专利名称：犬类精子超低温冷冻保存防冻液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种犬类精子超低温冷冻保存防冻液，用于犬类精子超低温冷冻保存以及利用冻精进行人工授精繁殖育种，属于动物繁殖技术领域。
背景技术：
犬作为最早驯养的家畜动物，在人类生产生活中发挥着特有的作用，优良种犬的社会需求更是与日俱增。我国犬的品种不仅以特有的使用和观赏价值著称于世界，而且对世界著名品种的形成产生过重要的影响，如西藏的马士迪夫(獒)、西施犬、北京犬、西藏拉萨犬(埃普索犬)等，作为珍贵犬的品种资源，已经成为世界人民的共同财富。我国城乡居民随着经济条件的改善，饲养宠物的人越来越多，人们已经意识到饲养宠物犬所带来的巨大经济效益，已把人工饲养宠物犬作为一种新兴饲养业来发展，宠物犬除了进入人类的物质生活外，逐渐进入人类的精神生活。目前国内各地区已经广泛开展了犬类的人工养殖，现有宠物犬上亿只。然而在犬类长期养殖过程中，由于饲养及人工繁殖的条件限制，特别是杂交育种技术的条件限制直接导致我国人工饲养的犬类品种质量退化，在国际宠物犬市场上逐渐失去竞争力，给养犬者造成了巨大的经济损失，严重阻碍我国犬类饲养业的发展。
在世界宠物犬市场中可以发现，名贵犬种正以其独特的身价、良好的开发前景逐渐被人们所接受，优质宠物犬将以它高品质受到更多人的青睐。随着人类饲养技术、繁殖水平的提高，宠物饲养种类越来越多。同我国饲养的犬类相比，国外犬类品种繁多、质量较高，尤其是新型品种价格昂贵。其主要原因是人工繁殖技术的应用，通过人工授精技术杂交改良原有自繁犬类品种，既能克服不同品种间自然交配难题，又能通过杂交优势培育出新型品系，产生良好的经济效益。因此，如何进一步保存、利用、开发我国的犬种资源，是一项非常重要的研究课题，深入开展此方面的研究工作，必将对我国的社会、经济、生活产生难以估量的积极作用。人工授精繁殖技术包括利用稀释后的鲜精液和解冻后的冻精输精两种方式，冷冻精液及其人工输精，将会大大提高良种公犬的利用率和利用价值，其中涉及到的关键性技术就是稀释液及防冻液的研制。研究表明，冻融精子的质量如何，例如活力、质膜完整率及顶体完整率的高低直接影响人工输精的受孕率。犬类精子与其它犬科动物的精子类似，其在冻融过程中对低温损伤的抗性较弱，冷冻复苏后精子活力下降，质膜完整率及顶体完整率亦明显降低，人工授精的受孕率及胎仔数均低于自然繁殖(Farstad，W.等，1996，Animal Reproduction Science.42251～260.)。因此，如何长期低温保存优质犬类精液并充分利用优良种源是目前本领域亟待解决的问题。
目前，犬类的人工授精尤其是精液的超低温冷冻保存及利用冻精繁殖很受人们的关注，但远未达到牛、羊等家畜动物水平，有关基础理论与技术环节尚需进一步研究探讨，其中防冻液的配制、冷冻及解冻程序是亟待解决的难题。国内外常用的防冻液配方有配方一三羟甲基胺基甲烷(2.4％)、柠檬酸(1.3％)、果糖(1％)甘油(6.4％)、卵黄(20％)、青霉素、链霉素各50万单位。用此配方制作冻精时，精子的平均复苏率为46.7％，冻融精子活力为0.28，精子复苏后的存活时间为3小时以上。(王力波等，黑龙江畜牧兽医，1991，535-36.)。
配方二三羟甲基胺基甲烷(240mM)、柠檬酸(63mM)、糖类(70mM)、甘油(8％v/v)、卵黄(20％v/v)、青霉素(10万IU)、蒸馏水定容100mL。用此配方制作冻精时，冻融精子平均活力为0.5，质膜完整率及顶体完整率分别为70％、45％(Yildiz et al，Thefiogenology，2000，54579-585)。
配方三三羟甲基胺基甲烷(2.4g)、柠檬酸(1.4g)、葡萄糖(0.8g)、甘油(4mL)、卵黄(20mL)、青霉素(0.06g)、蒸馏水定容100mL。用此配方制作冻精时，冻精复苏后体外39℃培养4小时平均活力为0.10，活率及顶体完整率分别为24.0％、49.4％；( et al，Theriogenology，1999，50163-174)。利用冻精人工输精繁殖的受孕率为84％。(Rota et al，Theriogenology，1999，511045-1058)。
氨基-钠-十二烷基硫酸酯Orvus ES Paste(OEP)是一种表面活性剂，其组成中含有十二烷基硫酸钠(SDS)复合物，是猪和犬类动物精液冷冻时常用的稀释防冻成分(Pursel et al，J.Anim.Sci.47198-202；Rota et al，Theriogenology，1999，511045-1058； et al，Theriogenology，1999，50163-174)，主要作用是防止低温对精子的损伤，对精子膜结构有保护、修补作用，能够提高冻融精子活力、存活率及质膜完整率(Tsutsui et al，J.Vet.Med.Sci，2000，62(5)533-538)。N-乙酰基-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)是几丁质的主要成分，存在于昆虫和甲壳动物的外骨骼中，属于多糖同聚物，在细胞外表层、细胞间隙及结缔组织形成时提供主要的结构成分，使动植物组织有弹性和韧性。研究报道N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过人体腹膜细胞和成纤维细胞能有效激活体内葡萄胺聚糖的合成(Breborowicz等，1998，Adv.Perit.Dial.14，31-35.)。另据报道，N-乙酰基-D-葡萄糖胺已成功应用于猪精液冷冻稀释液中(Yi等，2002，AnimalReproduction Science.74，187-194.)，但关于OEP和N-乙酰基-D-葡萄糖胺同用在犬类精液防冻剂方面的研究目前还没有报道。

发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种犬类精子超低温冷冻保存防冻液，使之能有效延长犬类冻融精子的存活时间，有利于维持犬类精子的质膜完整性及顶体完整性，提高犬类冻精繁殖的受孕率。
为实现这样的目的，本发明的犬类精子冷冻防冻液采用一种表面活性剂氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP)及细胞培养液成分N-乙酰基-D-葡萄糖胺，同时添加果糖、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、柠檬酸、卵黄、甘油或二甲基亚砜及杀菌剂，用蒸馏水配制而成。
本发明研制的犬类精子冷冻防冻液具体包含如下成分氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP) 0.05～2.50毫升N-乙酰基-D-葡萄糖胺 0.01～0.10克果糖0.45～3.10克柠檬酸 0.50～2.30克三羟甲基胺基甲烷1.10～3.90克卵黄15.0～30.0毫升甘油或二甲基亚砜2.0～8.0毫升杀菌剂 1000UI/毫升蒸馏水定容 100毫升。
防冻液pH值为6.25～6.95，渗透压为300-350mOsmo/L。
本发明所述杀菌剂可选择青霉素或庆大霉素，也可以为其他具有杀菌作用的抗生素。
优选的防冻液(1)含有如下成分氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP)0.50毫升N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.06克果糖 1.20克柠檬酸 1.65克三羟甲基胺基甲烷 3.15克卵黄 20.0毫升甘油 3.0毫升杀菌剂 1000UI/毫升蒸馏水定容100毫升。
防冻液pH值为6.65，渗透压为320mOsmo/L。
优选的防冻液(2)含有如下成分氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP)0.75毫升N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.05克果糖 1.65克柠檬酸 2.25克三羟甲基胺基甲烷 1.85克卵黄 20.0毫升二甲基亚砜 4.0毫升杀菌剂1000UI/毫升蒸馏水定容100毫升。
防冻液pH值为6.60，渗透压为325mOsmo/L。
本发明的精子冷冻防冻液可按本领域的常规方法配制，按所述含量分别加入上述成分，再加蒸馏水，配成100毫升溶液即可。配制成的稀释液pH值为6.25～6.95，渗透压为300～350mOsmo/L，可为犬类精子体外存活提供最佳基质条件。
本发明的精子冷冻防冻液中的果糖成分为精子在体外代谢的能量来源，三羟甲基胺基甲烷、柠檬酸可维持防冻液环境与精子内环境的渗透压平衡。此外，在本发明的防冻液中还加入青霉素或庆大霉素(1000UI/毫升)杀菌剂，提高该防冻液的常温及低温保存效果。
本发明使用由氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP)、N-乙酰基-D-葡萄糖胺等多种成分组成的防冻液，对犬类精子进行细管冻精试验，并用冻融精子进行人工授精，研究该防冻液对犬类冷冻精子存活时间及冻融精子质量的影响，结果表明由氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP)、N-乙酰基-D-葡萄糖胺等多种成分组成的防冻液，能有效延长犬类冻融精子的存活时间、保护冻融精子膜结构的完整性，表现出了良好的精子保护作用和防冻效果。
与现有技术相比，本发明的防冻液具有如下优点1、能够有效延长犬类冻融精子的存活时间，提高犬类冻融精子的质膜完整率及顶体完整率，提高人工授精的受孕率；2、该防冻液中所含的N-乙酰基-D-葡萄糖胺成分，能够有效促进氨基-钠-十二烷基硫酸酯的乳化功能，增强氨基-钠-十二烷基硫酸酯及卵黄的保护作用；3、配制简单，取材容易，成本价格低廉，易于推广。
本发明的犬类精液防冻液，适用于犬类细管冻精人工输精繁殖以及犬类精液超低温冷冻后的长期保存和长途运输后输精，它可明显提高犬类精子的生存指数，保持其授精活力。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例的作用应被理解为是对本发明的诠释而非对本发明的任何方式的限制。
实施例1(防冻液1)先称取0.06g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于10ml蒸馏水中，使其完全溶解。然后分别量取20mL卵黄、3mL甘油、0.50mL氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP)并将三者均匀混合。然后称取1.20g果糖溶于50ml蒸馏水中，待完全溶解后分别加入3.15g三羟甲基胺基甲烷、1.65g柠檬酸，按上述顺序逐一加入，添加时待先加入的试剂完全溶解后再加入后一种，溶解后把三种制剂相混合，然后加入10万单位青霉素或庆大霉素，最后蒸馏水定容100ml，定容后pH值为6.65，渗透压为320mOsmo/L，放入5℃冰箱保存。所有制备过程均在无菌条件下进行。该配方对犬类精液超低温冷冻保存时抗低温损伤的效果极佳。使用时按1∶3比例与犬类精液相混合，同时要保持防冻液的温度与待冷冻精液温度相同。
使用按实施例1方法制备的防冻液，应用与犬类精液超低温冷冻时，测定冷冻精子复苏后冻融精子的存活时间、精子活力(采用相差显微镜检测精子活力)、精子质膜完整率及顶体完整率(CTC-Hoechst 33258活体荧光染料联合染色法检测精子顶体完整率)。结果表明22℃条件下冻融精子的存活时间为58小时、保存4小时后冻融精子活力为0.22、精子质膜完整率平均为31％，顶体完整率为53％；利用该冻精(冷冻复苏后0.5小时)人工输精繁殖母犬受孕率为85.8％。
实施例2(防冻液2)先称取0.05g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于10ml蒸馏水中，使其完全溶解。然后分别量取20mL卵黄、4mL二甲基亚砜(DMSO)、0.75mL氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP)并将三者均匀混合。然后称取1.65g果糖溶于50ml蒸馏水中，待完全溶解后分别加入1.85g三羟甲基胺基甲烷、2.25g柠檬酸，按上述顺序逐一加入，添加时待先加入的试剂完全溶解后再加入后一种，溶解后把三种制剂相混合，然后加入10万单位青霉素或庆大霉素，最后蒸馏水定容100ml，定容后pH值为6.60，渗透压为325mOsmo/L，放入5℃冰箱保存。所有制备过程均在无菌条件下进行。该配方对犬类精液超低温冷冻保存时抗低温损伤的效果极佳。使用时按1∶3比例与犬类精液相混合，同时要保持防冻液的温度与待冷冻精液温度相同。
使用按实施例3方法制备的防冻液，应用与犬类精液超低温冷冻时，测定冷冻精子复苏后冻融精子的存活时间、精子活力(采用相差显微镜检测精子活力)、精子质膜完整率及顶体完整率(CTC-Hoechst 33258活体荧光染料联合染色法检测精子顶体完整率)。结果表明22℃条件下冻融精子的存活时间为55小时、保存4小时后冻融精子活力为0.20、精子质膜完整率平均为32％，顶体完整率为51％；利用该冻精(冷冻复苏后0.5小时)人工输精繁殖母犬受孕率为83.4％。
实施例3(防冻液3)先称取0.05g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于10.0ml蒸馏水中，使其完全溶解。然后分别量取20.0mL卵黄、6.0mL甘油、0.70mL氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP)并将三者均匀混合。然后称取2.65g果糖溶于50ml蒸馏水中，待完全溶解后分别加入1.15g三羟甲基胺基甲烷、0.95g柠檬酸，按上述顺序逐一加入，添加时待先加入的试剂完全溶解后再加入后一种，溶解后把三种制剂相混合，然后加入10.0万单位青霉素或庆大霉素，最后蒸馏水定容100ml，定容后pH值为6.85，渗透压为335mOsmo/L，放入5℃冰箱保存。所有制备过程均在无菌条件下进行。该配方对犬类精液超低温冷冻保存时抗低温损伤的效果极佳。使用时按1∶3比例与犬类精液相混合，同时要保持防冻液的温度与待冷冻精液温度相同。
使用按实施例2方法制备的防冻液，应用与犬类精液超低温冷冻时，测定冷冻精子复苏后冻融精子的存活时间、精子活力(采用相差显微镜检测精子活力)、精子质膜完整率及顶体完整率(CTC-Hoechst 33258活体荧光染料联合染色法检测精子顶体完整率)。结果表明22℃条件下冻融精子的存活时间为58小时、冻融精子活力为0.52、精子质膜完整率平均为58％，顶体完整率为63％。
实施例4(防冻液4)先称取2.18g果糖溶于50ml蒸馏水中，待完全溶解后分别加入1.14g柠檬酸、1.65g三羟甲基胺基甲烷，按上述顺序逐一加入，添加时待先加入的试剂完全溶解后再加入后一种，溶解后混合均匀并放入5℃冰箱保存，使用时取出并调整至所要保存精液的温度或者人工输精的温度。称取0.05g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于调整好温度的防冻液中。然后分别量取20mL卵黄、4mL甘油、1.00mL氨基-钠-十二烷基硫酸酯(OEP)并将三者均匀混合。把上述两种制剂相混合，最后加入10万单位青霉素或庆大霉素，最后蒸馏水定容100ml，定容后pH值为6.75，渗透压为315mOsmo/L。所有制备过程均在无菌条件下进行。该配方对犬类精液超低温冷冻保存时抗低温损伤的效果极佳。使用时按1∶3比例与犬类精液相混合，同时要保持防冻液的温度与待冷冻精液温度相同。
使用按实施例4方法制备的防冻液，应用与犬类精液超低温冷冻时，测定冷冻精子复苏后冻融精子的存活时间、精子活力(采用相差显微镜检测精子活力)、精子质膜完整率及顶体完整率(CTC-Hoechst 33258活体荧光染料联合染色法检测精子顶体完整率)。结果表明39℃条件下冻融精子的存活时间为46小时、保存4小时后冻融精子活力为0.18、精子质膜完整率平均为27％，顶体完整率为46％；利用该冻精(冷冻复苏后0.5小时)人工输精繁殖母犬受孕率为86.1％。
权利要求
1.一种犬类精子超低温冷冻保存防冻液，其特征在于由氨基-钠-十二烷基硫酸酯0.05～2.50毫升、N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.01～0.10克、果糖0.45～3.10克、柠檬酸0.50～2.30克、三羟甲基胺基甲烷1.10～3.90克、卵黄15.0～30.0毫升、甘油或二甲基亚砜2.0～8.0毫升、杀菌剂1000UI/毫升，加蒸馏水至100毫升配制而成，防冻液的pH值为6.25～6.95，渗透压为300～350mOsmo/L。
2.根据权利要求1的犬类精子超低温冷冻保存防冻液，其特征在于由氨基-钠-十二烷基硫酸酯0.50毫升、N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.06克、果糖1.20克、柠檬酸1.65克、三羟甲基胺基甲烷3.15克、卵黄20.0毫升、甘油3.0毫升、杀菌剂1000UI/毫升，加蒸馏水至100毫升配制而成，防冻液的pH值为6.65，渗透压为320mOsmo/L。
3.根据权利要求1的犬类精子超低温冷冻保存防冻液，其特征在于由氨基-钠-十二烷基硫酸酯0.75毫升、N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.05克、果糖1.68克、柠檬酸2.25克、三羟甲基胺基甲烷1.85克、卵黄20.0毫升、二甲基亚砜4.0毫升、杀菌剂1000UI/毫升，加蒸馏水至100毫升配制而成，防冻液的pH值为6.60，渗透压为325mOsmo/L。
4.根据权利要求1或2或3的犬类精子超低温冷冻保存防冻液，其特征在于所述杀菌剂为青霉素或者庆大霉素。
全文摘要
本发明涉及一种犬类精子超低温冷冻保存防冻液，属于动物繁殖技术领域。由氨基－钠－十二烷基硫酸酯(OEP)0.05～2.50毫升、N－乙酰基－D－葡萄糖胺0.01～0.10克、果糖0.45～3.10克、柠檬酸0.50～2.30克、三羟甲基胺基甲烷1.10～3.90克、卵黄15.0～30.0毫升、甘油或二甲基亚砜2.0～8.0毫升、青霉素或者庆大霉素杀菌剂1000UI/毫升，加蒸馏水至100毫升配制而成，防冻液的pH值为6.25～6.95，渗透压为300～350mOsmo/L。本发明的防冻液能够有效延长犬类精子超低温冷冻保存的存活时间，提高犬类冻融精子的活力、质膜完整性及顶体完整性，提高冻精人工输精的受孕率。
文档编号A61K35/48GK1775020SQ200510111520
公开日2006年5月24日 申请日期2005年12月15日 优先权日2005年12月15日
发明者李新红 申请人:上海交通大学