专利名称：靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向于血小板源性生长因子受体-β (PDGFR-β)的主动靶向载药系统及其制备方法。
背景技术：
肝纤维化是慢性肝病重要病理特征，是发展到肝硬化的必经阶段。迄今为止国内外的研究就肝纤维化和早期肝硬化可以逆转，已有共识。根据肝纤维化的发病机制，抗肝纤维化治疗大致可分为3个范畴① 祛除肝损害的病因如乙型和丙型肝炎的抗病毒治疗；Φ阻断肝星状细胞(HSC)的激活和增殖，并促进其凋亡；③促进细胞外基质(ECM)的降解。目前国内外的研究在抑制HSC活化并促进其凋亡、调节ECM的合成和降解、调控一些细胞因子和介质等方面取得一些成果， 对肝纤维化的临床治疗提供了一些药物和方法，主要包括干扰素类(IFN-α和IFN-Y)、 细胞因子、抗炎保肝药和一些中医中药等，但总体疗效仍不理想。因此，在我们这样一个肝病大国，加之慢性肝病继续发展成肝硬化和肝癌，给人民大众带来较高的致死率和致残率的情况下，探究理想有效的抗肝纤维化药物和方法，意义深远。分析限制抗肝纤维化药物临床应用的一些重要原因，包括药物半衰期短、靶细胞周围的有效药物浓度不够、疗效较低和药物全身系统作用带来的非靶组织和细胞的副作用大等方面(Bataller R, et al. J. Clin. Invest 2005，115(2) :209-218.)。探寻解决这类问题的途径和方法，以期能改善抗肝纤维化药物的疗效，最终服务于临床治疗，应对策略之一可通过主动靶向载药系统转运药物，达到靶向释药的效果，就是将药物限定于作用部位， 以达到最佳治疗指数和减少作用于非靶向部位引起的副作用的目的，因此，针对肝纤维化相关靶细胞的主动靶向载药系统为无良好治疗效果或(和)有严重非靶细胞副作用的现有的临床抗肝纤维化药物的使用创造了新的机会。鉴于HSC激活在肝纤维化发展过程中的中心事件的地位，因此，HSC是抗肝纤维化治疗的首选靶细。构建针对HSC的靶向载体，并通过载体转运药物，可达到靶向、增加疗效及减少抗肝纤维化药物的全身副作用的目的。近年来，有多种针对HSC靶向载药系统的研究(Adrian, et al. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes 2007，1768( 6 ) 1430—1439 ；Mei jer DKF, et al. Journal of Con trolled Release 2001,72(1—3): 157—164; Sato, Y, et al. Nature Biotechnology!^, 26(4) : 431-442)，一些靶向载药系统通过特异识别HSC表面优势过度或特异性表达的受体而发挥HSC靶向作用，如与转化生长因子(TGF^1)介质激活相关的针对甘露糖-6-磷酸酯酶/胰岛素样生长因子II型受体的甘露糖-6-磷酸酯酶修饰的人血白蛋白(M6P-HSA)靶向载药系统；针对VI型胶原受体(VI-CR)的RGD环肽-HSA的靶向载药系统；针对血小板源性生长因子受体β (PDGFR-β )的pPB环肽-HSA靶向载药系统；针对视黄醇结合蛋白受体(RBP-R)的Vitamin A-脂质体的靶向载药系统。血小板源性生长因子(PDGF)是肝纤维化形成过程中最强的促增殖因子，与转化生
3长因子(TGF-h)在肝纤维化的形成中起着重要作用，而且PDGF受体β (PDGFR-β ) 已被广泛的证明在激活的HSC上优势过量表达(Pinzani Μ, et al. Am J Pathol 1996, 148785-800； Borkham-Kamphorst Ε, et al. Laboratory Investigation 2008, 88 (10) : 1090-1100)，相比于HSC上可被选择的其它靶点(如VI-C受体)，优势过度表达的PDGFR-β显示出与肝纤维的发生和发展更密切的相关性。但由于PDGF作为肝纤维化过程中最强的促HSC的细胞丝裂原，影响到细胞的增殖和分化的重要作用，不能应用PDGF 全分子作为靶点的配体，已有研究(Clements JM, et al. EMBO J 1991, 10:4113-4120; Beljaars L, et al. Biochemical Pharmaco logy200 >, 66 (7) 1307-1317)蹄选并证实了结合的关键位点是PDGF分子27位R和30位I,包含这2个关键位点的pPB能与PDGFR- β结合。对载体表面添加配体结合位点，可构建成主动靶向载体。Beljaars L等(Beljaars L, et al. Biochemical Pharmacology 2003 ； 66 (7) 1307-1317)就利用 pPB 为靶向头基， 人血白蛋白为载体构建了 PPB-HSA主动靶向载药系统，并进一步证明了 pPB可与NIH/3T3 fibroblast细胞株上的PDGFR-β结合，但不会影响细胞内的信号传导。同样的研究团队， 最近报道了他们构建的这个pPB-HAS主动靶向载药系统递送抗肿瘤药物doxorubicin的实际应用(Prakash J, et al. Journal of Controlled Release 2010，145(2) : 91-101)。 另夕卜，Schoemaker MH等(Schoemaker ΜΗ, et al. Molecular Pharmaceutics 2008,5(3): 399-406)也利用pPB作为靶向头基，腺病毒作为载体，构建了 pPB-腺病毒的主动靶向HSC 的基因载体。目前，药物的聚乙二醇化和药物包封于载体脂质体被认为是两种很好的延长药物在体内的半衰期、增加其稳定性、降低免疫源性的有效手段，这样扩大了药物的应用范围，同时减少了刺激和毒副反应的发生。因此，相比于腺病毒载体的一些尚未解决的严重问题(Younes HM, et al. Journal of Pharmaceutical Sciences 2002， 91: 2—17)，月旨质体作为载体在临床应用中更具有安全好、生物相容性好、载药及靶向效果明确的优点，也是最早用于靶向给药的载体，且于1992年美国FDA正式批准脂质体用于人类疾病的治疗。相比于修饰的干扰素和修饰白蛋白的载体系统，脂质体作为载体具有载药谱更广、单体性、不引起蛋白分子空间结构的改变和非免疫原性的优点。目前临床上应用的抗肝纤维化药物，主要包括干扰素(IFN)类、细胞因子、抗炎保肝药和一些中医中药等，虽然总的来说，并没有令人满意抗肝纤维化的临床用药，但在这些药物中比较受肯定的是IFN类。IFN主要包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ 3种，其中IFN-α 和IFN-β更多的是通过其明显的抗病毒作用而在慢性肝病的治疗中发挥药效。而IFN-γ 是由致敏的T淋巴细胞和NK细胞产生，它被证明具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和抗肝纤维化等作用。IFN-Y又称免疫干扰素而不同于IFN-α、β，其抗病毒作用弱于IFN_a、β， 它更具有免疫调节作用，IFN-Y是目前已经被批准应用的抗肝纤维化作用药物，在慢性肝病的治疗中IFN-Y更多的是通过其抗肝纤维化作用，许多体内外实验中表明，IFN-Y主要通过抑制HSC的激活、促进细胞的凋亡、降低ECM的沉积、抗炎、拮抗TGF-β工等细胞因子及直接抑制基质的合成及其促进基质的降解等方面。但在临床应用中IFN-Y表现出相对低的疗效、相对短的半衰期和一些严重的副作用，如发热、血细胞减少、肝功能损害加重等，严重制约着IFN-γ的临床应用。因此，需要研发靶向高效、高纯度、大剂量和长效的IFN-Y。

发明内容
本发明的目的是提供一种具有长循环性和靶向性并能提高抗肝纤维化药物的药效、减少其副作用的主动靶向载药系统及其制备方法。为了达到上述目的，本发明提供了一种靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统，其特征在于，包括靶向于PDGFR-β的基团，所述的靶向于PDGFR-β的基团与抗肝纤维化药物载体连接，抗肝纤维化药物载体上担载有抗肝纤维化药物。优选地，所述的靶向于PDGFR-β的基团为靶向环肽，序列为半胱氨酸丝氨酸-精氨酸-天冬酰酸-亮氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸*(即C*SRNLIDC*，ρΡΒ)， *代表成环位置，其中精氨酸(R)和异亮氨酸(I)残基是介导与靶细胞上PDGFR-β结合的位点，通过PPB与肝星状细胞上优势过度表达的PDGFR-β结合，而使该主动靶向载药系统实现主动靶向，并避免非靶细胞受累引起的全身副作用。优选地，所述的抗肝纤维化药物载体为空间稳定性脂质体(SSL)。优选地，所述的空间稳定性脂质体(SSL)为聚乙二醇化的脂质体。聚乙二醇化的脂质体可规避调理素的作用，避免网状内皮系统的吞噬，进一步保障靶向脂质体主动靶向至靶细胞HSC，而不是更多的被肝脏中网状内皮系统吞噬。优选地，所述的抗肝纤维化药物为IFN-γ。本发明还提供了上述靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统的制备方法，其特征在于，具体步骤为分别合成靶向于PDGFR-β的基团和抗肝纤维化药物载体，将靶向于 PDGFR-β的基团与抗肝纤维化药物载体相连接。优选地，所述的靶向于PDGFR-β的基团的合成方法为采用Boc-氨基酸固相合成方法合成靶向环肽，序列为半胱氨酸丝氨酸-精氨酸-天冬酰酸-亮氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸*，*代表成环位置，作为靶向于PDGFR-β的基团。优选地，在所述的靶向环肽上引入保护性巯基，形成巯基化的靶向环肽。优选地，所述的抗肝纤维化药物载体的合成方法为将蛋磷脂酰胆碱(EPC)Ji 固醇(Choi)、甲氧基-聚乙二醇■。- 二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(HiPE(^cici-DSPE)和马来酰亚胺-聚乙二醇34(1(Γ 二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(HiaI-PEG34cici-DSPE)溶于有机溶剂中，蒸干有机溶剂，共同成膜，形成聚乙二醇化的脂质体，作为抗肝纤维化药物载体。优选地，所述的聚乙二醇化的脂质体水化后，依次挤压过400nm、200nm、IOOnm和 50nm孔径的膜，得到纳米级别的粒径均一的脂质体。优选地，所述的靶向于PDGFR-β的基团上带有巯基，所述的抗肝纤维化药物载体上带有马来酰亚胺基，靶向于PDGFR-β的基团与抗肝纤维化药物载体之间的连接通过巯基与马来酰亚胺基之间的反应实现。本发明的有益效果如下
(1)、经试验证明，本发明的主动靶向载药系统具有长循环性和靶向性并能提高抗肝纤维化药物的药效、减少其副作用。(2)、本发明的靶向环肽可与PDGFR-β特异性结合，与其他非多肽的靶向载药系统相比，小分子多肽作为靶向头基具有化学结构明确，高纯度并可被大量制备的优点。而且，环肽相比于线型多肽具有相对稳定的结构。(3)、立体稳定脂质体(SSL)的聚乙二醇化的设计，相比于普通脂质体，和保证达到纳米粒级别(<100nm)的粒径，能够使它规避网状内皮系统的吞噬，更具有长循环的特性及更能保障这样的载药系统传送的药物能够克服颗粒性载体(包括脂质体)的扩散易受内皮屏障的主要内在缺陷，尤其是保障脂质体能通过由于肝纤维化时基底膜毛细血管化，通过孔径变小的窦血管内皮屏障，达到靶细胞HSC所在的Disse间隙，真正实现主动靶向HSC。


图1为环肽pPB的结构示意图； 图2为SSL-IFN- γ结构示意图3为pPB-SSL-IFN- γ结构示意图4为IFN-Y和pPB-SSL-γ在正常大鼠体内的药代动力学曲线图5为IFN-Y和pPB-SSL-IFN-γ在正常大鼠体内组织分布曲线图6A为被SSL载体传送的IFN- γ在纤维化肝脏中的细胞定位图6B为被pPB-SSL载体传送的IFN- γ在纤维化肝脏中的细胞定位图7Α为治疗4周后各组TAA大鼠肝组织的病理情况图(HE染色，xlOO)。；
图7B为各组大鼠肝组织的病理Ishak肝纤维化分期情况图8A为各组TAA大鼠肝组织的I型胶原免疫组化染色图(xlOO)，棕黄色指示阳性染
色；
图8B为各组大鼠肝组织的I型胶原免疫组化染色面积的定量比较图； 图9为各组大血清IV-C水平的比较图； 图10为各组大鼠肝组织中α -SMA蛋白表达情况图； 图11为各组大鼠血清AST水平的比较图； 图12为各组大鼠的WBC计数比较图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例来具体说明本发明。实施例pPB-SSL-IFN-γ 的合成
第一步根据传统的Boc-氨基酸固相合成方法，合成环肽C*SRNLIDC* (pPB) 称取 Boc-Cys (Mbzl)-PAM 树脂 0. Immol，在 DMF 中溶胀 15min，用 1%TFA 脱除 N-Boc 保护基团，用DMF反复冲洗；
称取Boc-Asp (D)氨基酸0. 88mmol，溶解于含有缩合剂HBTU (用DMF配成0. 5M) Iml 和 0. 25ml DIEA (购自 Fluka-Sigma-Aldrich 公司，货号 03440，CAS 号 7087-68-5)的混合溶液中，加入到上述脱保护的树脂，反应20-30min从而在上述树脂上连接Asp，用DMF洗涤， 用1%TFA脱保护，用DMF再洗涤；
按照上述方法，依次在上述树脂上连接Asp、lie、Leu、Asn、Arg、Ser和Cys，用DMF洗涤树脂，加入甲醇进行沉淀，干燥，将其于0°C加入含有5%对甲酚(p-cresol，g/ml)的无水 HF溶液30mL中，磁力搅拌Ih以切割树脂，所得产物加入冷乙醚沉淀，得到线性多肽粗品； 在粗品中加入50%乙腈分散和沉淀，再旋转蒸发去除乙腈，冻干得线性多肽CSRNLIDC， 高效液相色谱仪检测其纯度>95%，质谱法(ESI-MS)检测其分子量与理论分子量相符，证实线性多肽的正确合成后，通过制备HPLC纯化，再冻干得纯品。
将二甲基亚砜加入到(pH=6. 0)的磷酸盐缓冲溶液中，配成二甲基亚砜体积百分浓度为20vd%的二甲基亚砜磷酸盐缓冲溶液，将所得的线性多肽纯品以lmg/ml的浓度溶解于所述二甲基亚砜磷酸盐缓冲溶液，在室温下磁力搅拌过夜，二硫键(-S-S-)形成，线性多肽首尾成环，冻干得环肽PPB粗品，经HPLC检测，ESI-MS测定其分子量证实线性多肽环化成功，经高效制备液相纯化后，再冻干得PPB纯品，_70°C保存待用，如图1所示，为环肽pPB 的结构示意图。第二步合成巯基化的pPB
根据文献报道的利用N- 丁二酸，S-乙酰基巯基乙二醇酯OV-Succinimidyl S-Acetylthioacetate, SATA)或 N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸 OV-Succinimidyl S-Acetylthiopropionate, SATP )引入保护性巯基的方法(Beljaars, L, et al. Biochemical Pharmacology 2003,66(7):1307-1317 ；Instructions of SATA and SATP form PIERCE)；
将pPB溶解于DMF中配成pPB浓度为20mg/ml (10-30mg/ml皆可)的溶液，再加入 SATP，SATP与pPB的摩尔比为6 :1 (2 10 :1皆可)，最后加入20 μ 1的N，N 二异丙基乙胺 (DIEA)，在室温条件下磁力搅拌反应，HPLC检测，提示有pPB-SH出现，反应较完全后，终止反应，制备HPLC纯化，冻干得pPB-SH纯品，ESI-MS检测其分子量。
上述方法中的SATP也可换成SATA，通过SATA或SATP方法引入巯基，巯基有乙酸盐 (acetate, CH2CO-)的保护，因此，SATA或SATP修饰的多肽或蛋白可长期保存待用。第三步制备未接靶向头基的立体稳定脂质体SSL和SSL-IFN- γ
牛艮据文献 艮道的方法(Du SL, et al. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2007，322 (2) : 560-568)略加以修改，即将其膜成分中的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)换成(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)DSPE来制备SSL。具体制备方法按2 :1 :0. 1 :0. 02(摩尔比)分别称取 EPC 20ymol、Chol ΙΟμπιοΙ、 mPEG2000-DSPE 1 μ mol 和 mal_PE(i34(1(1-DSPE 200nmol,溶于 4ml 氯仿中，然后将此溶液在 40。C 水浴的条件下，利用逐步减压和旋转蒸发的方法，蒸干有机溶剂，成膜，室温真空干燥过夜后，加入2ml的PBS溶液(pH 7. 2)在冰浴条件下(4°C)振荡池水化，得空白SSL ；
若加入2ml含有IFN- y (lxl06IU/ml)的PBS溶液(pH 7. 2)在冰浴条件下振荡2h水化，得包封IFN-Y的SSL (SSL-IFN-Y)0通过CL-4B凝胶柱层析除去没被包封的游离的 IFN- γ，再用Mini Extruder依次通过400nm-200nm-100nm-50nm孔径的滤膜反复挤压15 次/滤膜，得到粒径均一的带明显蓝色乳光的SSL-IFN- Y，如图2所示，为SSL-IFN- γ结构示意图，其中mPEG_-DSPE和mal-PEG34(1(1-DSPE的DSPE端插入脂质双分子层，另一端朝外。第四步制备环肽pPB修饰过的立体稳定性脂质体
将第二步制得的PPB-SH按照与第三步制得的SSL-IFN- γ中mal-PE(i34(1(1-DSPE摩尔比为10 1的量加入到SSL-IFN- γ (ρΗ7· 2-7. 5皆可，具体操作时采用ρΗ7· 3)中，再加入 1/10体积的脱保护液(制备方法为将羟胺和EDTA溶解在PBS缓冲液中得到含有0. 5Μ羟胺和25mM EDTA的溶液，用NaOH调节pH为7. 3 (pH7. 2-7. 5皆可))以脱去pPB_SH的保护性 acetate，暴露出-SH与SSL-IFN-γ中的mal反应，室温下磁力搅拌反应池，得到pPB修饰的SSL-IFN- γ，再通过CL-4B凝胶柱去除游离的pPB_SH，得纯化的pPB_SSL_IFN- Y。如图 3所示，为pPB-SSL-IFN- γ结构示意图，用激光粒径散射仪测定平均粒径为83. 5nm,多分散系数为(PI)为0. 067 ；应用酶联免疫吸附法测得IFN-Y的包封率为32. 73士4. 61% (n=3)； 载药量为 8. 99xl04士0. 93 IU/ymol 磷脂。将上述步骤中的SSL-IFN- γ替换为SSL，制成pPB_SSL。应用例
利用实施例中得到的pPB-SSL-IFN- y、SSL-IFN- y、pPB-SSL以及目前临床上应用的游离IFN-Y剂型进行对大鼠肝纤维化治疗作用的对比研究，具体技术路线和结果如下 一、验证pPB-SSL-IFN- γ的药效学作用基础长循环和靶向性 1 , IFN- γ和pPB-IFN-γ在正常大鼠体内的药代动力学研究
0. 5ml 的 IFN-y (106IU/ml)和 pPB-SSL-IFN- γ (含 IFN-y 105IU/ml)经正常大鼠尾静脉注入后，通过动态检测不同时间点血液标本中IFN-Y的浓度，评估二者的药代动力学规律。结果显示IFN-Y和pPB-SSL-IFN-γ的半衰期分别是0. 234士0. 022h和 1. 146士0. 139h，后者明显延长;pPB-SSL-IFN- γ的曲线下面积(AUC)明显大于IFN-γ，如图4所示，为血液中IFN-Y残留率示意图代表的药代动力学曲线，以上结果均提示了被包封于pPB-SSL中的IFN-Y比较游离剂型的IFN-Y在血中消除明显缓慢，较好地保持了其在血液中得浓度，延长了 IFN-Y有效的作用时间，提高了其有效的生物利用度，取得了药物缓慢释放的长循环效果。2、IFN- γ和pPB-SSL-IFN- γ在正常大鼠体内的组织分布的研究
(Iml) IFN-y (105IU/ml)和 pPB-SSL-IFN-γ (含 IFN-γ 1. 65xl04IU/ml)经正常大鼠尾静脉注入后，24h时麻醉处死大鼠，取得心、肝、脾、肺、肾、脑和肠的标本，通过ELISA法检测IOOmg相应组织中IFN-Y含量，评估二者的大鼠体内组织分布规律。结果显示在药物注入的24h时，包封于pPB-SSL中的IFN- γ主要集聚于肝脏中(Ρ<0. 0001),而游离IFN- γ 组主要集聚于肝脏和肠道中(Ρ<0. 0001)，如图5所示，为IFN-Y和pPB-SSL-IFN-γ在正常大鼠体内组织分布曲线图，进一步比较不同处理组中相同组织中IFN-Y的差异，在取得的心、肝、脾、肺、肾、脑、肠的标本中，pPB-SSL-IFN- γ处理组的IFN-γ的含量均明显多于游离IFN- γ处理组(P<0. 05,图中仅肝脏组织对比组有标识&，提示P<0. 05)。以上结果提示 pPB-SSL-IFN- γ的体内分布明显的肝靶向性和相比于IFN-γ明显的长循环性。3、免疫荧光组织化学法评估药物在纤维化大鼠肝组织的细胞中的分布
采用免疫荧光组织化学双标染色α-SMA和IFN-Y的方法，考察SSL-IFN-γ和 pPB-SSL-IFN- γ在纤维化肝组织中的细胞定位情况，具体操作如下
分别给予肝纤维化大鼠含有相同IFN- Y浓度Oxl05IU/ml)的SSL-IFN- γ和 pPB-SSL-IFN- Y各0. 5ml，尾静脉注入。注入后浊时间点，取肝脏组织入冰冻切片包埋剂(OCT)，并-20°C恒冷切片机冰冻切片，4%多聚甲醛固定20min，IxPBS洗后， 加0. 2%Triton-100破膜3min，IxPBS洗后，加入m的牛血清白蛋白(BSA)室温下封闭 30min，后加入兔抗大鼠a-SMA(稀释倍数1:100，购自Millipore公司，Cat. #04-1094， Lot#NG1645432)和小鼠抗人IFN- Y (稀释倍数1 50，购自北京博奥森公司，货号 bsm-0388M), 4°C孵育过夜后，IxPBS洗，加入异硫氰荧光素(FITC)标记的山羊抗兔IgG (1 100，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号HH012-1，为美国进口分装产品)和罗丹明ahodamine)标记的山羊抗小鼠IgG (稀释倍数1 :100，购自上海麦约尔生物技术有限公司，Cat. NO. RSA0001),室温下孵育30min, IxPBS洗后，加4，，6- 二脒基-2-苯基吲哚
8(DAPI，稀释倍数1 :2000，购自碧云天生物技术研究所，产品编号C1002)，染核lmin，IxPBS 洗。50%甘油/PBS封片，荧光显微镜下观察、记录，并计算IFN-Y和α-SMA共标阳性细胞率。
如图6Α和图6Β所示，为被SSL和pPB-SSL载体传送的IFN- γ在纤维化肝脏中的细胞定位图，图中清晰的显示了被pPB-SSL传送的IFN- γ主要分布在肝细胞界板之间的Disse 间隙区域；而被SSL传送的IFN-γ更多的分布在肝细胞界板区域的肝细胞浆。进一步计算pPB-SSL-IFN- γ处理组IFN-γ阳性细胞占α -SMA阳性细胞为60. 13 士9. 15%，明显高于 SSL-IFN-γ 处理组(12. 11 士3. 26%) (η=3, Ρ<0. 01)，提示了 pPB-SSL 传送的 IFN-γ 在纤维化肝脏中的细胞定位主要是肝星状细胞，但SSL传送的IFN-Y主要被肝脏中占绝大多数的肝细胞内吞，表明了被PPB-SSL载体包封的IFN-Y肝星状细胞靶向性明显优于被SSL 包封的IFN-Y。以上实验验证了实施例中制备的pPB-SSL-IFN-γ具有长循环性和肝靶向性，且在纤维化大鼠肝脏明显的HSC靶向性。二、考察和验证pPB-SSL-IFN-γ增强的抗肝纤维化作用和改善某些副作用的效果
1、实验分组和干预处理方法
大鼠腹腔注射0. 2g/kg硫代乙酰胺(TAA)，每周2次，8周时，病理证实肝纤维化已经形成，继续腹腔注射0.2g/kgTAA，造膜至10周，随机选取40只大鼠分成5组(n=8)，开始给予药物干预处理，分别为①对照组；②低剂量IFN-γ组 > 高剂量IFN-γ组P SSL-IFN- γ组；⑤pPB-SSL-IFN- γ组，其中①对照组又分成Ph汪入组(模型对照组)和空白pPB-SSL注入组(η=4)；②(I)⑤组中含有的IFN-γ浓度均为hl05IU/ml 一组中含有的IFN-Y浓度为106IU/ml，每周2次，每次0.5ml相应的药物尾静脉注射，共4周。整个实验过程中，6只正常大鼠，作为正常对照组，在同样条件下随同饲养。2、实验标本的留取和观察指标的选择
药物干预处理4周后，最后1次给药4 后，水合氯醛麻醉后，下腔静脉取血和取肝组织，并处死动物。全血离心得血清标本，-20 0 C保存，一批次采用全自动生化仪检测血肝功能(丙氨酸转氨酶，ALT ；门冬氨酸转氨酶，AST ；白蛋白，ALB)指标；采用放射免疫法检测血清肝纤维化指标(透明质酸，HA和IV型胶原，IV-C)指标。EDTA抗凝血，一批次检测血液分析指标。肝组织标本分成两份，一份进行4%的中性甲醛进行固定，行病理检测，采用HE染色、Masson三色胶原纤维染色、I型胶原的免疫组织化学染色；另一份肝组织置于液氮中速冻，进一步行western blot检测和肝组织羟脯氨酸含量的测定。3、实验结果和结论
这部分的研究要考察和评价不同剂型中的IFN-Y的抗肝纤维化疗效，如上所述，本发明选择了肝组织病理肝纤维化分期和炎症分级、肝组织中羟脯氨酸含量、肝组织中I型胶原的面积定量、肝组织中α -SMA的蛋白表达、血清学肝纤维化指标(HA和IV_C)和血液分析(白细胞计数，WBC ；血红蛋白，HGB ；血小板，PLT)作为考察指标。pPB-SSL-IFN- γ治疗组显示了明显增强的抗大鼠肝纤维化的疗效，具体表现在 与模型对照组、低剂量IFN- γ组(IFN- γ )、高剂量IFN- γ组(5xIFN_ y )和SSL-IFN- γ组相比，pPB-SSL-IFN-γ组大鼠的病理肝纤维化分期明显减轻(如图7A和7B所示)、1型胶原染色面积明显减少(如图8A和8B所示)、血清IV-C的水平(如图9所示)和肝组织α -SMA 蛋白表达水平(如图10所示)明显下降。 本发明进一步考察了 pPB-SSL-IFN-γ是否改善IFN-γ的一些副作用，结果显示①pPB-SSL-IFN- γ治疗组大鼠的AST水平明显低于SSL-IFN- γ治疗组(如图11 所示)，考虑由于SSL载体的非靶向性，IFN-Y容易被肝细胞内摄入，而带有明显HSC靶向的？ 8-551^载体系统会选择性的传送0^-^靶向于HSC，因此，IFN-Y引起的肝细胞损伤指标AST明显好转；③IFN- γ和hIFN- γ能明显减少WBC计数水平，而pPB_SSL_IFN- γ 治疗组的WBC计数高于IFN- γ和5xIFN- γ (如图12所示)，尽管P=O. 07和P=O. 072 没有达到Ρ<0. 05的统计学意义的差别，但P已非常接近0. 05，提示也许增加样本量， pPB-SSL-IFN-y剂型能够改善游离IFN-γ药物剂型造成的WBC降低，可达统计学意义。因此，pPB-SSL-IFN- γ的HSC靶向性显示了比SSL-IFN- γ制剂类型更有效的改善AST升高的效果，还可在一定程度上改善IFN- γ造成的WBC减少。
权利要求
1.一种靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统，其特征在于，包括靶向于PDGFR-β的基团，所述的靶向于PDGFR-β的基团与抗肝纤维化药物载体连接，抗肝纤维化药物载体上担载有抗肝纤维化药物。
2.如权利要求1所述的靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统，其特征在于，所述的靶向于PDGFR-β的基团为靶向环肽，序列为半胱氨酸丝氨酸-精氨酸-天冬酰酸-亮氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸*，*代表成环位置。
3.如权利要求1所述的靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统，其特征在于，所述的空间稳定性脂质体为聚乙二醇化的脂质体。
4.如权利要求3所述的靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统，其特征在于，所述的抗肝纤维化药物为IFN-Y。
5.权利要求1所述的靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统的制备方法，其特征在于， 具体步骤为分别合成靶向于PDGFR-β的基团和抗肝纤维化药物载体，将靶向于PDGFR-β 的基团与抗肝纤维化药物载体相连接。
6.如权利要求5所述的靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统的制备方法，其特征在于，所述的靶向于PDGFR-β的基团的合成方法为采用Boc-氨基酸固相合成方法合成靶向环肽，序列为半胱氨酸丝氨酸-精氨酸-天冬酰酸-亮氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸*，*代表成环位置，作为靶向于PDGFR-β的基团。
7.如权利要求6所述的靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统的制备方法，其特征在于，在所述的靶向环肽上引入保护性巯基，形成巯基化的靶向环肽。
8.如权利要求5所述的靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统的制备方法，其特征在于，所述的抗肝纤维化药物载体的合成方法为将蛋磷脂酰胆碱、胆固醇、甲氧基-聚乙二醇2__ 二硬酯酰磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺-聚乙二醇二硬酯酰磷脂酰乙醇胺溶于有机溶剂中，蒸干有机溶剂，共同成膜，形成聚乙二醇化的脂质体，作为抗肝纤维化药物载体。
9.如权利要求8所述的靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统的制备方法，其特征在于，所述的聚乙二醇化的脂质体水化后，依次挤压过400歷、200歷、IOOnm和50nm孔径的膜， 得到纳米级别的粒径均一的脂质体。
10.如权利要求5所述的靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统的制备方法，其特征在于，所述的靶向于PDGFR-β的基团上带有巯基，所述的抗肝纤维化药物载体上带有马来酰亚胺基，靶向于PDGFR-β的基团与抗肝纤维化药物载体之间的连接通过巯基与马来酰亚胺基之间的反应实现。
全文摘要
本发明提供了一种靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统及其制备方法，所述的靶向于PDGFR-β的基团为靶向环肽，其特征在于，包括靶向于PDGFR-β的基团，所述的靶向于PDGFR-β的基团与抗肝纤维化药物载体连接。上述靶向于PDGFR-β的主动靶向载药系统的制备方法，其特征在于，具体步骤为分别合成靶向于PDGFR-β的基团和抗肝纤维化药物载体，将靶向于PDGFR-β的基团与抗肝纤维化药物载体相连接。经试验证明，本发明的主动靶向载药系统具有长循环性和靶向性并能提高抗肝纤维化药物的药效、减少其副作用。
文档编号A61P1/16GK102228694SQ20111016239
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者李清华, 李锋, 王吉耀, 谢操, 陆伟跃 申请人:复旦大学, 复旦大学附属中山医院