专利名称：一种肝癌细胞的抑制剂及其在抑制肿瘤生长方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤细胞的抑制剂，特别一种肝癌细胞抑制剂及其在抑制肿瘤生长方面的应用。
背景技术：
肝癌(HCC)是世界范围内排列第五位的最常见的恶性肿瘤，而由于其对化疗的耐受以及手术后极高的复发和转移特性使其成为致死率第三的恶性肿瘤。近年来越来越多的研究证明，HCC的发生可能起源于一群具有干性的细胞亚群，这群细胞被称为肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells, TICs)或是肿瘤干细胞(cancer stem cells)。这群细胞表达特定的表面标记，具有自我更新、分化、形成肿瘤以及化疗耐受的特性。虽然，目前索拉菲尼(sorafenib)已经用于靶向治疗HCC，但是其对肿瘤的抑制作用以及肝癌病人的存活率并不是很好。因此，如果采用能够抑制TICs的治疗策略可能是靶向治疗HCC的有效手段。 过氧化物酶体增殖物激活受体Y (peroxisome proliferator-activatedreceptor y，PPAR y )即PPARy激动剂是核受体超家族中的一类配体依赖性的核转录因子。PPARy激动剂主要包括内源性的配体15d_PGJ2以及人工合成的抗糖尿病药物噻唑烧二酮类家族成员，如罗格列酮(rosiglitazone)、曲格列酮(troglitazone)、环格列酮(ciglitazone)、卩比格列酮(pioglitazone)以及恩格列酮(englitazone)。配体活化 PPAR Y后，诱导靶基因的表达进而调控一系列的生理学进程，例如代谢、细胞分化、凋亡以及组织
炎症等。PPARy激动剂在不同的肿瘤细胞中也被报道能够抑制细胞增殖、诱导凋亡及分化。更有研究表明，在HCC的肿瘤组织中，尤其是在低分化的肿瘤组织中PPAR γ的表达明显受到抑制，而且PPAR Y激动剂可抑制HCC的形成、侵袭及转移。AKT是维持正常生命活动的重要信号传导分子，其持续活化与肿瘤的发生发展密切相关，是一重要的癌基因。同时，AKT的异常活化是肝癌复发和预后不良的一种危险因素。抑制AKT的活性可抑制肿瘤细胞的生长。然而，迄今为止，联合PPAR Y激动剂与AKT抑制剂能否有效地靶向肝肿瘤起始细胞从而抑制肿瘤生长仍然不是很清楚。

发明内容
本发明的目的就是为了研究上述的PPAR Y激动剂与AKT抑制剂联合能否有效地靶向肝肿瘤起始细胞从而抑制肿瘤生长等技术问题，最终提供一种肝癌细胞的抑制剂及其在抑制肿瘤生长方面的应用。本发明的技术原理
在人肝癌细胞系中PPAR Y激动剂通过N0X2诱导产生的活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)有效地抑制HCC细胞的干性表型；然而，ROS的上调引起AKT的高度活化，活化的AKT又以负反馈的形式调控ROS的水平，进而影响PPAR Y激动剂对HCC细胞的干性表型的调节。因此，PPARy激动剂罗格列酮及AKT抑制剂曲西立滨(triciribine)联合在体内呈现出对肿瘤生长抑制的协同作用，并能抑制肿瘤组织中细胞的干性表型。由PPARy激动剂与AKT抑制剂组成的一种新的肝癌细胞抑制剂的治疗策略有望用于临床治疗肝癌。本发明的技术方案
一种肝癌细胞的抑制剂，包括PPAR Y激动剂和AKT抑制剂；
所述的PPARy激动剂优选为罗格列酮或15d-PGJ2 ；
所述的AKT抑制剂优选为曲西立滨；
通过针对皮下接种GFP+ Huh7细胞的BALB/C雄性裸鼠的试验表明，所述的肝癌细胞 的抑制剂中，按质量比计算，PPARY激动剂罗格列酮AKT抑制剂曲西立滨为100 1 ；
通过对肝癌细胞Huh7的实验结果表明，所述的肝癌细胞的抑制剂中，按质量摩尔比计算，PPAR Y激动剂15d-PGJ2 :AKT抑制剂曲西立滨为Ig :20-100 μ mol。上述的一种肝癌细胞的抑制剂在抑制肝癌细胞生长方面的应用。本发明的有益效果
本发明的一种肝癌细胞的抑制剂，由于含有PPAR Y激动剂罗格列酮或15d-PGJ2和AKT抑制剂曲西立滨，针对人肝癌细胞系特别是Huh7的实验研究表明，PPAR Y激动剂罗格列酮和AKT抑制剂曲西立滨或PPAR Y激动剂15d-PGJ2和AKT抑制剂曲西立滨组成的肝癌细胞的抑制剂均可以协同抑制HCC细胞的干性表型，从而抑制肝癌细胞的生长。进一步，通过针对皮下接种GFP+ Huh7细胞的BALB/C雄性裸鼠试验，可以得出PPARy激动剂罗格列酮和AKT抑制剂曲西立滨序贯联合给药达到了协同抑制肿瘤生长的作用，并且比单独PPAR γ激动剂在抑制肿瘤生长方面的抑制率增加42%、比单独AKT抑制剂在抑制肿瘤生长方面的抑制率增加30. 5%。


图1A、PPAR Y激动剂15d_PGJ2和自由基清除剂NAC分别处理Huh7及SK-Ifepl细胞后，细胞内的ROS含量变化统计图(*，/X0. 05;#，/X0. Olvs对照组)；
图1B、PPAR Y激动剂15d-PGJ2分别处理Huh7和SK-H印I细胞后，N0X2表达量的示意
图1C1、添加自由基清除剂NAC后，PPAR Y激动剂15d_PGJ2处理Huh7细胞后，AKT及磷酸化AKT表达量示意 图1C2、添加自由基清除剂NAC后，PPAR Y激动剂罗格列酮处理Huh7细胞后，AKT及磷酸化AKT表达量示意 图ID、AKT抑制剂曲西立滨处理Huh7细胞后，N0X2、AKT及磷酸化AKT表达量的示意
图IE、PPAR Y激动剂15d-PGJ2与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，ROS表达量变化的统计图(*,/^<0. 05;**，7X0. 01)；
图2A1、PPAR Y激动剂15d-PGJ2与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，细胞凋亡情况的统计图(七/XO. 05)；
图2A2、PPAR Y激动剂罗格列酮与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，细胞凋亡情况的统计 图2B、PPAR Y激动剂15d-PGJ2与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，细胞成球能力的统计图，图中· >=100 μ m表示肿瘤细胞球的直径大于等于ΙΟΟμπι，^ 50-100μπι表示肿瘤细胞球的直径大于50 μ m而小于100 μ m ;
图2C、PPAR Y激动剂15d-PGJ2与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，⑶133+细胞数的统计图(*，P < 0.05; **，P < 0.01)；
图2D、PPARy激动剂罗格列酮与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，⑶133+细胞数的统计图(*，P < O. 05)； 图3A、实施例3中的罗格列酮处理组、曲西立滨处理组以及序贯联合给药方案示意图； 图3B、随时间变化，不同给药方式对小鼠皮下荷瘤体积大小的影响；
图3C、不同给药方式对小鼠皮下荷瘤所形成的肿瘤的重量的影响；
图3D、不同给药方式对小鼠皮下荷瘤所形成的肿瘤组织中CD133+细胞所占比例的统计图(*,7X0· 05;**,^. 01)。
具体实施例方式下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。本发明所用的材料 细胞系及实验动物
人肝癌细胞系Huh7细胞购自日本Riken Cell Bank, SK-Hepl细胞购自American TypeCulture Collection (ATCC)。6 8周龄雄性BALB/C裸鼠，购自上海必凯实验动物有限责任公司，饲养于华东师范大学动物房。小鼠置于恒温(25-27° C)、恒湿(45-50%)、无特殊病原菌(SPF级)环境下饲养，灭菌处理的水和饲料供动物自由摄入。主要试剂
I公司
DMEM/F121:1 培养液_GIBCO_
面糖DMEM培养液GIBCO
~25% 胰酶 +0. 02% 乙二胺四乙酸(EDTA) GIBCO
15d-PGJ2Sigma 和 CaymanChemical
7-AADSigma
FITC-AnnexinVBD
B27GIBCQ
BCA蛋白定量试齐盒_Thermo_
bFGFR&D
DHEInvitrogen
ECL发光试齐盒_Thermo_
EGFR&D
MTTSigma
NACCalbiochem
Penstrep 双抗GIBCO
RNAisoPlusTaKaRa
siRNASigma
SYBRPremixExTaq TaKaRa
DNaseIRoche
权利要求
1.一种肝癌细胞的抑制剂，包括PPAR Y激动剂，其特征在于所述的肝癌细胞抑制剂还包括AKT抑制剂。
2.如权利要求I所述的一种肝癌细胞的抑制剂，其特征在于所述的PPARY激动剂为罗格列酮或15d-PGJ2。
3.如权利要求2所述的一种肝癌细胞的抑制剂，其特征在于所述的AKT抑制剂为曲西兄浜。
4.如权利要求3所述的一种肝癌细胞的抑制剂，其特征在于按质量比计算，即PPARy激动剂罗格列酮=AKT抑制剂曲西立滨为100 :1。
5.如权利要求3所述的一种肝癌细胞的抑制剂，其特征在于按质量摩尔比计算，SPPPARy激动剂15d-PGJ2 :AKT抑制剂曲西立滨为Ig :20-100 μ mol。
6.如权利要求1、2、3、4或5所述的一种肝癌细胞的抑制剂在抑制肝癌细胞生长中的应用。
全文摘要
本发明公开一种肝癌细胞的抑制剂。所述的一种肝癌细胞的抑制剂包括PPARγ激动剂与AKT抑制剂曲西立滨，所述的PPARγ激动剂为罗格列酮或15d-PGJ2，其中PPARγ激动剂罗格列酮AKT抑制剂曲西立滨按质量比计算为100∶1；PPARγ激动剂15d-PGJ2AKT抑制剂曲西立滨按质量摩尔比计算为1g∶20-100μmol。本发明的一种肝癌细胞抑制剂，能有效地抑制HCC肿瘤起始细胞亚群以及有效地抑制肿瘤生长，为临床治疗HCC提供了可能的有效治疗策略。
文档编号A61K31/7064GK102940884SQ20121046498
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者刘永忠, 刘兰兰, 杨兆娟 申请人:上海市肿瘤研究所