了一种蚌质素作为有效成分之一的抗肿瘤的药物组合物；本申请人的专利CN1281218C公开了一种蚌肉提取物的制备方法，其具有抗癌和镇痛作用；CN1141083C披露了河蚌脂质体的制备及其在抗肿瘤中的应用；CN1079238C公开了蚌类提取物具有镇痛和抑制肿瘤的作用；CN101406502A披露了含有河蚌类提取物的去痛霜(膏)。目前还没有蛤(蚌)类提取物用于治疗和预防
发明内容本发明的目的是提供蚌肉提取物的新用途，即在制备治疗或预防糖尿病的药物中的应用。本发明的另一个目的是提供含蚌肉提取物的药物组合物在制备治疗或预防糖尿病的药物中的应用。根据本发明的一个方面，本发明的蚌肉提取物可来自三角帆蚌(^;W印^o^/wg/O或褶纹冠蚌(CWWaW"p//o^)，可用本领域技术人员已知的方法来提取制备。具体地，本发明的蚌肉提取物可通过捞取新鲜蚌类，除去腮和排泄器官等内脏组织，将有效蚌肉组织切块，加入防腐剂进行防腐处理，然后加入酸进行酸化，调节pH值至2.83.9，并置于容器中静置一段时间；然后加碱调节pH为6.57.5，加水搅拌过滤，滤液冻干后粉碎获得。优选地，本发明的蚌肉提取物可按照本申请人的专利CN1281218C中公开的提取方法制备得到。具体方法包括下述步骤1)取新鲜蚌类，去除鳃和排泄器官，取蚌肉组织；2)将蛘肉组织切块，加入防腐剂进行防腐处理；3)在经防腐处理后的蚌肉组织中加入酸，调节PH值至2.83.9进行酸化；4)将酸化后的蚌肉组织置于恒温下一段时间直至蚌肉组织自溶；5)收集自溶后的液体，获得蚌肉提取物。其中，蚌类为三角帆蚌或褶纹冠蚌；防腐剂选自苯甲酸钠、尼泊金乙酯和氯仿，优选苯甲酸钠；在酸化处理中，用于调节溶液PH值的酸可以是盐酸、硫酸、乙酸等，优选使用36%盐酸；酸化调节PH值至2.83.9，优选为PH3.03.5;所述自溶的温度为2040。C，优选为3035。C，时间为30100天，优选为5090天。本发明的蚌肉提取物还可进一步进行以下分离纯化步骤6)将自溶后的蚌肉提取物液体以5,000转/分离心30分钟，取上清液；7)调节pH为6.57.5，以10,000道尔顿超滤膜过滤，获得滤液，将滤液进行无菌处理，冻干后可获得蚌肉提取物原料药。上述方法将蚌肉组织在常温酶解自溶，充分保留了蚌肉中含有的各种天然酶的活性，同时通过蚌肉组织中含有的各种酶类的作用，酶解生物大分子，获得小分子的物质。此外，釆用了酸水提取，未使用任何有机溶剂，因此制备的蚌肉提取物具有极好的水溶性，适于各种剂型的药物制备。经化学成分检测显示，上述方法制备的蚌肉提取物中含有氨基酸和蛋白质、糖类和甾体，不含酚类和脂类，琼脂糖凝胶电泳显示其中无核酸存在。具体地，该蛘肉提取物含有天门冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)等氨基酸。经动物药理试验证实，蛘肉提取物对链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病模型具有明显的防治作用，可降低血糖，且对大鼠无其它不良作用。本发明还提供含有蚌肉提取物的药物组合物在制备治疗或预防糖尿病的药物中的应用。临床观察结果显示，含有蚌肉提取物的药物组合物可显著降低血糖，明显改善和缓解糖尿病患者的多饮多食、夜尿频尿、疲倦乏力等症状，且较长时间服用后未发现低血糖的现象，也没有出现肝损伤、肾损伤等副作用。因此，蚌肉提取物可用于治疗或预防糖尿病，它也可以与其它中药材配伍组成药物组合物，还可加入药学上可接受的载体或赋形剂或其他可选的成分，制成用于治疗或预防糖尿病的各种剂型。具体实施例方式通过以下实施例可以更好地理解本发明。实施例1蚌肉提取物与含蚌肉提取物的药物组合物的制备1、材料及来源褶纹冠蚌，新鲜淡水褶纹冠蚌；新鲜女贞子a/gMWn/m/wc/c/wmAY).，性凉、味甘、苦，具有补肝肾阴，乌须明目的功效，主要成分为齐墩果酸、甘露醇、葡萄糖、棕榈酸、硬脂酸、油酸、甘油酸；天花粉7Hc/zasfl"/to)，取自葫卢禾斗植物栝楼7Hc/zcwwf/^hWW"Ma;dm.的根，性甘、微苦，微寒，具有清热生津，清肺润燥，解毒消痈的功效，主要成分为天花粉蛋白、植物凝血素，氨基酸。2、蚌肉提取物LXOl的制备捕捞新鲜褶纹冠蚌放入暂养池，静养数日待其体内污物排尽，取出蚌壳内组织，除去鳃和排泄器官，检验合格后，将有效部位组织清洗干净放入绞肉机切成小块，取切块的蚌肉放入容器内，称重后，加入蚌肉重量0.3%的苯甲酸钠，搅拌均匀。防腐处理后的蚌肉组织，用36。/。的盐酸溶液调节pH至3.5后，置于封闭容器中静置50天，然后加氢氧化钠溶液调节pH至7，加入约2倍重量的无离子水搅拌过滤。将滤液放入冷冻干燥机中冻干，将冻干后物料粉碎至IOO目，检验包装，得到蚌肉提取物LXOl。3、蚌肉提取物LX02的制备(按照本申请人专利CN1281218C中公开的提取方法制备得到的蚌肉提取物)捕捞取新鲜褶纹冠蚌放入暂养池，静养数日待其体内污物排尽，取出蚌壳内组织，除去鳃和排泄器官，检验合格后，将有效部位组织清洗干净放入绞肉机切成小块，取切块的蚌肉放入容器内，称重后，加入蚌肉重量0.3%的苯甲酸钠，搅拌均匀。防腐处理后的蚌肉组织，用36Q/。的盐酸溶液调节pH至3.5后，置于封闭容器中放置70天，收集所得液体以5000转/分钟离心30min，取上清液，用氢氧化钠溶液调节上清液pH至7，以1000道尔顿超滤膜过滤，获得滤液，将滤液进行无菌处理，冻干，粉碎至IOO目，检验包装，得到蚌肉提取物LX02。4、含蚌肉提取物的药物组合物的制备4.1女贞子提取物的制备取冬至后新鲜的女贞子，清洗，置于粉碎机中粉碎。粉碎后的女贞子中加入约2倍重量的无离子水搅拌均匀静置，将上清液用压滤机压滤，滤液浓缩后喷雾干燥，粉碎至100目，检验包装，得到女贞子提取物。4.2天花粉提取物的制备取隔年天花粉用清水洗净后泡透切块，切块用磨浆机磨碎再浸泡，浸泡后的溶液用压滤机压滤得到滤液，滤液浓缩后喷雾干燥，干燥物用粉碎机粉碎至100目，检验包装，得到天花粉提取物。4.3药物组合物的制备按照重量配比7:2:1的比例分别取蚌肉提取物LX02、与女贞子提取物和天花粉提取物混合，搅拌均匀，得到本发明的药物组合物ZH02。实施例2蚌肉提取物和药物组合物指标和给药量的确定按照实施例1的方法制备的蚌肉提取物为微黄色粉末，每100mg中多肽含量为》15mg。按照实施例1的方法制备的女贞子提取物为棕色粉末，每100mg中齐墩果酸含量为^10mg。按照实施例1的方法制备的天花粉提取物为黄棕色粉末，其中含氮量>15%。按照实验动物与人用药量转换因子计算方法计算，以等效剂量的1、2、4倍量为大鼠给药蚌肉提取物的低剂量、中剂量和高剂量。成人拟临床服用蚌肉提取物的用法用量成人每天用量为800mg，若成人以70kg体重计算，则成人日最大用药量为11.43mg/kg，参考陈奇主编的《中药药理研究方法学》中的剂量换算法。换算得到大鼠每日给药蚌肉提取物的用量等效量为(800/70)X(0.06/0.11)X(70/0.02)1/3=95mg/kg，中剂量为l卯mg/kg，高剂量为380mg/kg。实施例3蚌肉提取物对链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病模型的防治作用1、实验材料1.1实验动物Wister大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供的封闭群雄性(许可证号SCXK2006-0015)，体重200250g。采用普通颗粒型大鼠词料(含蛋白0.23、脂肪0.047、钠盐0.0024，百分数)喂养，引用自来水，动物房温度控制在25r左右，光照周期12小时以模拟正常昼夜生理规律。1.2实验药物优降糖沈阳第一制药厂生产，产品批号860706;蚌肉提取物LX01;蛘肉提取物LX02;药物组合物ZH02。1.3主要试剂和实验仪器链脲佐菌素(Strepozotocin):lg/瓶，购自Sigma公司；保灵曼血糖仪ReflouxR,BeochringerMannheim,Germany;血糖试纸购自Johnson公司，USA。2、实验方法2.1动物模型的建立雄性Wister大鼠，200g250g，禁食12小时后，一次性左下腹腔内注射由枸橼酸钠溶液(0.1mol/L，pH=4.5，高压灭菌)配置的STZ55mg/Kg诱导糖尿病模型，正常对照组给予等量的溶剂。72小时后尾静脉采血，血糖浓度H6.7mmol/L确立为模型成功。整个实验期间，不限饮食，不给予胰岛素等其它降糖药物。2.2实验分组将实验大鼠随即分为7组(A)正常对照组(Con):n=7，正常大鼠，每天灌胃同体积的生理盐水；(B)糖尿病模型组(DM):n=8，糖尿病大鼠，每天灌胃同体积的生理盐水；(C)优降糖治疗组(Ba):n=8，糖尿病大鼠，每天灌胃优降糖80mg/Kg;(D)LX01治疗组I;n=7，糖尿病大鼠，每天灌胃LX01200mg/Kg;(E)LXOl治疗组II;n=6，糖尿病大鼠，每天灌胃LX01800mg/Kg;(F)LX02治疗组I;n=7，糖尿病大鼠，每天灌胃LX02200mg/Kg;(G)LX02治疗组II;n=6，糖尿病大鼠，每天灌胃LX02800mg/Kg;(H)ZH02治疗组I;n=7，糖尿病大鼠，每天灌胃含LX02200mg/Kg;(I)ZH02治疗组II;n=6，糖尿病大鼠，每天灌胃含LX02800mg/Kg。从实验证实模型建立成功当天起开始灌胃，每天给药一次，连续14天，分别于给药第3、7、14天禁食12小时，取血测血糖值。每只大鼠每次灌胃体积按0.5ml/100g体重计算，大鼠每周称体重一次，根据体重变化调整给药量，共观察12周。2.3实验数据和结果实验期间，观察大鼠精神状态、形体形态、皮毛颜色、光泽、肢体活动、反应、体重等情况，并定期测量大鼠血糖水平。血糖测定方法将大鼠固定，左手拇指和食指轻轻捏住大鼠尾巴，使尾尖微微上翘，用酒精棉球在尾尖部擦拭消毒，然后用无菌眼科手术剪迅速剪破尾尖皮肤，待尾静脉血慢慢渗出，轻轻将渗出的血液滴到血糖试纸上，把血糖试纸插入血糖仪，20秒后记录血糖数值。在实验开始和结束时各记录一次，结果见表l。表l:蚌肉提取物对糖尿病模型大鼠血糖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与正常组(A组)比较*P<0.01;与模型组(B组)比较AP<0.01。如表1所示的各组数据中可以看出，蚌肉提取物具有降低糖尿病大鼠的血糖的作用，服用剂量较大，但未观察到对大鼠精神状态、活动、反应等引起的任何不良反应，其可达到与治疗糖尿病的药物"优降糖"相当的效果；当蚌肉提取物的给药剂量增大时，其降血糖的作用也增强；由蚌肉提取物、女贞子和天花粉制成的药物组合物，其降血糖效果比单纯的蚌肉提取物的降血糖效果更加明显，且给药剂量越大，降血糖作用也越强。因此，蚌肉提取物具有明显的降血糖作用，可用于制备治疗或预防糖尿病的药物。实施例4含蚌肉提取物的药物组合物用于治疗糖尿病的临床观察1、临床数据临床用药根据实施例1所述的方法制备得到的药物组合物ZH02，检验，分装，制成每粒0.3g的胶囊(下称ZH02胶囊)。研究对象选取经空腹血糖测定而确诊为糖尿病的患者12例，年龄为53-68岁的中老年人，其中男性ll例，女性l例；I型(胰岛素依赖型)l例，II型(非胰岛素依赖型)11例，血糖值为10.218mmol/L，平均值14.8mmol/L，病程0.510年不等。2、治疗方法全部病例服用ZH02胶囊，每日三次，每次2粒，饭后服用，30天为一疗程，视病情严重程度连续服用l-6个疗程不等，血糖正常稳定后隔日服用，并发症消失后隔日服药。临床试验期间，患者停止服用其它降血糖药物，跟踪记录其体力、精神状态及10症状，并定期检测尿糖及测量血糖浓度。3、治疗结果经过初步观察，12例有11例服药后见效，最快的一周后多尿、乏力症状明显减轻，一个月后全部消失，一般经两到三个月血糖值由1618mmol/L下降至5.8mmol/L以下(平均值)，尿糖由(+++)(++++)转为(-)性。其中3例经跟踪半年坚持服用，而无"反跳"性血糖升高现象，患者病情稳定，体力、精神良好，日常生活及工作正常。1例无效者为68岁女性有严重并发症的晚期胰岛素依赖型糖尿病患者。从初步临床观察结果可以看出，该ZH02胶囊并不是一个单纯的降糖药物，而是作用缓和的调节人体糖代谢障碍的药物，其降糖作用不像胰岛素那样剧烈，但是效果持久，且当血糖降至正常生理水平后，继续服药，血糖始终维持在正常范围而不再继续下降，未观察到因服药量过大而出现低血糖的现象，也未发生肝损伤、肾损伤等副作用。4、典型病例例1、病人是56岁的10年糖尿病史的男性患者。空腹血糖16.0mmd/L，曾长期服用"达美康"、D860等药物控制血糖，效果不明显。三年前并发"脑梗塞"经CT诊断为"皮层下动脉硬化性脑病"，2006年5月25日住院开始服用ZH02胶囊治疗，每日三次，每次2粒。服药一周后，夜尿次数由服前56次减到每晚1次，乏力明显好转，二周后尿糖由(+++)下降至(+)(-)。服药一个月后血糖已经由16.0mmol/L降至7.2mmol/L。住院治疗两个月后病情控制出院，带药回家巩固治疗。例2、病人是64岁的男性患者。2006年6月10日以多饮、多食、多尿消瘦六个多月主诉入院。六个月前无明显诱因而出现上诉症状，伴全身无力、头昏、口干、欲饮，每日需3暖水瓶开水，每日进l公斤主食，体重五个月内减轻15公斤，小便频，大便秘结，舌红五苔，脉弦硬数，为阴虚之象，血糖15.6mmol/L，尿糖(++++)，尿酮体(±)，心肺(-)，临床诊断为糖尿病。入院后开始服用ZH02胶囊，每日三次，每次2粒。服药第七天尿糖降低为(++)，服药十二天后尿糖为(-)性。病人自觉症状减轻，食纳减少。服药半个月后血糖已降至正常水平为5.85mmol/L。治疗一个月后，体力恢复精神振作住院。例3、病人是52岁的男性患者。2006年6月24日患者以多饮、多尿、消瘦一年余值主诉住院。一年前无明显原因多食，每日进主食l公斤左右仍有饥饿感，每日饮2水平水，尿频、口干、日渐消瘦，曾在其他医院确诊为糖尿病，服用"降糖灵"、"消渴丸"等住院治疗效果不佳而转院治疗，转入本院时空腹血糖10.2mmol/L，尿糖(+++)。入院后开始服用ZH02胶囊，每日三次，每次2粒。一周后乏力、口渴症状减轻，十天后尿糖转为(++)，治疗半个月后空腹血糖为9.1mmol/L，尿糖(-)，治疗二十六天后空腹血糖降为7.8mmol/L，后又坚持服药二十天，血糖降至6.2mmol/L，带药出院回家巩固治疗。例4、病人是46岁患糖尿病5年的男性患者。2006年9月检查空腹血糖14.8mmol/L，尿糖(+++)，10月24日开始服用ZH02胶囊，每日三次，每次2粒。12月9日血糖降至7.1mmol/L，尿糖为(++)，坚持服药到2007年6月4日空腹血糖降至6.6mmol/L，尿糖(_)。由上述实施例可以看出，蚌肉提取物能够显著降低血糖，调节人体糖代谢障碍的作用缓和而持久，可用于治疗或预防糖尿病。另外，蚌肉提取物还可以与其它中药材配伍，组成药物组合物，以开发具有降糖作用更强、效果更好的糖尿病药物，其它中药材并不限于本发明所公开的女贞子和天花粉，可以是具有类似功能的任意中药材。实施例中对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的权利要求所定义的范围。权利要求1、蚌肉提取物在制备治疗或预防糖尿病的药物中的应用。2、根据权利要求l所述的应用，其特征在于，所述蚌肉提取物根据以下方法制备得到[1)取新鲜蚌类，去除鳃和排泄器官，取蚌肉组织；[2)将蚌肉组织切块，加入防腐剂进行防腐处理；[3)在经防腐处理后的蚌肉组织中加入酸，调节PH值至2.83.9进行酸化；[4)将酸化后的蚌肉组织置于恒温下一段时间直至蚌肉组织自溶；[5)收集自溶后的液体，获得蚌肉提取物。3、根据权利要求2所述的应用，其中所述蚌肉提取物还可进一步包括以下分离纯化步骤[6)将自溶后的蚌肉提取物液体以5,000转/分离心30分钟，取上清液；[7)调节pH为6.57.5，以10,000道尔顿超滤膜过滤，获得滤液，将滤液进行无菌处理，冻干后获得蚌肉提取物。4、含权利要求1所述的蚌肉提取物的药物组合物在制备治疗或预防糖尿病的药物中的应用。5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物组合物是由下述重量配比的原料制成蚌肉提取物70女贞子提取物20天花粉提取物IO其中所述蚌肉提取物中多肽含量至少为15%重量；所述女贞子提取物中齐墩果酸含量至少为10%重量，所述天花粉提取物中含氮量至少为15%重量。6、根据权利要求5所述的应用，其中所述蚌肉提取物是根据以下步骤制备1)取新鲜褶纹冠蚌，除去鳃和排泄器官；2)将蚌肉组织切块，加入蚌肉重量0.3%的苯甲酸钠进行防腐处理；3)在经防腐处理后的蚌肉组织中加入36。/。的盐酸溶液调节pH至3.5进行酸化；4)将酸化后的蚌肉组织置于封闭容器中放置5090天，收集所得液体;5)将收集的液体以5000转/分钟离心30min，取上清液；6)调节上清液pH至7,以IOOO道尔顿超滤膜过滤，获得滤液，将滤液进行无菌处理，冻干后获得蚌肉提取物；所述女贞子提取物是根据以下步骤制备l)将新鲜女贞子清洗，粉碎，加入2倍重量的无离子水搅拌均匀后静置；2)静置后，取上清液压滤，得到滤液；3)将滤液浓縮，干燥，粉碎，得到女贞子提取物；所述天花粉提取物是根据以下步骤制备1)将隔年天花粉清洗，泡透，切块；2)将切块磨碎，再浸泡，浸泡后的溶液压滤，得到滤液；3)将滤液浓縮，干燥，粉碎，得到天花粉提取物。全文摘要本发明涉及蚌肉提取物在制备治疗或预防糖尿病的药物中的应用。实验证实，蚌肉提取物可以明显降低血糖，改善和缓解糖尿病患者的多饮多食、夜尿频尿、疲倦乏力等症状，且无低血糖、肝损伤、肾损伤等副作用，可用于治疗或预防糖尿病。本发明还涉及含蚌肉提取物的药物组合物在制备治疗或预防糖尿病的药物中的应用。文档编号A61K35/56GK101559081SQ20091010694公开日2009年10月21日申请日期2009年5月6日优先权日2009年5月6日发明者李文新,王在民申请人:李文新;王在民