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预防或治疗猪链球菌病的复方抗生素组合物的制作方法
专利名称::预防或治疗猪链球菌病的复方抗生素组合物的制作方法
技术领域:
:本发明涉及一种治疗动物细菌感染的药物组合物,尤其涉及一种预防或治疗猪链球菌病的复方抗生素组合物,属于动物细菌病的防治领域。
背景技术:
:猪链球菌病是由多种不同群的致病性链球菌引起的动物和人类共患的一种多型传染病。因为猪链球菌的血清群众多,给其用疫苗的方法防制该病带来了困难,所以在临床上普遍釆用药物进行预防和治疗。抗菌药物广泛应用于临床,有效地控制了猪链球菌病,但与此同时细菌耐药性成为全球面临的严峻问题。现行的基于最小抑菌浓度(MIC)的治疗策略,是通过抗菌药物杀死或抑制猪链球菌敏感细菌,依赖宿主防御系统清除猪链球菌突变菌,从而达到控制感染,减少严重不良反应的目的。但从公共健康角度看,猪在反复使用抗菌药物后所产生的选择压力,使细菌中的突变亚群逐渐发展成为优势菌群,导致细菌发生不同水平的耐药。而这种耐药又迅速在细菌间传播,以致在全世界范围内播散,构成人类健康的严重威胁。这就迫切需要我们寻找新的治疗策略,在控制感染的同时防止细菌耐药的进一步发展。因此,如何合理使用及开发现有的抗菌药物,减少和延缓细菌耐药性的产生,就显得十分重要。基于美国学者Zhao等首先提出了关于防细菌耐药突变选4奪浓度(mutantpreventionconcentration,MPC)、突变选择窗(mutantselectionwindow,MSW)的新假说和新理论,为临床优化抗菌药物给药方案,限制耐药突变体选择性扩增提供了新思路。MPC是指抑制细菌耐药突变体被选择性富集扩增所需的最低抗菌药物浓度。MSW指MIC和MPC之间的浓度范围。选择指数(selectionindex,SI)是指MPC与MIC之比,用于比较抗菌药物选择耐药突变体的能力。SI可反映MSW的大小,指数越小,MSW越窄,产生耐药菌抹的可能性越小;反之,MSW越宽,越可能筛选出耐药菌抹。基于猪链球菌病的危害和防治现状,国内外均在寻找对猪链球菌高效的药物,通过筛选、研发高效的药物,用于免疫失败的猪群治疗就显得十分重要。现有的预防或治疗猪链球菌病的抗生素虽然具有疗效显著等优点,但大多不同程度的存在易出现耐药突变体,安全性差,毒副反应高等缺陷,有待改进。
发明内容本发明目的是克服现有技术的不足,提供一种新的预防或治疗猪链球菌病的复方抗生素组合物,该药物组合物可以在安全剂量下,既杀灭猪链球菌,又不至于出现耐药突变体,具有安全、毒副反应低,疗效显著等优点。本发明目的是通过以下技术方案来实现的一种治疗猪链球菌病的复方抗生素组合物,由治疗上有效量的盐酸林可霉素和石危酸庆大霉素组成;为了达到更好的预防或治疗效果,优选的,将盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素按照3:8的重量比例组成。庆大霉素又称正泰霉素,是放线菌属小单孢菌所产生的氨基糖苷类广谱抗生素,为繁殖期杀菌药,可阻止细菌细胞壁合成或损伤胞浆膜。对耐药性金葡球菌、绿脓杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、链球菌等敏感菌所引起的各种严重感染,如呼吸道、肠道、泌尿道、乳腺炎及皮肤、软组织等部位感染和败血症等;林可霉素又称洁霉素,由链丝菌变异菌林的发酵液中提取的林可胺类抗生素。临床上应用于革兰氏阳性菌引起的各种感染,特别适用于耐青霉素、红霉素菌林的感染或对青霉素过敏的患畜,如肺炎、蜂窝织炎、骨髓炎和败血症等疾病。本发明首先进行了盐酸林可霉素和石危酸庆大霉素联合应用后对猪链球菌的药敏试验,试验结果表明,盐酸林可霉素与硫酸庆大霉素合用对猪链球菌分离林具有协同或相加作用(占88.5°/。),联用后测得的MIC均有不同程度的降低,将二者合用可提高疗效、减少耐药发生和P争低毒副反应,其机制是由于两药通过不同途径阻断细菌蛋白合成,并使细胞膜缺损,达到快速抑菌杀菌作用。本发明还进行了盐酸林可霉素联合硫酸庆大霉素缩小猪链球菌耐药突变选择窗的试验,结果盐酸林可霉素,硫酸庆大霉素及二者合用对猪链球菌SS2的MIC分别是24tig/ml,26ug/ml,16iig/ml。试验结果表明盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素联合应用可以有效的降低单药对猪链球菌SS2的MIC,即两药合用具有协同作用。盐酸林可霉素、硫酸庆大霉素及盐酸林可霉素-硫酸庆大霉素合药的SI指数分别8、7.3和6.4,表明两药合用可以缩小盐酸林可霉素,硫酸庆大霉素对猪链球菌SS2的MSW,从而有效的防止耐药。其原因是由于当两种药物的浓度同时处于各自的MIC之上时,病原菌面临两种药物的选择压力,须同时发生两种耐药突变才能生长,抑制突变体选择富集的浓度较单药治疗时有所降低,从而导致病原菌的MSW縮小。这样在临床上,就不必保持抗菌药物浓度在其MPC之上来防止耐药产生。而是通过不同作用机制的抗菌药物联合应用,并同时保持在各自的MIC之上治疗感染,以降低毒副作用发生可能,达到抗菌药物在安全剂量下,既杀灭敏感菌,又不至于出现耐药突变体选择的理想效果。本发明药物组合物既能有效预防或治疗猪链球菌病,同时又具有减少和延缓猪链球菌耐药性产生的优点。本发明复方抗生素组合物可以按照常规的药物制剂方法制备成口服制剂(例如散剂)或注射剂。本发明复方抗生素组合物的用法和参考用量将本发明复方抗生素组合物按照10mg/kg肌肉注射发病猪只,每天2次,连续注射一周。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。试验例1盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素联合药敏试验一、试验材料1.细菌猪链球菌菌抹SS2,由美国CDC提供。26林猪链球菌为临床分离抹。2.培养基及仪器脑心浸液培养基、琼脂、结晶紫溶液、碘液、95%乙醇、沙黄溶液、0.9%生理盐水、甘油、EDTA、温箱、生物显樣M竟、震荡培养箱、离心才几、冰箱、麦氏比浊管、移液枪、Tip头、酒精灯、试管、平皿、96孔微量培养皿。3.抗菌药物盐酸林可霉素标准品;^琉酸庆大霉素标准品。以上药物用无菌蒸馏水配制使盐酸林可霉素浓度为128(mg/ml、硫酸庆大霉素浓度为1280化/ml的储备液,将盐酸盐酸林可霉素和硫酸硫酸庆大霉素按照3:8的重量比例混匀,-20°C保存。分装后-2(TC保存备用。二、试-睑方法1、单药药敏测定单药最低抑菌浓度(MinimumInhibitoryConcentration,MIC)测定采用微量肉汤稀释法,分别测定了26抹猪链球菌和1林质控菌抹对单药盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素的MIC值。具体方法如下(1)将猪链球菌分离林及标准抹的冻存菌林接种至脑心浸液琼脂平板,37°C孵育过夜。取菌落制成0.5麦氏管悬液,然后稀释为约5x106CFU/ml。(2)取冻存的抗菌药贮存液融化后,以脑心浸液培养基分别进行系列二倍稀释,依次加入无菌96孔微孔板每排1-11孔中,每孔100u1,药物浓度从512yg/ml至0.5yg/ml,最后一孔(第12孔)未加抗生素作为对照。(3)每孔加入菌悬液O.01ml,4吏菌终浓度约为5X105CFU/ml,混匀后盖好,于37。C孵育24h。(4)以肉眼观察,药物最低浓度孔无细菌生长者(细菌生长完全抑制),即为受试菌的MIC。读取菌抹的MIC前,应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好,质控菌株的MIC值是否处于质控范围。质控菌ATCC29213的MIC参考值盐酸林可霉素为0.5^g/ml,硫酸庆大霉素为l^g/ml。2、联合药敏试验采用微量棋盘稀释法。根据测得的每林菌的单药MIC值,确定联合药敏的药物浓度,用灭菌的脑心浸液培养基分别倍比稀释,抗菌药浓度4MIC、2MIC、1MIC、0.5MIC,各取50n1,交叉组合于微孔板孔中(如表1),使微孔板的每一列中加入相同浓度的盐酸林可霉素,硫酸庆大霉素浓度则依次为2MIC、MIC、0.5MIC、0.25MIC;在微孔板的每一行中,硫酸庆大霉素浓度相同,盐酸林可霉素浓度依次为2MIC、1MIC、0.5MIC、0.25MIC。每孔加入菌悬液0.Olml,混合均匀并盖好,于37。C孵育24h。细菌生长指标同单药药敏试验,无菌生长的最低药物浓度为联用时的MIC。表1不同浓度的盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素棋盘法组合方式<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>通过计算部分抑菌浓度指数(FractionalInhibitoryConcentration,FIC)判断联合用药的相互作用。FIC=联合用药时盐酸林可霉素的MIC/单独应用时盐酸林可霉素MIC+联合应用时硫酸庆大霉素的MIC/单独应用时碌u酸庆大霉素MIC,FIC指数《0.5,协同作用;0.5<FIC《1,累加作用;1〈FIC《2.0,无关作用;FIC>2.0,拮抗作用。两种抗菌药物联合,在体外或动物体内可表现为"无关"、"相加"、"协同"和"拮抗"四种作用,无关作用指联合应用后总的作用不超过联合用药中较强者,等于两者相加的总和称为相加作用,联合后的效果超过各药作用之和为协同作用,拮抗作用为联合用药的作用因相互发生抵消而减弱。三、试验结果盐酸林可霉素、硫酸庆大霉素及盐酸林可霉素、硫酸庆大霉素复方药物联合用药后药敏试验结果及FIC比例分别见表2、表3。由表2中可以看出,两药合用后,除三冲朱猪链球菌FIC>1.0,即两者联合对此三抹菌显示无关或拮抗作用(占11.5%)外,其余菌林MIC均有不同程度的降低,FIC《1,即将盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素合用对其余的23抹(88.5%)猪链球菌表现为协同或相加的作用。表226株猪链球菌联合药敏试验结果MIC(吗/ml)菌株编号单用LIN单用GEN合用LIN/GENFIC指数D216168/4T1351232128/4YBS316168/42-242563232/42-25321616/42-3532168/83-38164/4l代8164/204-1256256256/25604-3844/0.504-48162/404-5882/104-68162/804-7128128128/12804-8256128128/3204-9256128256/12804-11884/404-12442/2W-"8162/404-14884/404-158164/804-16482/10"S326416/3205-3884/105-3625664128/6405-37888/2MIC508164/4MIC90256128128/64ATCC292130.510.25/0.125LIN盐酸林可霉素,GEN硫酸庆大霉素;注FICSO.5为协同;0.5<FIC51为相加;1<FICS2.0为无关;FIC>2.0为拮抗;从表3中可看出联合后盐酸林可霉素的MICs。和MIC9。分别降为4"g/ml和6411g/ml,硫酸庆大霉素的MIC5。和MIC,。分别降为4!ig/ml和128ug/ral。表3硫酸庆大霉素、盐酸林可霉素复方药物对26株猪链球菌FIC比例FIC指数株数比例(%)SO.5623.1%0.5<FI凶1765.4%1<FIC^2.0311.5%FIC>2.0000.750.3750.750.250.750.750.750.62520.6250.50.3750.7520.75210.50.5110.62510.62510.75加同加同加加加加关加同同加关加关加同同加加加加加加加才甘才哲才木才才hK才甘甘杉hK才3木甘甘.lv木.Kr禾射射.K,以上试验结果表明,盐酸林可霉素与硫酸庆大霉素素合用对猪链球菌分离林具有协同或相加作用(占88.5%),联用后测得的MIC均有不同程度的降低,将二者合用可提高疗效、减少耐药发生和降低毒副反应,其机制是由于两药通过不同途径阻断细菌蛋白合成,并使细胞膜缺损,达到快速抑菌杀菌作用。因此,临床上治疗由猪链球菌引起的严重感染,可采用盐酸林可霉素与硫酸庆大霉素联合用药方案。试验例2盐酸林可霉素联合硫酸庆大霉素缩小猪链球菌耐药突变选择窗的试验一、试验材料1.细菌猪链球菌菌林SS2,由美国CDC提供。26抹猪链球菌为临床分离林。2.培养基及仪器脑心浸液培养基、琼脂、结晶紫溶液、碘液、95%乙醇、沙黄溶液、0.9°/。生理盐水、甘油、EDTA、温箱、生物显微镜、震荡培养箱、离心机、冰箱、麦氏比浊管、移液枪、Tip头、酒精灯、试管、平皿、96孔微量培养mr。3.抗菌药物盐酸林可霉素标准品;石克酸庆大霉素标准品。以上药物用无菌蒸馏水配制使盐酸林可霉素浓度为1280[xg/ml、碌u酸庆大霉素浓度为1280^g/ml的储备液,按照3:8的比例混匀,-20。C保存。分装后-2(TC保存备用。二、试验方法1、最低抑菌浓度测定釆用琼脂平板二倍稀释法用倍比稀释法配制盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素,浓度分别为0.002、0.004、0,008、0.016、0.031、0.063、0.125、0,25、0.5、1、2和化g/ml。取SS2放入2ml肉汤中,37。C过夜培养,先将菌液浓度调整为0.5麦氏单位(约1.5xl08cfu/ml),然后再将菌液浓度稀释L5xl06cfu/ml。分别取1.5xl06cfu/ml菌液IO吣接种于不同浓度的抗菌药物平板上,37。C培养18h后观察结果,以平板上无菌生长的最低药物浓度定为MIC。具体方法如下琼脂稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)(1)将保存在15。/。甘油肉汤中的菌林接种在琼脂平板上,置入37。C恒温培养箱中,孵育18-24小时。(2)准备抗生素MH平板:计算出所需抗生素平板的个数,x15ml推算出所需的MH培养基的量,配制MH培养基并高压灭菌。用倍比稀释法配制盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素,药物终浓度分别为0.002、0.004、0.008、0.016、0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1、2和化g/ml。(3)取SS2—个菌落放入2ml肉汤中,37。C过夜培养,先将菌液浓度调整为0.5麦氏单位约1.5xl08cfu/ml,然后再将菌液浓度稀释到1.5xl06cfu/ml。100pL均匀涂抹在每个含有倍比稀释的抗菌药物琼脂平板上,每个浓度4个平板。(4)将接种后的抗生素平板水平置入37。C恒温培养箱中孵育18—24小时后,读取抑制细菌生长的最小抗生素浓度,即为MIC。2、MIC"则定以抑制99°/接种细菌菌落生长的最低抗菌药物浓度定义为MIC99。采用琼脂平板稀释法测定药物对SS2的MIC99。参照zhao等报道的方法,以各药MIC为基准,线性递减(10%)抗菌药物浓度配制含药琼脂平板直至1/2MIC,药物平皿铺好后,4'C保存,一周内用完。采用肉汤法进^f亍细菌富集,将单个菌落^^妄种于2ml肉汤中,37'C过4复培养。比浊法将菌液浓度先调整为3.0xl08cfu/ml,再用肉汤10倍倍比稀释至3.0xl03cfu/ml。用微量加样器在每个含药平皿及无药平皿分别接种不同浓度菌液IOOML,37。C过夜培养,选择合适菌液浓度的点进行菌落计数。以药物浓度为横坐标,菌落恢复生长的比例为纵坐标绘制抗菌药物浓度一恢复生长菌落比例曲线,计算MICm。3、MPC测定采用琼脂平板稀释法测定抗菌药物对SS2的MPC。参照zhao等报道的方法,以各药MIC为基准,采用倍比稀释法配置抗菌药物平板,药物浓度从MIC到16[xg/ml,药物平板铺好后,4'C保存,一周内用完。细菌富集方法将细菌单个菌落接种于肉汤中,200次/min过夜震荡培养,菌液3000r/min离心后,弃上清,细菌再悬浮于10倍原肉汤中,200次/min震荡培养6h,菌液再次3000r/min离心后,弃上清,将菌液浓度调整为3.0x10"cfu/ml。分别取3.0x1(Tcfu/ml菌液100吣均匀涂抹在每个含有倍比稀释的抗菌药物琼脂平板上,每个浓度4个平板,每个药物浓度平板的细菌总接种量为1.2x101Qcfu。并通过菌落计数确保每个浓度平^l的^l妄种量〉10"cfu。于37。C孵育,以"h时没有菌落生长的最低药物浓度称为初测MPC(MPCpr)。测定MPCpr后,再以MPCpr为基准,依次递减(20W抗菌药物浓度重新配制含药琼脂平板,重复MPCpr测定时的细菌富集及接种,以72h时不出现菌落生长的最低药物浓度定为MPC。对接近MPC的药物浓度筛选出的菌抹再接种于无药平板上,传代2次后,再接种于原筛选浓度的抗菌药物平板上,确保所筛选出的菌抹为耐药突变抹,将耐药突变抹冻存备用。重复以上实验三次,以确保试验结果。三、试验结果盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素对猪链球菌SS2的MIC、MPC、MSW和SI结果见表4。表4硫酸庆大霉素、盐酸林可霉素复方药物对猪链球菌SS2MlCOg/ml)、MPC(Pg/ml)、MSWOg/ml)禾口SI抗菌药物MICMIC99MPCMPC/MIC(SI)盐酸林可霉素24201608硫酸庆大霉素26221607.3硫酸庆大霉素和盐4.3/11.7(林/庆)1017/47(林/庆)4/3.55酸林可霉素合药本试验结果显示,盐酸林可霉素,硫酸庆大霉素及二者合用对猪链球菌SS2的MIC分别是24,26,16ug/ml。表明盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素联合应用可以有效的P条低单药对猪链球菌SS2的MIC,即两药合用具有协同作用。盐酸林可霉素、硫酸庆大霉素及盐酸林可霉素-硫酸庆大霉素合药的SI指数分别8、7.3和6.4,表明两药合用可以缩小林霉素可,硫酸庆大霉素对猪链球菌SS2的MSW。从而有效的防止耐药。其原因是由于当两种药物的浓度同时处于各自的MIC之上时,病原菌面临两种药物的选择压力,须同时发生两种耐药突变才能生长,抑制突变体选择富集的浓度较单药治疗时有所降低,从而导致病原菌的MSW缩小。这样在临床上,就不必保持抗菌药物浓度在其MPC之上来防止耐药产生。而是通过不同作用机制的抗菌药物联合应用,并同时保持在各自的MIC之上治疗感染,以降低毒副作用发生可能,达到抗菌药物在安全剂量下,既杀灭敏感菌,又不至于出现耐药突变体选择的理想效果。权利要求1、一种预防或治疗猪链球菌病的复方抗生素组合物,其特征在于由治疗上有效量的盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素组成。2、按照权利要求l所述的复方抗生素组合物,其特征在于将盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素按照3:8的重量比例组成。3、按照权利要求1或2所述的复方抗生素组合物,其特征在于按照常规药物制剂方法制备成口服制剂或注射剂。4、权利要求1或2所述的复方抗生素组合物在制备预防或治疗猪链球菌病药物中的用途。全文摘要本发明公开了一种预防或治疗猪链球菌病的复方抗生素组合物,属于动物疾病的防治领域。该复方抗生素组合物由治疗上有效量的盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素组成。盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素通过不同途径阻断猪链球菌蛋白质的合成,并使猪链球菌细胞膜缺损,达到快速抑菌杀菌作用。本发明通过试验发现,将盐酸林可霉素和硫酸庆大霉素合用可显著提高治疗猪链球菌病的疗效,减少耐药发生和降低毒副反应,具有在安全剂量下既杀灭敏感菌,又不至于出现耐药突变体选择的效果。本发明复方抗生素组合物既能有效预防或治疗猪链球菌病,同时又具有减少和延缓猪链球菌耐药性产生的优点。文档编号A61K31/7042GK101543506SQ20091013764公开日2009年9月30日申请日期2009年4月29日优先权日2009年4月29日发明者洋刘,吴聪明,琳崔,阳崔,刚徐,李明雁,李晓芸,李艳华,江海洋,汤树生,沈建忠,敏王,肖希龙,栋边申请人:东北农业大学;中国农业大学
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- 专利名称:一种含巴旦杏提取物和银杏叶提取物的复方制剂的制作方法技术领域:本发明内容属于生化物品的制备技术领域,涉及一种以巴旦杏提取物和银杏叶提取物为原料制备的药物保健制剂。背景技术: 巴旦杏主产于我国新疆地区,为蔷薇科桃属植物巴旦木(Amy
- 一种颅内压监测仪的制作方法【专利摘要】本实用新型属于脑外科手术监测仪器【技术领域】,尤其涉及一种颅内压监测仪,引流管的引流端设有引流孔,引流管的引流端附近外部套有充气气囊一,引流导管外套有可沿引流管滑动的充气装置,引流管包括引流腔和测压腔,
- 专利名称:一种风寒感冒紫苏叶保健酒的制作方法技术领域:本发明涉及一种能防治风寒感冒的紫苏叶保健酒。背景技术:众所周知,风寒感冒是因风吹受凉而引起的感冒,秋冬季节发生较多。其症状为浑身酸痛、鼻塞流涕、咳嗽有痰。治疗上西药、中药皆可,亦可采用食
- 硬胶囊上胶封口机的可调式刮胶装置制造方法【专利摘要】本实用新型公开了一种应用于硬胶囊充填机的硬胶囊上胶封口机的可调式刮胶装置,包括上胶支架(1),在所述上胶支架上通过推杆(18)装有刮胶组件(35);所述刮胶组件包括刀架(16)、刀柄(12
- 一次性血氧线的制作方法【专利摘要】本实用新型涉及医疗器械配件及其耗材,公开了一种一次性血氧线,包括外护套,外护套内设有一内护套,内护套与外护套之间间隔设有多条外围芯线和至少一条填充线,内护套内设有至少一条内芯线,外护套的内壁设有一层外屏蔽层