专利名称：红景天多糖注射制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于中药制药技术领域，具体涉及红景天多糖注射制剂及其制备方法。
背景技术：
红景天为景天科红景天属植物，在我国分布广泛，其中含有高山红景天、狭叶红景天、大花红景天、大株红景天等药用品种。红景天中含有红景天苷、酪醇、黄酮、多糖等多种有效成分。文献报道，红景天中含有的大量红景天多糖，具有提高免疫、抗病毒、降血糖、抗肿瘤等生物活性。在现有的红景天为原料的药物制剂中，主要是以红景天中除多糖以外的活性成分为有效成分，而大都没有考虑其中所含的多糖的药理作用。申请号为CN00115423.0的专利文献，公开了从大花红景天中提取的含多糖的大分子提取物制备成片剂、胶囊、颗粒剂等口服剂型用于抗疲劳和抗辐射作用，由于多糖类成分口服生物利用度很低，因此口服给药效果不理想。
在资料检索中，未发现有以红景天多糖为活性成分的注射制剂的任何报道。

发明内容
针对目前国内红景天多糖利用现状，我们开发了红景天多糖注射制剂。
本发明的一个目的是公开红景天多糖注射制剂。
本发明的另一个目的是公开上述红景天多糖注射制剂的制备方法。
本发明通过以下方案实现。
一、制备方法(1)取红景天药材，粉碎，过40目筛，加8-14倍量水，浸泡半小时，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为30-60分钟，振荡频率为20-80kHz，提取3-4次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩成浸膏；(2)将上述浸膏加入30-40倍量60℃-80℃的水，搅拌，静置片刻，倾出上清液，减压浓缩至溶液∶药材为1∶1，加入95％乙醇使得含醇量达70％-90％，静置24小时，过滤，沉淀备用；(3)将上述沉淀用20-30倍量水溶解，在搅拌下滴加1％鞣酸的同时加温，煮沸后离心除去沉淀物，继续加鞣酸至溶液不产生混浊，过已处理好的聚酰胺柱，用4-8倍的水洗脱，收集水洗液，用截留分子量为70000-80000的超滤膜超滤，滤液再用截留分子量为20000-30000的超滤膜超滤，收集未通过液，减压浓缩，干燥，即得红景天多糖；(4)制剂的制备水针制剂的制备称取上述红景天多糖用注射用水溶解，用葡甲胺调pH值为7.5-8.0，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成水针制剂。
粉针制剂的制备称取上述红景天多糖用注射用水溶解，加入水溶性冻干赋形剂，用葡甲胺调pH值为7.5-8.0，用0.22μm微孔滤膜过滤，干燥，制备成粉针制剂。
上述红景天药材包括高山红景天、狭叶红景天、大花红景天、大株红景天、西藏红景天、云南红景天等。
超声提取技术是利用超声波产生强烈振动，高速度，强烈的空化效应，搅拌作用，能破坏药材的细胞，使溶剂能渗透到药材细胞中，从而加速药材中的有效成分溶解于溶剂中。超声技术提出率高、提取时间短、提取温度低，在本发明的制备方法中对红景天药材的提取，可以使得红景天多糖有效成分提取率高；温度低，对于杂质的提取量比起水煎少了很多，对于后续的除杂过程来了方法。
鞣酸除蛋白是经典的方法，但是鞣酸的量不易控制。鞣酸加入过少，对蛋白的沉淀不完全，会使得药物的安全性下降；加入过多，若不除去，会增加注射时患者的疼痛感。聚酰胺对于鞣酸有很好的吸附作用，对红景天多糖则没有吸附作用。利用这一点，可以除去沉淀蛋白所加入的过量的鞣酸和一些能被聚酰胺吸附的杂质，对红景天多糖进一步纯化。
超滤技术是指常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜分离介质、以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，高分子物质被滤膜阻留，从而达到分离、纯化、浓缩的发展最快的新型膜分离技术。与传统分离方法相比，具有分离过程无相变、分离效率高、无需添加化学试剂无污染、无需加热、能耗低、条件温和不破坏成分、操作方便、流程短的特点。本发明利用超滤技术，选择合适的超滤膜，去除了无活性的大分子和小分子物质，对具有活性的红景天多糖进一步纯化。
根据我们的研究发现，红景天多糖随分子量增大，药理作用更好，但分子量大于100000，则联接有多种基团，容易产生严重的不良反应，临床上表现出药物毒副反应发生。因此我们在制备过程中，截留了分子量20000-80000部分。
二、不同分子量红景天多糖的安全性评价将红景天多糖总提物用超滤膜超滤，分为分子量小于20000(小分子组)、20000-80000(中分子组)、大于80000(大分子组)三个范围的多糖成分。
过敏反应又称变态反应，是机体受某些抗原物质刺激所产生的特异反应，一般认为能诱发过敏反应的抗原物质主要是蛋白质、多肽、多糖等大分子物质(具有完全抗原性、为全抗原)。本发明利用过敏反应来进一步观察本发明制剂的安全性。
取健康无伤豚鼠30只，体重250-300g，随机分为三组，每组10只，分别为红景天多糖小分子注射液组、红景天多糖中分子注射液组、红景天多糖大分子注射液组。分别按无菌操作，每天每只肌肉注射供试品4.0ml，共5次。观察注射后动物的过敏反应症状。
结果红景天多糖大分子注射液组中有4只豚鼠出现了过敏反应，而红景天多糖小分子注射液组、红景天多糖中分子注射液组中豚鼠的过敏反应发生率为零。说明红景天分子量大于80000的多糖注射给药很容易出现不良反应，安全性不好。
三、不同分子量红景天多糖的药效学实验本实验所用红景天多糖样品同上，由广东天之骄药物开发有限公司实验室提供，实验时用生理盐水配成所需浓度。
选用昆明种雄性小鼠30只，18-22g。将接种后7天的H22瘤株荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，在无菌条件下取出腹水，用生理盐水1∶3稀释，于腋窝皮下接种瘤液0.2ml。接种后24小时，将动物随机分为3组，每组10只。设空白对照组，红景天多糖小分子注射液组、红景天多糖中分子注射液组。各组给药剂量为50mg/kg，空白对照组给予等体积的生理盐水。每日1次，连续给药10天。末次给药后，颈椎脱臼处死动物，分别称体重、瘤重，计算肿瘤抑制率，进行疗效评价。
肿瘤生长抑制率(％)＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％实验结果见表1。
表1 对小鼠肝癌H22生长的抑制作用(X±S)组别 鼠只(只) 瘤重(g)抑制率(％)空白对照组10 2.34±0.74-红景天多糖小分子组10 2.22±0.685.1红景天多糖中分子组10 1.12±0.5052.1**注与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；
由表1实验结果可以看出红景天多糖中分子注射制剂能显著抑制小鼠肝癌H22生长的作用，与对照组比较有显著性的差异(P＜0.01)。而红景天多糖小分子注射制剂与对照组比较对小鼠肝癌H22生长无抑制作用(P＞0.05)。
四、药理实施例本实验所用的红景天多糖均为分子量为20000-80000的多糖，由广东天之骄药物开发有限公司实验室提供。
1、在体内对小鼠脾细胞增殖的影响将30只BALB/C小鼠随机分成3组，每组10只。用药组腹腔注射红景天多糖(75mg/kg)，对照组注射生理盐水，连续注射10天。取脾制成2.5×106个细胞/ml悬液，于96孔平底细胞培养板每孔中加入上述细胞悬液200μl和20μl不同浓度的红景天多糖以及伴刀豆球蛋白(2.5mg/L)或细菌脂多糖(5mg/L)或RP MI1640液，孵育72h，收获前6h每孔加入1.85×104Bq3H-TdR，将细胞收集于49型滤纸上，测定每分种闪烁数(cpm)。方差齐性检验单因素方差分析t检验、相关系数、假设检验。统计分析采用STATA软件。
结果红景天多糖对脾细胞的直接活化作用在RP MI1640孔中，红景天多糖对脾细胞增殖有明显促进作用，表明单独应用红景天多糖具有丝裂原样活性。
在伴刀豆球蛋白或细菌脂多糖刺激下红景天多糖对脾细胞具有增殖作用。红景天多糖虽能促进静止状态的脾细胞活化，但远低于伴刀豆球蛋白或细菌脂多糖诱导淋巴细胞转化率。红景天多糖与伴刀豆球蛋白或细菌脂多糖合用，可显著增强脾细胞增殖作用。红景天多糖和伴刀豆球蛋白(或细菌脂多糖)复合效应与红景天多糖、伴刀豆球蛋白(或细菌脂多糖)单独效应之和的比值大于1，说明红景天多糖在体外可促进脾细胞对伴刀豆球蛋白和细菌脂多糖刺激的增殖作用。
2、红景天多糖的降血糖、降血脂作用动物昆明种小白鼠，体重20.0±2.0g，雌雄兼用。
药品四氧嘧啶为Sigma公司的产品。盐酸肾上腺素由北京市永康药业有限公司生产。
方法血糖含量测定用邻苯胺法，肝糖原含量测定用碘试剂法，血总脂含量测定用香草醛微量法。实验数据均经t检验处理，结果以X±SD表示。
结果2.1红景天多糖一次给药对小鼠血糖、肝糖原和血总脂含量的影响结果表明红景天多糖在所用剂量下对正常小白鼠血糖、肝糖原和血总脂均有明显降低作用，与对照组比较差异显著(P＜0.01)。
2.2红景天多糖多次给药对小鼠血糖、肝糖原和血总脂含量的影响结果表明小鼠多次注射红景天多糖后，同样引起血糖、肝糖原和血总脂含量降低。
2.3红景天多糖对肾上腺素所致高血糖小鼠血糖的影响小鼠60只，随机分为4组，正常组与模型组ip生理盐水10ml/kg，其余两组分别ip红景天多糖50，100mg/kg，每日1次，连续7日。待末次给药后20min，除正常对照组外，其余各组小鼠ip肾上腺素(Adrenaline，Adr)100μg/kg，于注射后15min，取血和肝，分别测血糖、肝糖原和血总脂。
结果表明红景天多糖可降低Adr引起的高血糖，增强Adr降解肝糖原作用。
2.4红景天多糖对葡萄糖所致高血糖小鼠血糖的影响小鼠90只，随机分为3组，第一、二组ip生理盐水10ml/kg，第三组ip红景天多糖100mg/kg，每日1次，连续7日，末次给药后，第二、三组小鼠ip葡萄糖2g/kg，第一组ip等体积生理盐水。分别于注射后2、30、60、120、240min取血和肝，测血糖、肝糖原和血总脂。
结果表明连续ip红景天多糖对葡萄糖引起的高血糖和肝糖原水平的增高均有明显的抑制作用，并能降低血总脂含量。
2.5红景天多糖对四氧嘧啶所致小鼠高血糖的影响小鼠60只，其中10只为对照组，其余50只分别ip四氧嘧啶80mg/kg，于中毒后第四日测血糖一次，将血糖在6.80-10.20mmol/L的小鼠45只，随机分为3组。于中毒后第4日，正常对照组和中毒对照组每日ip生理盐水10ml/kg，其余两组每日分别ip红景天多糖100，200mg/kg于中毒后第8日ip红景天多糖半小时后取血和肝，分别测血糖、肝糖原和血总脂。
结果表明连续ip红景天多糖可明显降低四氧嘧啶引起高血糖，其降糖作用强度随剂量增加而加强，同时也有降低肝糖原和血总脂作用。
总结实验结果表明，一次或多次ip红景天多糖对正常小鼠血糖和各种实验性高血糖均有降低作用，说明红景天多糖具有明显的降糖作用，其作用强度随剂量增加而加强。红景天多糖可降低葡萄糖引起的肝糖原增加和加强肾上腺素和四氧嘧啶对肝糖原的分解。同时红景天多糖对血总脂也有降低作用。
三、制备实施例实施例1(1)取高山红景天药材，粉碎，过40目筛，加14倍量水，浸泡半小时，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为60分钟，振荡频率为20kHz，提取4次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩成浸膏；(2)将上述浸膏加入40倍量80℃的水，搅拌，静置片刻，倾出上清液，减压浓缩至溶液∶药材为1∶1，加入95％乙醇使得含醇量为90％，静置24小时，过滤，沉淀备用；(3)将上述沉淀用30倍量水溶解，在搅拌下滴加1％鞣酸的同时加温，煮沸后离心除去沉淀物，继续加鞣酸至溶液不产生混浊，过已处理好的聚酰胺柱，用4倍的水洗脱，收集水洗液，用截留分子量为70000的超滤膜超滤，滤液再用截留分子量为20000的超滤膜超滤，收集未通过液，减压浓缩，干燥，即得红景天多糖；(4)称取上述红景天多糖20g，用注射用水溶解，用葡甲胺调节pH值为7.0，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成水针制剂1000支。
实施例2(1)取狭叶红景天药材，粉碎，过40目筛，加8倍量水，浸泡半小时，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为30分钟，振荡频率为80kHz，提取3次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩成浸膏；(2)将上述浸膏加入30倍量60℃的水，搅拌，静置片刻，倾出上清液，减压浓缩至溶液∶药材为1∶1，加入95％乙醇使得含醇量为70％，静置24小时，过滤，沉淀备用；(3)将上述沉淀用20倍量水溶解，在搅拌下滴加1％鞣酸的同时加温，煮沸后离心除去沉淀物，继续加鞣酸至溶液不产生混浊，过已处理好的聚酰胺柱，用8倍的水洗脱，收集水洗液，用截留分子量为80000的超滤膜超滤，滤液再用截留分子量为30000的超滤膜超滤，收集未通过液，减压浓缩，干燥，即得红景天多糖；(4)称取上述红景天多糖20g，用注射用水溶解，加入聚乙烯吡咯烷酮，用葡甲胺调节pH值为8.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂1000支。
实施例3(1)取大花红景天药材，粉碎，过40目筛，加10倍量水，浸泡半小时，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为50分钟，振荡频率为60kHz，提取3次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩成浸膏；
(2)将上述浸膏加入35倍量70℃的水，搅拌，静置片刻，倾出上清液，减压浓缩至溶液∶药材为1∶1，加入95％乙醇使得含醇量为80％，静置24小时，过滤，沉淀备用；(3)将上述沉淀用25倍量水溶解，在搅拌下滴加1％鞣酸的同时加温，煮沸后离心除去沉淀物，继续加鞣酸至溶液不产生混浊，过已处理好的聚酰胺柱，用6倍的水洗脱，收集水洗液，用截留分子量为75000的超滤膜超滤，滤液再用截留分子量为25000的超滤膜超滤，收集未通过液，减压浓缩，干燥，即得红景天多糖；(4)称取上述红景天多糖20g，用注射用水溶解，用葡甲胺调节pH值为7.5，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成水针制剂1000支。
实施例4(1)取大株红景天药材，粉碎，过40目筛，加12倍量水，浸泡半小时，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为45分钟，振荡频率为40kHz，提取4次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩成浸膏；(2)将上述浸膏加入37倍量75℃的水，搅拌，静置片刻，倾出上清液，减压浓缩至溶液∶药材为1∶1，加入95％乙醇使得含醇量为85％，静置24小时，过滤，沉淀备用；(3)将上述沉淀用22倍量水溶解，在搅拌下滴加1％鞣酸的同时加温，煮沸后离心除去沉淀物，继续加鞣酸至溶液不产生混浊，过已处理好的聚酰胺柱，用5倍的水洗脱，收集水洗液，用截留分子量为78000的超滤膜超滤，滤液再用截留分子量为23000的超滤膜超滤，收集未通过液，减压浓缩，干燥，即得红景天多糖；(4)称取上述红景天多糖20g，用注射用水溶解，加入果糖，用葡甲胺调节pH值为8.0，用0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂1000支。
实施例5
(1)取云南红景天药材，粉碎，过40目筛，加11倍量水，浸泡半小时，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为35分钟，振荡频率为30kHz，提取3次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩成浸膏；(2)将上述浸膏加入33倍量65℃的水，搅拌，静置片刻，倾出上清液，减压浓缩至溶液∶药材为1∶1，加入95％乙醇使得含醇量为75％，静置24小时，过滤，沉淀备用；(3)将上述沉淀用28倍量水溶解，在搅拌下滴加1％鞣酸的同时加温，煮沸后离心除去沉淀物，继续加鞣酸至溶液不产生混浊，过已处理好的聚酰胺柱，用7倍的水洗脱，收集水洗液，用截留分子量为73000的超滤膜超滤，滤液再用截留分子量为26000的超滤膜超滤，收集未通过液，减压浓缩，干燥，即得红景天多糖；(4)称取上述红景天多糖20g，用注射用水溶解，用葡甲胺调节pH值为7.3，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成水针制剂1000支。
实施例6(1)取西藏红景天药材，粉碎，过40目筛，加9倍量水，浸泡半小时，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为40分钟，振荡频率为50kHz，提取4次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩成浸膏；(2)将上述浸膏加入35倍量70℃的水，搅拌，静置片刻，倾出上清液，减压浓缩至溶液∶药材为1∶1，加入95％乙醇使得含醇量为82％，静置24小时，过滤，沉淀备用；(3)将上述沉淀用25倍量水溶解，在搅拌下滴加1％鞣酸的同时加温，煮沸后离心除去沉淀物，继续加鞣酸至溶液不产生混浊，过已处理好的聚酰胺柱，用6倍的水洗脱，收集水洗液，用截留分子量为75000的超滤膜超滤，滤液再用截留分子量为28000的超滤膜超滤，收集未通过液，减压浓缩，干燥，即得红景天多糖；
(4)称取上述红景天多糖20g，用注射用水溶解，加入葡萄糖，用葡甲胺调节pH值为8.2，用0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂1000支。
权利要求
1.红景天多糖注射制剂，其特征在于，它是由分子量20000-80000的多糖和水溶性注射用药用辅料制备而成的。
2.红景天多糖注射制剂的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤(1)取红景天药材，粉碎，过40目筛，加8-14倍量水，浸泡半小时，放入超声提取罐中，进行超声振荡提取，时间为30-60分钟，振荡频率为20-80kHz，提取3-4次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩成浸膏；(2)将上述浸膏加入30-40倍量60℃-80℃的水，搅拌，静置片刻，倾出上清液，减压浓缩至溶液∶药材为1∶1，加入95％乙醇使得含醇量达70％-90％，静置24小时，过滤，沉淀备用；(3)将上述沉淀用20-30倍量水溶解，在搅拌下滴加1％鞣酸的同时加温，煮沸后离心除去沉淀物，继续加鞣酸至溶液不产生混浊，过已处理好的聚酰胺柱，用4-8倍的水洗脱，收集水洗液，用截留分子量为70000-80000的超滤膜超滤，滤液再用截留分子量为20000-30000的超滤膜超滤，收集未通过液，减压浓缩，干燥，即得红景天多糖；(4)制剂的制备水针制剂的制备称取上述红景天多糖用注射用水溶解，用葡甲胺调pH值为7.5-8.0，用0.22μm微孔滤膜过滤，灭菌，制备成水针制剂。粉针制剂的制备称取上述红景天多糖用注射用水溶解，加入水溶性冻干赋形剂，用葡甲胺调pH值为7.5-8.0，用0.22μm微孔滤膜过滤，干燥，制备成粉针制剂。
3.根据权利要求1所述的红景天多糖注射制剂，具有提高免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤作用。
全文摘要
本发明属于中药制药技术领域，具体涉及红景天多糖注射制剂，它是由分子量20000－80000的红景天多糖和水溶性注射用药用辅料制备而成的。本发明还涉及上述粉针剂的制备方法。实验结果证明，本发明制备方法得到的红景天多糖具有提高免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤作用。
文档编号A61K31/715GK1686157SQ20051005677
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月25日 优先权日2005年3月25日
发明者张海峰 申请人:张海峰