专利名称：一种具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取法，具体涉及一种具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
芡实始载于《神农本草经》，列为上品，又名鸡头子，历版《中国药典》均有记载，为睡莲科一年生水生草本植物芡的干燥成熟种仁，具有益肾固精，补脾止泻，祛湿止带的功效，主治梦遗、滑精，遗尿、尿频、脾虚久泻、白浊、带下，素有“水中人参”和“水中桂圆”的美誉，是传统的中药材和珍贵的天然补品。我国是世界上老龄化发展速度最快的国家之一，也是老龄人口最多的国家之一。
2005年底全国I %人口抽样显示，65岁以上人口占总人口数的7.7%，预测到2020年65岁以上老年人口将达11. 92%。衰老是一种复杂的生命现象，衰老时机体的各项机能均趋于下降，通常表现为一系列形体的老化及行为异常，如毛发脱落、皮肤松弛、老年斑堆积、思维判断能力减弱甚至痴呆等。因此，形体的老化及行为学考察通常被作为衰老模型制备成功的标志。目前有关衰老的学说很多，包括自由基学说、遗传程序学说、脂褐素累积学说、内分泌功能减退学说等，其中自由基损伤在衰老机制的研究中占有十分重要的地位。GSH-Px是机体一种抗氧化的重要酶，它特异地催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化物的还原反应，其作用在于阻断由过氧化物引发的自由基对机体的损害，保护细胞膜免受过氧化损伤。一氧化氮合成酶(NOS)在体内能催化NO生成，NO既是一种神经递质，也是一种极不稳定的强氧化剂，但脑内过多的NO沉积会发生细胞毒性反应，这可能与诱生型NOS的过表达有关。乙酰胆碱酯酶(AChE)是在胆碱能神经元的突触处水解神经递质乙酰胆碱(ACh)的酶，AChE含量的变化在一定程度上可体现胆碱能神经元的功能活性。中医药在抗氧化、抗衰老活性方面具有独体的优势，因此从中草药中寻找纯天然、抗氧化、抗衰老活性强的物质具有重要的意义。

发明内容
发明目的本发明的目的是为了解决现有技术的不足，从中药芡实中提取分离得到抗氧化、抗衰老活性强，不良反应低的提取物，本发明另一个目的是提供芡实提取物的制备方法和其应用。技术方案为了实现以上目的，本发明提供的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物，它是通过以下方法制备得到(I)取芡实药材，净选，去除杂质，置多功能提取罐内，加4至8倍量浓度为80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小时，合并提取液，过滤，得滤液，减压浓缩，蒸干，得芡实乙醇提取物，备用。
(2)取上述步骤(I)制备得到的芡实乙醇提取物，加水混悬后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，减压浓缩，蒸干，得芡实的乙酸乙酯或正丁醇提取物，备用；(3) 取步骤(2)制备得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔树脂柱，先分别用水和浓度为10%乙醇洗脱，再用浓度为50% 60%的乙醇洗脱，薄层色谱检识、收集50% 60%乙醇洗脱液、浓缩、减压干燥得到含有5，7，4'-三羟基二氢黄酮的芡实提取物。作为优选方案，以上所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物中5，7，4/ -三羟基二氢黄酮的百分含量为10%至20%。作为优选方案，以上所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物，其步骤(I)所述的提取方法为回流提取法；步骤(I)所述的提取溶剂乙醇的浓度为80%。本发明通过大量实验筛选提取方法和提取溶剂，实验结果表明，当提取溶剂为浓度为80%乙醇，在回流提取法下，芡实中抗氧化、抗衰老活性成分提取效率最高。本发明步骤(I)得到乙醇提取物，为了进一步提纯活性成分，本发明通过优选的溶剂进行萃取，通过大量实验筛选表明，采用乙酸乙酯或正丁醇进行萃取能够将芡实乙醇提取物中的抗氧化、抗衰老活性成分最大限度的分离出，将杂质去掉，从而保证药效，最大程度降低不良反应。本发明提供的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物的制备方法，其包括以下步骤(I)取芡实药材，净选，去除杂质，置多功能提取罐内，加4至8倍量浓度为80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小时，合并提取液，过滤，得滤液，减压浓缩，蒸干，得芡实乙醇提取物，备用。(2)取上述步骤(I)制备得到的芡实乙醇提取物，加水混悬后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，减压浓缩，蒸干，得芡实的乙酸乙酯或正丁醇提取物，备用；(3)取步骤(2)制备得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔树脂柱，先分别用水和浓度为10%乙醇洗脱，再用浓度为50% 60%的乙醇洗脱，薄层色谱检识、收集50% 60%乙醇洗脱液、浓缩、减压干燥得到含有5，7，4'-三羟基二氢黄酮的芡实提取物。作为优选方案，以上所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物的制备方法，步骤(I)所述的提取方法为回流提取法、提取溶剂乙醇的浓度为80%。作为优选方案，以上所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物的制备方法，步骤(3)所述的大孔吸附树脂为DlOl型大孔吸附树脂。本发明通过正交实验筛选不同极性不同型号的大孔树脂、不同浓度(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70% )的乙醇洗脱齐U，以抗氧化、抗衰老为药效评价指标，实验结果表明以非极性大孔吸附树脂DlOl型大孔吸附树脂除杂效果比较好，且实验结果表明浓度为10%的乙醇可以洗脱大部分极性稍大的杂质，而浓度为50%至60%的乙醇对抗氧化、抗衰老活性成分的洗脱能力最好，因此本发明经正交实验筛选结果确定出最佳的吸附材料为DlOl型大孔吸附树脂和最佳的洗脱剂为浓度为50%至60%的乙醇。作为优选方案，以上所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物的制备方法分离得到的芡实提取物，检测结构表明提取物中5，7，4'-三羟基二氢黄酮的百分含量为10%至 20%。本发明提供的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物药理实验结果表明具有很好的抗氧化、延缓衰老的功效，可以用于制备抗氧化、抗衰老保健品或用于制备抗缺血性损伤疾病药物。有益效果本发明提供的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物和现有技术相比具有以下优点I、本发明以抗氧化、抗衰老为评价指标，通过大量实验优选出最佳制备方法，分离得到的芡实提取物，活性成分含量高，杂质少，药效明显，在旷场、Morris水迷宫的实验结果证实，本发明提供的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物对亚急性衰老小鼠的学习记忆能力有很好的改善作用，对亚急性衰老小鼠的脾、肾脏器指数有明显提高作用，且可以提高亚急性衰老小鼠脑组织NOS、GSH-Px活力，降低AChE活力。2、本发明提供的芡实提取物能提高亚急性衰老小鼠脑组织GSH-Px的活力，并随 剂量的增高，酶活性有增加的趋势，显示出了良好的抗氧化作用，清除自由基和抗衰老作用。3、实验结果表明本发明提供的芡实提取物能够降低亚急性衰老小鼠脑组织中AChE的活力，从而可提高小鼠脑内ACh的含量，具有改善衰老引起的学习记忆功能下降的作用。4、D_半乳糖致衰老模型实验结果表明，本发明提供的芡实提取物能明显抑制海马神经细胞的凋亡，甚至达到或超过正常水平，进一步从病理学角度证明芡实提取物能改善D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力。本发明提供的芡实提取物，活性强，药效全面，且不良反应低，和现有技术相比取得了很好的技术效果。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I一种具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物，它通过以下方法制备得到(I)取芡实药材，净选，去除杂质，置多功能提取罐内，加8倍量浓度为80%的乙醇，回流提取3次，每次提取8小时，合并提取液，过滤，得滤液，减压浓缩，蒸干，得芡实乙醇提取物，备用。(2)取上述步骤(I)制备得到的芡实乙醇提取物，加水混悬后，用相同体积的乙酸乙酯萃取6次，得乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，蒸干，得芡实的乙酸乙酯提取物，备用；(3)取步骤⑵制备得到的乙酸乙酯提取物上DlOl型大孔吸附树脂，先分别用水和浓度为10%乙醇洗脱，再用浓度为50% 60%的乙醇洗脱，薄层色谱检识、收集50% 60%乙醇洗脱液、浓缩、减压干燥得到含有10% 5，7，4'-三羟基二氢黄酮的芡实提取物。实施例2一种具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物，它通过以下方法制备得到
(I)取芡实药材，净选，去除杂质，置多功能提取罐内，加6倍量浓度为80%的乙醇，回流提取3次，每次提取8小时，合并提取液，过滤，得滤液，减压浓缩，蒸干，得芡实乙醇提取物，备用。(2)取上述步骤(I)制备得到的芡实乙醇提取物，加水混悬后，用相同体积的正丁醇萃取6次，得正丁醇萃取液，减压浓缩，蒸干，得芡实的正丁醇提取物，备用；(3)取步骤(2)制备得到的正丁醇提取物上DlOl型大孔吸附树脂，先分别用水和浓度为10 %乙醇洗脱，再用浓度为50 % 60 %的乙醇洗脱，薄层色谱检识、收集50 % 60%乙醇洗脱液、浓缩、减压干燥得到含有20% 5，7，4'-三羟基二氢黄酮的芡实提取物。实施例3抗氧化、抗衰老实验I、实验材料
I. I试验药物芡实购于北京中葛绿元科技有限公司，批号110901 ;本发明实施例I和实施2制备得到的提取物。D-半乳糖，上海宝曼生物有限公司，批号110523。GSH_Px、N0S、AChE、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20120416。I. 2试验动物清洁级KM小鼠，由江苏大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK (苏)2009-0002 。I. 3实验仪器小鼠旷场装置，上海软隆科技发展有限公司。SLY-WMS型Morris水迷宫，北京硕林苑科技有限公司。FSH-2A可调高速电动匀浆机，金坛市金南仪器厂。LXJ-II B低速大容量多管离心机，南京晓晓仪器设备有限公司。Powerwave X340全波长酶标仪，美国Bio-Tek公司。2.实验方法2. I本发明中提取物对D-半乳糖所致小鼠亚急性衰老模型的作用取体重18 22g的雄性KM小鼠104只，随机分成8组，S卩正常对照组、D-半乳糖模型对照组、本发明芡实80%乙醇提取物高、低剂量组、本发明实施例I提取物高、低剂量组、本发明实施例2提取物高、低剂量组，每组15只小鼠，除正常对照组外，其余各组小鼠每日腹腔注射0. 5% D-半乳糖，0. lml/10g，连续注射6周，正常对照组腹腔注射等量的无菌生理盐水，同时开始给药，芡实80%乙醇提取物、实施例I提取物和实施例2提取物的高、低剂量组小鼠每日灌胃给药剂量分别为0. 5g/kg和0. 25g/kg ;正常对照组及模型对照组每日灌胃同体积的生理盐水。连续给药6周后，测定各组小鼠的自主活动情况，记录小鼠90秒内在旷场中央区和周边区的平均运行速度及跨格次数；然后采用水迷宫训练小鼠的学习记忆能力，记录其学习成绩，即2分钟内找到固定平台的潜伏期及撤离平台后，穿越原平台所在象限的次数；比较组间差异并进行统计学处理；实验最后，脱颈椎处死小鼠，记录小鼠的体重，取脾、肾称重，计算脏器指数。另取小鼠的脑组织匀浆后，测定脑组织中的GSH-Px、N0S、AChE的活性，比较组间差异并进行统计学处理。结合上述各项指标评述本发明中各提取物的作用效果。分离小鼠脑组织海马区，石蜡切片经染色后，光学显微镜下观察细胞染色情况。3.实验结果3. I本发明中提取物对D-半乳糖所致小鼠亚急性衰老模型的作用连续腹腔注射D-半乳糖6周后，除正常对照组外，各组小鼠肉眼可见皮毛无光泽且稀疏、行动较为迟缓、精神萎靡不振等现象，对小鼠的自主活动的影响见表I ;对小鼠水迷宫实验的影响见表2 ;对小鼠器官指数的影响见表3 ;对小鼠脑组织中各项生化指标的检验结果见表4。表I本发明提取物对亚急性衰老小鼠旷场实验的影响(j±SD, n=13)
权利要求
1.一种具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物，其特征在于，它通过以下方法制备得到 (1)取芡实药材，净选，去除杂质，置多功能提取罐内，加4至8倍量浓度为80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小时，合并提取液，过滤，得滤液，减压浓缩，蒸干，得芡实乙醇提取物，备用。
(2)取上述步骤(I)制备得到的芡实乙醇提取物，加水混悬后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，减压浓缩，蒸干，得芡实的乙酸乙酯或正丁醇提取物，备用； (3)取步骤(2)制备得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔树脂柱，先分别用水和浓度为10%乙醇洗脱，再用浓度为50% 60%的乙醇洗脱，薄层色谱检识、收集50% 60% 乙醇洗脱液、浓缩、减压干燥得到含有5，7，4'-三羟基二氢黄酮的芡实提取物。
2.根据权利要求I所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物，其特征在于，步骤(I)所述的提取方法为回流提取法。
3.根据权利要求I所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物，其特征在于，步骤(I)所述的提取溶剂乙醇的浓度为80%。
4.权利要求I所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)取芡实药材，净选，去除杂质，置多功能提取罐内，加4至8倍量浓度为80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小时，合并提取液，过滤，得滤液，减压浓缩，蒸干，得芡实乙醇提取物，备用。
(2)取上述步骤(I)制备得到的芡实乙醇提取物，加水混悬后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，减压浓缩，蒸干，得芡实的乙酸乙酯或正丁醇提取物，备用； (3)取步骤(2)制备得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔树脂柱，先分别用水和浓度为10 %乙醇洗脱，再用浓度为50 % 60 %的乙醇洗脱，薄层色谱检识、收集50 % 60 %乙醇洗脱液、浓缩、减压干燥得到含有5，7，4'-三羟基二氢黄酮的芡实提取物。
5.根据权利要求4所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述的提取方法为回流提取法、提取溶剂乙醇的浓度为80%。
6.根据权利要求4所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的大孔吸附树脂为DlOl型大孔吸附树脂。
7.根据权利要求4所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的芡实提取物中5，7，4'-三羟基二氢黄酮的百分含量为10至20%。
8.权利要求I至3任一项所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物在制备抗氧化、抗衰老保健品中的应用。
9.权利要求I至3任一项所述的具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物在制备防治缺血性损伤疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有抗氧化、延缓衰老作用的芡实提取物及其制备方法，本发明通过提取溶剂、提取方法、萃取方法、大孔树脂分离方法的系统优化，得到最佳的制备工艺，制备得到的芡实提取物，实验结果表明，本发明提供的芡实提取物能够明显提高亚急性衰老小鼠旷场实验中的活动能力和探究行为以及小鼠水迷宫测试中的学习成绩和记忆能力，且能明显提高小鼠的脾、肾脏器指数；并能升高脑组织中GSH-Px、NOS的活性及蛋白含量；降低脑组织AChE的活性；还能明显改善脑组织病理改变，具有很好的抗氧化、抗衰老的功效。
文档编号A61K36/62GK102793754SQ20121022604
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者吴启南, 周婧, 乐巍, 段金廒, 沈蓓 申请人:南京中医药大学