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EHEC感染会引起出血性结肠炎并伴随有腹泻和便血，有时还会导致并发症如溶血性尿毒症综合征(HUS)和中枢神经系统紊乱。由EHEC产生的维罗(Vero)细胞毒素与这些疾病密切相关，因此治疗EHEC感染的关键在于开发出一种中和维罗(Vero)细胞毒素的方法。<br> 迄今已提出的治疗EHEC传染病的方法如下所述，有(1)使用抗菌素治疗(Japanese Journal of Bacteriology，52(1)，2016，2017和2018，1997)使用抗菌素存在抗菌素抗性菌株增加的问题。据说在1996年主要发生于日本堺(Sakai)市的EHEC感染大流行中有95．9％的患者用抗菌素进行了治疗。据报道在那时最广泛使用的抗菌素是磷霉素(FOM)(使用包含84％抗菌素的FOM)。根据后来的研究，FOM不能很好地抑制Vero细胞毒素的产生。相反，FOM杀死了EHEC细胞但却导致结合在细菌细胞上的Vero细胞毒素释放。因此给患者服用抗菌素FOM是成问题的。(2)使用商业上可获得的人免疫球蛋白制剂免疫球蛋白制剂已用于治疗EHEC感染的患者，但它们的效果还不确定。Komiya等人(Japanese Journal of Bacteriology，52(1)，3124，1997)从5个生产厂家随机地抽取了用于静脉注射的13组丙种球蛋白制剂作为样品，并测定了抗Vero细胞的细胞毒作用的中和抗体效价水平和小鼠致死毒性以观察这些制剂是否有中和EHEC VT1或VT2的抗体。<br> 另外，Takeda检验了由进口血液制成的丙种球蛋白制剂样品中和EHEC VT1或VT2的能力。他报告说，这些制剂可中和VT1，但不能中和VT2，这对症状有不利影响(Newsflash of Jiji Press，2月21日，1997)。<br> 由此可见，使用人免疫球蛋白制剂很可能对EHEC感染的治疗作用很小。(3)使用牛初乳免疫球蛋白Pirro，F．等人(Veterinary Microbiology 43，131-141，1995)在德国汇集了225份牛初乳随机样品和40份血清随机样品，检验每份初乳和血清中是否有针对EHEC VT1或VT2的抗体。结果发现有69．3％的初乳有针对VT1的抗毒素抗体，14．7％有针对VT1和VT2的抗体。在血清中可以观察到相同的趋势。毒素中和抗体的同型是IgG1。由这些数据可以断定在德国按常规饲养的牛有EHEC，因此食用被污染牛的肉和奶的人比预期的危险更高。在加拿大报道了相似的流行病学数据。<br> Lissner，R．等人(Infection24，No．5，44-49，1996)在德国采集了至少100头常规饲养的牛在分娩后10小时内的初乳。通过常规脱脂并去除酪蛋白得到乳清，将其喷雾干燥，从约100kg初乳制得2-5kg乳清粉末(LactobinTM)。利用Pirro等人的方法(1995)，在体外检测所得的乳清粉末以确定其中所含的抗体(IgG1)是否特异性中和EHEC VT1和VT2。他们发现该乳清粉末含有中和VT1和VT2的高抗体效价。Lissner，R．等人指出这一结果提醒了通过给EHEC感染的患者口服汇集乳清来减轻腹泻和HUS病情的可能性。但是，干燥乳清能否用于治疗目的还未得到实验确证。也就是说，当给EHEC感染模型动物口服这种干燥乳清时，并不清楚其是否能预防由EHEC感染引起的死亡，是否能阻止EHEC在肠中的增生，或者是否能抑制肠中的VT1和VT2。<br> 另外，由于分娩后初乳中的抗体效价一般随着产生时间迅速下降，所以上述方法对于制备抗体是无效的，因此采集的时间是有限的，仅能回收小量的预期抗体。而且仅仅是具有EHEC的牛才能产生含有针对VT1和VT2的抗体的初乳，但正如Pirro，F．(1995)指出的那样，这增加了使用可能已被EHEC污染的初乳作为原料来回收抗体时感染的危险。因此，利用上述方法所得到的乳清粉末不适合用于人的治疗目的。<br> 如上所述，还未提出治疗肠出血性大肠杆菌O157感染的有效方法，这是目前的主要问题。<br> 抗菌素疗法使得维罗(Vero)细胞毒素释放和抗茵素抗性的菌株增加。人免疫球蛋白制剂对Vero细胞毒素VT2没有中和活性。EHEC污染的牛的初乳具有抗EHEC抗体，但是感染EHEC的危险也将增加。<br> 本发明的目的是提供治疗和预防肠出血性大肠杆菌O157感染的有效和安全的药物组合物。<br> 此前本发明人研制了一种利用鸡蛋来大量并廉价地制备针对特定抗原的特异性抗体的方法，并应用该方法来制备针对引起哺乳的猪和腓肠的大肠杆菌病的肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的特异性抗体。他发现所得抗体可有效地治疗和预防大肠杆菌病(日本专利申请公开No．7-53669)。具体地说，用菌毛抗原(987p，K88和K99抗原)对母鸡进行免疫接种，该抗原是ETEC的粘附因子，将已转移到蛋黄中的抗体回收。由ETEC感染导致腹泻的机理是细菌定居于肠中并在此生长，由细菌产生的肠毒素(LT，ST)使电解平衡破坏。上述方法的目的是通过利用对抗粘附因子的特异性抗体来预防和治疗大肠杆菌病，粘附因子对该细菌在肠中的定居来说是必需的。<br> 另一方面，导致出血性结肠炎、HUS或中枢神经紊乱的因素是EHEC感染中的Vero细胞毒素。与ETEC不同，在EHEC中没有发现粘附因子。因此，通过研制能使由EHEC感染而在肠中产生的Vero细胞毒素在与靶细胞结合前被抑制的口服被动免疫接种疗法而预防和紧急治疗EHEC感染是有可能的。<br> 不过，为了评定所得抗体的作用必需要有EHEC感染模型。由于常规小鼠的肠中有正常菌丛，因此小鼠不能仅通过口头接种EHEC培养物而感染EHEC。当小鼠预先用硫酸链霉素和丝裂霉素C进行处理，它们就可通过口服接种而感染EHEC并显示出临床症状如嗜睡，失重，四肢麻痹，和因感染死亡。不过，用这些物质进行预处理不适于检测药物的效能，因为其可能影响生物保护系统。<br> 本发明人已发现，给无菌小鼠口服接种EHEC培养物可不需预处理就可感染上EHEC并产生致死状况，并已开发出适于评定用于预防或治疗EHEC感染的药物的效能的EHEC感染模型。本发明人基于此发现，利用这样的感染模型完成了本发明，所说的发现是接种了灭活EHEC的母鸡产的蛋含有足够能中和维罗(Vero)细胞毒素的抗体，在预防和治疗EHEC感染中是有效的。<br> 本发明提供了一种用于预防或治疗由肠出血性大肠杆菌引起的传染病的药物组合物，其含有作为活性成分的特异性抗体，该抗体是由以肠出血性大肠杆菌细胞或由EHEC产生的Vero细胞毒素的类毒素作为抗原进行了免疫接种的母鸡产的蛋制得的。本发明还提供了一种含有作为添加剂的上述抗体的食品。在优选的实施方案中，本发明提供了用于预防或治疗肠出血性大肠杆菌O157的药物组合物，其含有作为活性成分的特异性抗体，该抗体是由以肠出血性大肠杆菌O157的灭活细胞作为抗原进行了免疫接种的母鸡产的蛋制得的。该特异性抗体能够凝集特定的大肠杆菌O157细胞并具有中和由该细菌产生的维罗(Vero)毒素的活性。<br> 从接种了EHEC细胞的母鸡产的蛋得到的上述抗体可与至少一种选自乳酸细菌和双歧细菌的细菌一起用于预防或治疗由EHEC，特别是EHEC O157引起的传染病。<br> 为了生产针对EHEC的特异性抗体，给母鸡接种抗原。用于给母鸡接种的抗原包括通过培养EHEC如EHEC O157 T001，T002，T003，T004和T005并向该培养物中加入福尔马林而得到的灭活细胞。另一方面，将多粘菌素B加入细胞悬液(1×1010-1×1011CFU／ml)(PBS，pH7．2)中使细胞溶解得到类毒素抗原，从该细胞中提取Vero细胞毒素并向Vero毒素中加入福尔马林以制备可用的类毒素。<br> 利用合适的途径如皮下或肌内注射给母鸡接种抗原可以使母鸡对抗原产生免疫。优选合适的佐剂与抗原一起给药以增强免疫作用。用于这一目的的佐剂是弗氏完全(不完全)佐剂(Difco)，霍乱毒素BB(Sigma)，Titer Max(CytRx Corp．)等。<br> 抗原的剂量根据抗原和佐剂的类型以及给药途径而定，以这样的给药方式可以使母鸡产生免疫，而母鸡中的抗原不会产生过量毒性。<br> 通常，在接种(初次免疫接种)后的几周内，母鸡变得对抗原敏感，即对抗原免疫了。针对抗原的特异性抗体在母鸡体内生成，母鸡产的蛋，特别是蛋黄中含有特异性抗体。<br> 在对母鸡初次接种了抗原后，为了维持母鸡体内的高抗体效价可以给其服用一种或多种合适剂量浓度的加强剂量。<br> 母鸡和鸡蛋中针对抗原的特异性抗体的存在和效价水平可以用免疫学分析领域中的技术人员熟知的任何方法进行确认，如ELISA或利用凝集反应的方法。<br> 抗维罗毒性抗体的效价可以用Pirro等人(1995)的方法，利用Vero细胞的悬液进行测定。当确认了免疫后的母鸡产的蛋中存在足够效价的特异性抗体之后，收集这些鸡蛋并分离出预期抗体。<br> 本发明的特异性抗体可以用整个鸡蛋或蛋黄制备。大多数抗体包含在蛋黄中，通常将蛋黄分离出来用于制备抗体，在某些情况下也可使用整个鸡蛋。<br> 整个鸡蛋或蛋黄可以不经分离即使用。另一方面，也可将整个鸡蛋或蛋黄进行分离或精制，例如，可以用合适的方法进行脱脂如利用邻苯二甲酸羟丙甲基纤维素、聚乙二醇等将蛋黄中的脂质成分除去。如果需要，还可以任何已知的方法进行进一步纯化，包括已知的蛋白质纯化方法如用硫酸铵或硫酸钠进行盐析，或用冷乙醇沉淀等。<br> 未经分离或经过分离或纯化的整个鸡蛋或蛋黄可直接使用或进行加工。在优选的实施方案中，将整个鸡蛋或蛋黄搅拌或匀化成乳液并用常规技术如喷雾干燥或冷冻干燥法干燥成粉末。因此，根据不同目的可以使用不同形式的抗体。<br> 即使将EHEC整个细胞用作抗原，所得对EHEC有特异性的抗体也具有足够中和Vero细胞毒素的活性。而且，利用EHEC感染模型动物进行的实验也证明了这一点，即给模型动物口服本发明的特异性抗体使得肠中的EHEC细胞的数量减少了，且抑制了Vero毒素的产生，因此降低了死亡率。<br> 当将由鸡蛋得到的针对EHEC的特异性抗体与至少一种选自乳酸细菌和双歧细菌的细菌一起口服给药时可以得到对EHEC感染的更好的保护作用。对于乳酸细菌的给药来说，Ogawa等人(JapaneseJournal of Bacteriology 52(1)，ppl57，2006(1997))和Koga等人(Japanese Journal of Bacteriology52(1)，pp301，3126(1997))报道说，乳酸细菌在某种程度上抑制了EHEC的生长并具有中和Vero细胞毒素的活性，并提出这是由于乳酸细菌产生了有机酸如乙酸或乳酸所致。不过，当乳酸细菌与本发明的特异性抗体一起使用时是不可能出现显著功效的。<br> 因此，本发明的特异性抗体可用于预防和治疗EHEC感染，并可用作预防EHEC感染的食品的添加剂，可单独使用或与乳酸细菌和／或双歧细菌结合使用。<br> 用于本发明的乳酸细菌的实例包括嗜酸乳杆菌，乳乳杆菌，保加利亚乳杆菌，干酪乳杆菌，粪肠球菌，尿肠球菌等。用于本发明的双歧细菌的实例包括短双歧杆菌，双歧双歧杆菌，嗜热双歧杆菌，长双歧杆菌，婴儿双歧杆菌，青春双歧杆菌等。<br> 当本发明的特异性抗体用于预防或治疗传染病时，该抗体可以含有抗体和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的形式常规给药。在药物组合物的制备中，可以加入解酸药(如碳酸氢钠，碳酸镁，沉淀碳酸钙，或偏硅铝酸镁)。该药物组合物可以用任何已知方法进行制备。<br> 用于预防或治疗传染病的药物组合物可通过口服途径给药。本发明抗体的剂量可根据用法、目的和症状轻重而定。当抗体用于预防EHEC感染时，优选每天服用0．25-20．0mg／kg纯抗体。在治疗由EHEC引起的传染病时，优选服用1．25-125mg／kg纯抗体。当选用乳酸细菌和双歧细菌与抗体一起给药时，它们优选以每天107-1010可存活细胞的量给药。<br> 当本发明的抗体用作预防EHEC感染的食品的添加剂时，该抗体以纯抗体计，以0．01-0．1wt％，优选以0．05wt％(食品)的量加入食品中。乳酸细菌和双歧细菌可以每1克食品106-109个的量加入食品中。实施例1该实施例说明了用免疫后的母鸡的蛋制备含有特异性抗体的鸡蛋粉末。灭活抗原的制备从EHEC患者的腹泻粪便中分离出EHEC T001，并接种于201Tripticase大豆肉汤中。有氧培养18小时后，以3％(培养物)的量向该培养物中加入福尔马林以灭活细胞。确认培养物中的细胞已灭活后，将该培养物以12，000×g的速度离心20分钟，并用PBS(pH7．2)洗涤3次，得到用于免疫接种的抗原。免疫接种用PBS将灭活的细胞调整到含有1010-1011CFU／ml，并与油性佐剂混合制备免疫原。将该免疫原注射入16-18周大的白莱亨(White Leghorn)鸡的胸肌，每次注射0．5ml(初始注射)。初始接种8周后，以相同的方式相同的剂量用相同的免疫原注射作为增强剂量给药。<br> 如下所述，利用96孔微量滴定板测定蛋黄的抗体效价。将每个鸡蛋的蛋黄与蛋白分离，向蛋黄中加入重量相等的PBS。向该混合物中加入等体积的氯仿，然后进行振摇。该混合物离心后，分离上清液(水溶部分)作为测定抗体效价的样品。向每0．25ml连续两倍稀释的样品的PBS稀释物中加入已调节到在560nm处具有O．D．值0．45的用于凝集反应的等体积抗原，该混合物进行振摇。将微量滴定板的表面密封后，在37℃进行敏化2小时。将该微量滴定板在4℃放置约18小时并评定凝集的出现。凝集抗体效价用相应的显示出完全凝集的样品的最高稀释度来表示。增强剂量注射后两周，从每只母鸡获取的样品的抗体效价为1280-5120，此时开始收集鸡蛋。用蛋黄制备抗体将免疫的鸡蛋清洗并消毒后，将蛋黄与蛋白分离开，将多个鸡蛋的蛋黄合并，分成每8kg一组，并储存于-20℃以下直到使用。如下进行纯化向作为起始物质的7．5kg蛋黄中加入10倍量(重量)的蒸馏水以引起脱脂。向上清液中加入硫酸铵以产生40％饱和度。将该混合物搅拌并离心得到小丸。将该小丸溶于盐水，在溶解和振摇的同时，在-20℃下逐渐加入乙醇使产生50％终浓度。在4℃离心后，将小丸溶于盐水并过滤去除细菌，并冷冻干燥。结果，用7．5kg蛋黄得到了约15g浅黄白色粉末。抗体的回收率为50％，IgG的纯度为95％，含水量为2％。实验1该实验是为了研究蛋黄抗体粉末抑制Vero细胞毒素(VT1，VT2)的能力。利用Pirro等人(1995)的方法，如下进行某些改进后测定抑制Vero细胞毒素的能力。将1g抗体粉末溶于10ml无菌蒸馏水中，然后用PBS制成连续两倍稀释的溶液。向每孔中加入等体积的已调整到具有10 CD50毒素单位的维罗细胞毒素，在37℃下敏化60分钟。然后向每孔中加入已调整到含有5×104细胞的维罗细胞悬液，在CO2恒温箱中，在37℃下孵育96小时。用显示出细胞毒素抑制作用的相应最高稀释度来表示抗毒素抗体效价。<br> 蛋黄抗体粉末对VT1的中和抗体效价为2560，对VT2的为640。凝集抗体效价为20480。因此，所制得的蛋黄抗体粉末可中和两种类型的Vero细胞毒素并可凝集细胞。实验2在本实验中研究与细菌培养物混合的蛋黄抗体，以及其结合物用于无菌小鼠的EHEC感染模型时的功效，该无菌小鼠已口服接种了EHEC培养物使其感染。将这些小鼠分成4组，每组由10只4周大的无菌BALB／c雄性小鼠组成。在第I组中，每只小鼠口服溶于10ml无菌蒸馏水的1g从蛋黄制得的抗体粉末。第II组中的每只小鼠口服通过在37℃下在Briggs肝肉汤中培养18小时得到的人嗜酸乳杆菌(JCM1028)，短双歧杆菌(JCM1192T)，和双歧双歧杆菌(JCM1209)的混合细菌培养物。第III组中的每只小鼠口服上述抗体溶液和混合培养物的1∶1混合物。第IV组中的每只小鼠口服无菌Briggs肝肉汤。每只小鼠每天的给药量为0．5ml，一天一次，连续三天。<br> 抗体或其他物质首次给药3小时后，用1×107CFU的EHEC T001(O157；H7)激发每只小鼠。激发后7天内观察临床应答。将仍存活和快死的小鼠处死。检测每只小鼠结肠中EHEC细胞的数目并利用测定维罗细胞毒素的试剂盒检测维罗毒素的存在。<br> 表1显示了给药组和对照组中小鼠结肠中细胞的数目，出现的维罗细胞毒素，四肢麻痹情况(％)，以及死亡率。将给药组与对照组进行比较，III组(给予从鸡蛋制得的抗体和细菌的混合培养物的结合物)的功效最高，I组(从鸡蛋制得的抗体)有相当高的功效。II组的功效较低。<br> 值得注意的是，在第III组中，尽管结肠中的EHEC未完全消除，但只检测到少量Vero细胞毒素。相信这是因为本发明的蛋黄抗体可有效地防止临床症状(四肢麻痹)并降低死亡率。<br> 由于在该实验中所用的从蛋黄制得的抗体粉末在体外中和了维罗细胞毒素，因此可以认为小鼠体内由EHEC的生长产生的Vero细胞毒素通过服用抗体得到了中和。另一方面，有报道说乳酸细菌在某种程度上具有在体外和体内抑制EHEC生长和抑制维罗细胞毒素的活性。但是，从表1中可以看出，混合细菌培养物本身的作用不足。而混合培养物和本发明的特异性抗体的结合物可遏止因感染EHECO157引起的疾病，并显著降低小鼠的死亡率。<br> 表1在感染EHEC的小鼠中蛋黄抗体和混合细菌培养物的作用 <br> 由此可清楚地看出，用EHEC的整个细胞或其维罗毒素的类毒素作为抗原对母鸡进行免疫接种，用其产的蛋制得的特异性抗体在预防或治疗EHEC感染，特别是EHEC O157感染中是有效的。该特异性抗体是利用鸡蛋制备的，因此可通过简单的方法来大量并廉价地生产特异性抗体，且所得的蛋黄抗体是安全和没有副作用的。<br> <b>权利要求</b><br> 1．一种用于预防或治疗由肠出血性大肠杆菌引起的传染病的药物组合物，包含作为活性成分的针对肠出血性大肠杆菌的特异性抗体，和药学上可接受的载体或稀释剂，该抗体是用以整个肠出血性大肠杆菌细胞或由该细菌产生的Vero毒素的类毒素作为抗原进行了免疫接种的母鸡产的蛋制得的。<br> 2．一种用于预防或治疗由肠出血性大肠杆菌O157引起的传染病的药物组合物，其包含作为活性成分的针对肠出血性大肠杆菌O157的特异性抗体和药学上可接受的载体或稀释剂，该特异性抗体是用以肠出血性大肠杆菌O157的灭活细胞作为抗原进行了免疫接种的母鸡产的蛋制得的，其能够特异性凝集该细菌细胞并具有抑制该细菌产生的维罗细胞毒素的活性。<br> 3．一种用于预防或治疗由肠出血性大肠杆菌引起的传染病的药物组合物，其包含(a)针对肠出血性大肠杆菌的特异性抗体，(b)至少一种选自乳酸细菌和双歧细菌的细菌，和(c)药学上可接受的载体和稀释剂，该抗体是用以整个肠出血性大肠杆菌细胞或由该细菌产生的Vero毒素的类毒素作为抗原进行了免疫接种的母鸡产的蛋制得的。<br> 4．按照权利要求3的药物组合物，其中的肠出血性大肠杆菌是肠出血性大肠杆菌O157。<br> 5．一种用于预防由肠出血性大肠杆菌引起的传染病的食品，其含有针对肠出血性大肠杆菌的特异性抗体，该抗体是用以整个肠出血性大肠杆菌细胞或由该细菌产生的Vero毒素的类毒素作为抗原进行了免疫接种的母鸡产的蛋制得的。<br> 6．一种用于预防由肠出血性大肠杆菌引起的传染病的食品，其含有针对肠出血性大肠杆菌的特异性抗体，和至少一种选自乳酸细菌和双歧细菌的细菌，该抗体是用以整个肠出血性大肠杆菌细胞或由该细菌产生的Vero毒素的类毒素作为抗原进行了免疫接种的母鸡产的蛋制得的。<br> 7．按照权利要求5或6的食品，其中的肠出血性大肠杆菌是肠出血性大肠杆菌O157。<br> <b>全文摘要</b><br> 本发明提供了一种用于预防或治疗由肠出血性大肠杆菌引起的传染病的药物组合物,和用于预防该疾病的食品。该组合物包含作为活性成分的针对肠出血性大肠杆菌的特异性抗体,该抗体是用以整个肠出血性大肠杆菌细胞或由该细菌产生的维罗(Vero)毒素的类毒素作为抗原进行了免疫接种的母鸡产的蛋制得的。至少一种选自乳酸细菌和双歧细菌的细菌可以与上述抗体一起给药。<br> <b>文档编号</b>A61K39/40GK1203819SQ9810888<br> <b>公开日</b>1999年1月6日 申请日期1998年4月23日 优先权日1998年4月23日<br> <b>发明者</b>儿玉义胜, 横山英明, 古贺泰裕, 田中和生, 相场勇志 申请人:株式会社源<br></p></p><div class="like"><h3>产品知识</h3></div><div class="like" style="margin-left:30px;"><h3>行业新闻</h3></div><div class="artbtom"><ul><li><div class="hotComments-recent-title"><div class="sdhssh4s"><a href="http://www.ruyiyeyaji.com/news/1746257712.html">自助式口腔吸唾液分离装置制造方法</a></div><span>自助式口腔吸唾液分离装置制造方法【专利摘要】自助式口腔吸唾液分离装置，包括吸管、支撑器和吸唾垫，支撑器两侧分别设置一个牙托，支撑器内部设置一个上下连通的吸唾管，吸唾垫包括下垫、上垫和出口管，下垫和上垫分别与出口管连接形成一体式结构，下垫和上</span></div></li><li><div class="hotComments-recent-title"><div class="sdhssh4s"><a 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