专利名称：聚肌胞复合物免疫佐剂及含有该佐剂的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新免疫佐剂及含有该佐剂的疫苗，特别是涉及一种聚肌胞复合物免疫佐剂及其应用。
免疫佐剂是一种能提高抗原免疫反应的因子。由于这种因子的作用是加强几乎所有T细胞依赖性抗原的免疫反应，所以免疫佐剂的作用是非特异性的。免疫佐剂又称免疫增强剂，除了能提高抗原的免疫效果外，也用于非特异性地提高机体抗细菌、真菌、病毒、寄生虫感染和肿瘤的能力。
众所周知，疫苗是人类防治病毒病最有力的武器。在现有技术中，由于各种遗传工程疫苗，合成多肽，亚单位疫苗以及一些小颗粒的全病毒灭活疫苗的免疫效果不好，通常都须用佐剂。目前国际上批准的人用佐剂只有铝佐剂。铝佐剂的缺点是不能刺激机体产生细胞免疫，也不能促进某些抗原的体液免疫以及其它一些弊病，因而远远满足不了实际需要(AnthonyD.Chinnah，et.alVaccine，Vol，10Issue8，1992.551)为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型的佐剂以及含有该佐剂的疫苗。这种新型佐剂安全稳定，能诱生干扰素，白细胞介素Ⅱ，并抑制病毒繁殖，提高疫苗的效价，显著提高机体IgM，IgG和中和抗体的产生。
本发明涉及含卡那霉素和钙离子的聚肌胞(Polyriboinosinic-polyribocytididylicacid(PIC)containingKamamycinandcalcium)做为免疫佐剂的应用。本文中以下将所述的含卡那霉素和钙离子的聚肌胞简称为PICKCa。
早在70年代国际上就已发现了PIC，双链聚肌胞具有很好的诱生干扰素作用，在此之后又发现了其衍生物，即含多聚赖氨酸和羧甲基纤维素的聚肌胞(PICcontainingpolyL-LysinandCarboxymethycellulose，PICLC)。但是PIC不能用于灵长类从上的动物包括人体而PICLC的毒性太大也不能用于人体。于是人们继续研究终于发现了PICKCa，这种药品只是用于对某些病毒病的治疗。本领域技术人员熟知感染和发病是完全不同两个概念。PICKCa的发现是用于病毒感染后，并且确诊患上病毒病时才使用。而且就PICKCa对病毒病的治疗效果也不尽人意。特别应当指出的是至今为止没有任何资料报道将该已知的药品做为免疫佐剂来加以使用。
PICKCa的用量是公知，因此通常每支疫苗中，可加入1～2mgPICKCa，其它按不同疫苗的要求进行免疫注射。因此，本发明对PICKCa的用量不加以进一部的说明。
本发明涉及的佐剂PICKCa具有如下有益的效果1、PICKCa同病毒抗原或灭活疫苗结合后能显著地提高该抗原或疫苗的免疫效果，即具有显著的免疫佐剂的作用。
2、由于PICKCa本身在人体上已经使用，使得PICKCa很容易地被人们接受，并替带目前使用的铝佐剂而独树一帜，成为很有前途的新的佐剂。
3、单独PICKCa用于病毒性疾病感染的潜伏期具有显著的抗病毒效果。
4、PICKCa与病毒抗原或灭活疫苗结合后，用于病毒感染潜伏期的治疗较单纯应用PICKCa又进一步增加了治疗效果。
由于免疫佐剂的非特异性，PICKCa将在病毒、细菌、寄生虫感染治和抗肿瘤中产生重要作用;特别是将对多种疫苗产生显著的免疫佐剂作用。本文所涉及的疫苗包括人用狂犬病疫苗，流行性出血热疫苗，但并不限制于此。
图表说明表1PICKCa诱生干扰素的测定。
表2PICKCa诱生白胞胞介素Ⅱ的测定。
表3用PICKCa来诱生小鼠体内IgG和中和抗体的测定。
表4PICKCa降低感染狂犬病病毒小白鼠的死亡率。
表5PICKCa与狂犬病毒抗原结合后，免疫OF1小鼠，在不同时间分离血清检测其IgM、IgG和中和抗体的结果。
表6，表7PICKCa促进疫苗效价的结果。
表8说明PICKCa与狂犬病素抗原结合后，进一步降低感染狂犬病毒小白鼠的死亡率结果。表9对于PICKCa和疫苗结合后安全性的检测。
表10所示PICKCa促进流行性出血热灭活疫苗抗体的产生情况。
为了进一步理解本发明，以下将结合实施例详细说明本发明的实质。下述的实施例并非意在限定本发明，只是帮助人们理解本发明。
实验例1PICKCa诱生干扰素。取OF1小鼠20只肌注PICKCa，每只0.05～0.1mg。在不同时间分离小鼠血清，通过抑制VSV病毒在L929细胞产生的病变，然后通过显色法测定血清干扰素的产生情况。测定方法见MossmanT.，RapidColormetricassayforcellulargrowthandSurvivalapplicationtoproliferationandcytotoxieiktyassays.J.Immun.Meth1983，65∶55-63。
该试验的结果见表1。
该试验结果表明PICKCa能诱生高滴度干扰素，并在注射2小时即可达到高峰。
实验例2本实验为PICKCa诱生白细胞介素Ⅱ(IL-2)及其测定。取C3H小鼠，用抗原，即灭活提纯狂犬病毒(IPRV)和PICKCa免疫小鼠。每只腹腔注射0.1ml。取小鼠脾脏，用3H标记CTLL细胞法测定IL-2。该方法见Joffret ML，et al.Appraisal of Rabies Vaccine Potency by Determination of In vitro，Specific Interleukin-2 Production.Biologicals，1991.19(2)113-123。
说试验的结果见表2。表明PICKCa能够非特异性地提高IL-2产量。
实验例3A/J小鼠用活的狂犬病毒野毒株RD9147感染后，用PICKCa治疗，用ELISA法(PerrinP.TTechniguesforthepreparationofreabiesconjugatesinLaboratorytechniquesinrabies(4th，edittion)WHO或RFFIT方法(SmithJ.Arapidreproduciblefestfordeterminingrabiesneutralizingantibody。Bull。WldhithOrg.1973.48535-541)测定小鼠体内狂犬病毒IgG和中和抗体的滴度。每只小鼠体内狂犬病毒株0.1ml，然后在5小时，3天和7天各肌注PICKCa0.05ml/只，并于不同时间抽血检测IgG和中和抗体的滴度，其结果见表3。
结果表明小鼠在受到RD9147感染后，用PICKCa治疗其IgG和中和抗体的滴度大大降低。表明由于PICKCa显著抑制了病毒的繁殖、而使之不能刺激机体产生抗体。
实验例4PICKCa降低感染狂犬病小白鼠的死亡率。
将40只OF1小鼠随机分成4组，每组10人，用狂犬病野毒株RD4077感小鼠，每只0.1ml感染后的6小时，第3.7，14和18天用PICKCa治疗，每只0.05ml，肌注，观察小鼠的死亡率;其结果见表4。
该结果说明PICKCa在狂犬病毒感染的潜伏期，能够极其显著地降低小白鼠的死亡率。
实验例5PICKCa同狂犬病毒疫苗结合后的安全性测定。选用2组狂犬病毒疫苗分别加入PICKCa，分别对小鼠进行脑内和腹腔注射，观察其死亡情况。
结果(见表9)表明安全。本试验按“中国药典”急性毒性试验测量方法进行。
实施例1OF1小鼠46只随机分成4组。本试验是PICKCa与狂犬病毒抗原结合后，即制成疫苗，免疫OF1小鼠，以该抗原组和抗原加铝佐剂组以及空白为对照，在不同的时间分离小鼠血清检测IgM，IgG和中和抗体。其结果是表5。
本试验中IgG和中和抗体的测定方法同实验例3中所用的方法相同，IgM测定法是ELISA法测定。
该结果显示抗原+PICKCa组能刺激机体提前和提高产生IgM，IgG，特别是中和抗体，而铝佐剂却使抗体产生置后，说明以PICKCa为佐剂，其效果大大地高于Al2O3的佐剂效果。
实施例2.3PICKCa促进疫苗的效价。
如表6所示，用NIH法WHOLaboratorytechniquesinrabies(3thedition)1973检测，PICKCa可降低使用半数有效抗原量(ED50)5-10倍，而铝佐剂仅降低1-2倍。
如表7表示，用NIH法测定PICKCa对人用狂犬病疫苗的佐剂效果。表明PICKCa可显著提高人用狂犬疫苗的效力(国际单位)，使之均可从不合格而达到国际标准以上(2.5国际单位)。
实施例4PICKCa与狂犬病毒抗原结合后，肮注小白鼠又进一步降低感染狂犬毒小白鼠的死亡率。
本试验的目的是当小鼠用野毒株感染后观察PICKCa或Al2O3同灭活提纯狂犬病毒结合后，对小鼠的保护作用。
如表8所示PICKCa与狂犬病疫苗结合后治疗感染了狂犬病野毒株的小白鼠，较单纯用PICKCa治疗，又进一步降低了小白鼠的死亡率，单纯灭活疫苗治疗效果微乎其微，而加入铝佐剂则完全不起作用。
实施例5PICKCa促进流行性出血热灭活疫苗抗体的产生本试验采用Al(OH)做对照。PICKCa与出血热灭活疫苗等量混合后，肌注实验家兔，1ml/只，隔周一次，在第14和21天抽血，用ELISA和RPHI检测抗体产生情况。
其结果见表10。表明PICKCa促进流行性出血热疫苗ELISA抗体效价4-8倍，RPHI抗体2倍，而铝佐剂仅分别为0～4倍，对RPHI抗体反而降低。
表1PICACa诱生小鼠干扰素的测定时间(小时) 注射后干扰素滴度(国际单位×10-3)PICKCa0<51<52320324456<5
表2用PICKCa和灭活提纯狂犬病毒(IPRV)免疫小鼠诱生白细胞介素-2的测定免疫PICKCa注射(μg)体外刺激IL-2的测定(cpm×10-8)培养液IPRVPICKCaPBS*01.11.10.9PBS750.50.60.91PRV00.613.92.71PRV753.715.72.0(0)**(12.0)**＊PBS磷酸盐酸缓冲液＊＊与培养液IL-2的差值表3用ELISA或RFFIT法测定RD9147狂犬病野毒株感染后，并且PICKCa处理后A/J小鼠体内狂犬病IgG和中和抗体的滴度不同日期感染后PICKCaELISA测RFFIT测中和感染鼠的血清治疗时间IgG的滴度抗体的滴度(MIU/ml)(IU/ml)RD91473天//0.28RD91473天第7小时/<0.28RD91478天/25281.60RD91478天第5小时,<224<0.25第3天和7天RD914715天/115203.38RD914715天第3小时,第3120<0.283,7,1014天PBS15天/68<0.28表明PICKCa显著抑制了狂犬病毒在小鼠体内的繁殖。
表4PICKCa降低用RD4077狂犬病野毒株感染的OF1小鼠死亡率组RD4077死亡率潜伏期(天)稀释度PICKCa纯4/1017,18,20,2210-10/10对照组纯10/1010,11,12,13,14,13,13,17,17,1710-110/10 11 13,14,14,17,17,17,19,
表5 用狂犬病毒抗原(V427)或同该抗原结合的PICKCa或者Al2O3免疫OF1小鼠，测定其狂犬病IgM，IgG和中和抗体的滴度免疫血清IgM滴度IgG滴度中和抗体滴度ELISA法ELISA法RFFIT法IU/mlAU/mlMIU/ml第4天Ag180870.25Ag+PICKCa4132641.01Ag+Al2O3231 97 <0.13第7天Ag61515221.01Ag+PICKCa>160041666.65Ag+Al2O3169 351 0.43第14天Ag47949002.54Ag+PICKa5222632017.24Ag+Al2O3408 12000 11.97
第30天Ag10718003.01Ag+PICKCa1501360015.63Ag+Al2O3190 4000 6.86第60天Ag11750002.10Ag+PICKCa1501880015.96Ag+Al2O398 6000 7.64空白对照1640-
表6 用NIH试验测定注射PICKCa或Al2O3后的小鼠对灭活狂犬病毒的保护作用佐剂注射剂量(μg)注射日期半数有效量07无00221PICKCa1001002280080040Al2O33000 3000 9310001000132
表7用NIH试验测定PICKCa对人用狂犬病疫苗的激刺效价编号试验组ED50效价CVSLD50疫苗81163+PICKCa4℃下4周2.184.33IU/2ml5137℃下4周1.962.64IU/2ml5疫苗891634℃下4周1.801.82IU/2ml537℃下4周1.711.48IU/2ml5参照品84-52.534.9IU/安瓶5疫苗890842+PICKCa4℃下4周1.994.58IU/2ml5237℃下4周1.742.60IU/2ml5疫苗8908424℃下4周1.531.58IU/2ml5
参照品84-52.324.9IU/安瓶5参照品84-5+PICKCa2.4914.1IU/安瓶32参照品84-52.034.9IU/安瓶32
表8 PICKCa，Al2O3及其与狂犬病毒抗原结合后，对感染狂犬病毒小鼠的治疗效果用IPRV治疗后(注射量μg)的死亡率其它治疗0140560无95(19/20)*95(19/20)20(7/10)PICKCa30(3/10)95(19/20)70(7/10)Al2O3100(10/10) 95(19/20) 70(7/10)＊.小鼠死亡数/感染狂犬病毒小鼠数表9狂犬病疫苗与PICKCa结合后对18克体重的小白鼠安全性测定实验组数组别0.03mli.c0.5mli.p1疫苗89163存活率2/2存活率5/5+PICKCa2疫苗89163存活率2/2存活率5/5+PICKCa
表10PICKCa或铝佐剂在家兔体内对流行性出血热疫苗抗体测定兔号免疫组别14天血清21天血清ELISARPHIELISaRPHI1 疫苗+Al(OH)32048 / 2048 /+PICKCa2 疫苗+Al(OH)3+PICKCa2048/1024/3疫苗+PICKCa4096324096324疫苗+PICKCa4096324096325 疫苗Al(OH)31024 / 512 86 疫苗Al(OH)32048 / 1024 87疫苗51216512168疫苗5121651216
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权利要求
1.含卡那霉素和钙离子的聚肌胞(PICKCa)做为免疫佐剂的应用。
2.含卡那霉素和钙离子的聚肌胞(PICKCa)佐剂疫苗。
3.含卡那霉素和钙离子的聚肌胞(PICKCa)做为免疫增强剂的应用。
4.如权利要求2和3所述的应用，其特征在于所述的应用是指含卡那霉素的钙离子的聚肌胞(PICKCa)在哺乳动物或人在病毒感染期的应用。
5.如权利要求2所述的疫苗，其特征在于所述疫苗在哺乳动物或人在病毒感染期的应用。
全文摘要
本发明涉及一种含卡那霉素和钙离子的聚肌胞(PICKCa)做为免疫佐剂或增强剂的应用特别是涉及含PICKCa的疫苗及将PICKCa应用于哺乳动物或人的病毒感染期。
文档编号A61K39/39GK1095951SQ9310586
公开日1994年12月7日 申请日期1993年5月31日 优先权日1993年5月31日
发明者林海祥 申请人:林海祥