专利名称：负载碱性抗肿瘤药物的高分子纳米粒子的制作方法
技术领域：
本发明涉及高分子纳米抗肿瘤药物，特别涉及负载碱性抗肿瘤药物的高分子纳米粒子。
背景技术：
恶性肿瘤的pH依赖性生理性耐药已被发现，但没有受到重视和运用。其产生机理如说明书图I所示，现简述如下细胞的pH值分为细胞内pH值(intracellular pH, pHi)和细胞外pH值(extracellular pH, pHe)两部分。正常组织细胞的细胞外pH值一般在7. 4左右，pHi与 pHe相近或略低。而由于恶性肿瘤的代谢特点,在肿瘤细胞中,pHe <pHi,胞内-胞外pH梯度与正常组织相反。对弱碱性药物而言，当环境PH值低于药物的pKa值时，弱碱性药物的[or]被环境中的氢离子中和，在肿瘤细胞外倾向于解离为质子化(即带正电荷)的形式，难于穿过细胞膜而堆积于细胞外，在这种情况下，即使抗肿瘤药物在肿瘤组织的局部聚集，也难以在细胞内达到高浓度，从而引起耐药；受到PIPDR影响的，主要是Pka > 7. 4的弱碱性药物，包括化疗药物中的阿霉素类、紫杉类、长春碱类以及具有抗肿瘤作用的生物碱类中药单体。在本发明之前，尚缺乏有效的方法逆转pH依赖性生理性耐药。目前，仅有两种方法被报道在实验中可逆转PH依赖性生理性耐药。简述如下1、质子泵抑制剂通过抑制Na+-H+-APT酶部分逆转肿瘤细胞内外反常pH梯度；2、碳酸氢钠作为强碱性药物，可直接提高细胞外PH值。但现有的这两种方法都存在着以下共同缺陷1、对于细胞内外PH值的调控无特异性(既改变肿瘤组织的PH值，亦改变非肿瘤组织的pH值)，这导致了在动物实 验中，两种方法都存在不可忽视的副作用，副作用的产生，与上述药物缺乏特异性，干扰生物体内环境有夫；根据申请人的相关研究，对生物体内环境的改变，甚至可能因为内环境紊乱干扰生物体的正常代谢及免疫机能，反而降低抗肿瘤药物的效果；2、动物实验的药物剂量換算到人，均明显高于临床常用剂量(数十倍至数百倍)。因此，目前均尚无临床应用的数据，来支持或证明其在临床常用剂量下是否有效。到目前为止，上述两种方法因为以上原因，都未正式应用到临床中。对于逆转pH依赖性生理性耐药，可以说至今无令人满意的方法和效果。

发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制负载碱性抗肿瘤药物的高分子纳米粒子。本发明的技术方案是负载碱性抗肿瘤药物的高分子纳米粒子，其主要技术特征在于构成纳米粒子的高分子材料具有生物可相容性及生物可降解性，高分子材料负载碱性抗肿瘤药物；所述高分子材料包括脂质体、聚乳酸、聚乳酸-羟基こ酸共聚物、聚己内酷、壳聚糖、白蛋白、环糊精；所述碱性抗肿瘤药物是为PKa > 7. 4的小分子抗肿瘤药物，包括阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春新碱、拓扑替康、生物碱类中药单体。本发明的优点和效果在于1、高分子纳米粒子逆转pH依赖性生理性耐药有效；2、高分子纳米粒子逆转pH依赖性生理性耐药不依赖于其他药物的辅助；3、高分子纳米粒子的应用，并不改变肿瘤或非肿瘤组织的局部PH值，因此并不导致不可耐受的副作用；pH依赖性生理性耐药广泛存在于几乎所有肿瘤组织，特别是肿瘤体积/负荷较大时(晚期肿瘤)，因此，高分子纳米粒子的应用，可以提高大多数肿瘤化疗的疗效。本发明的效果还在于利用高分子纳米粒子逆转pH依赖性生理性耐药，也与目前现存的方法有着本质的区別，即并不引入附加药物，对生物体内环境的影响小；通过高分子纳米粒子逆转PH依赖性生理性耐药，不仅有效，而且由于对生物体的内环境不造成影响，因此，使用安全，副作用小，应用范围广。·本发明的其他具体优点和效果将在下面继续说明。


图I—pH依赖性生理性耐药的产生过程示意图。图2——高分子纳米粒子逆转pH依赖性生理性耐药过程示意图。图3——mPEG-PCL高分子纳米粒子逆转汉防己甲素(Tet)的PIPDR示意图，其中a指Tet裸药的情况，b则指Tet纳米粒子(记作Tet-ΝΡ)的情况。细胞外pH(pHe)在图中标出，横坐标为Tet的浓度,纵坐标为细胞的活力，细胞活力越低,提示药物的抗肿瘤活性约高)。图4——Tet裸药及Tet-NP的抗肿瘤效果比较示意图(两种逆转pH依赖性生理性耐药方法的效果的比较)。
具体实施例方式如图I、图2、图3、图4所示为了逆转pH依赖性生理性耐药(图I)采用负载碱性抗肿瘤药物的抗肿瘤高分子纳米粒子。所采用的纳米粒子具有如下特点为生物可相容性及生物可降解性的高分子材料构成，可在水溶液中构成稳定的，粒径IOOOnm以下的粒子、可负载小分子药物。可用于构成纳米粒子的高分子材料包括并不仅包括脂质体(liposome)、聚乳酸(Poly(lacticacid), PLA)、聚乳酸-轻基こ酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)、聚己内酉旨(Polycaprolactone, PCL)、壳聚糖(chitosan)、环糊精(Cyclodextrin)等，以及上述高分子经其他高分子修饰后形成的复合高分子，作为修饰分子的高分子包括并不仅包括聚こニ醇(Polyethylene glycol, PEG)、单甲氧基聚こニ醇(Methoxy polyethyleneglycol, mPEG)、聚N-异丙基丙烯酰胺poly (N-isopropylacrylamide)、聚こ烯基卩比咯烧酮(Polyvinylpyrrolidone,PVP)等。就目前已经投入临床使用/临床试验的高分子纳米材料而言，指所有FDA已批准适用于临床的抗肿瘤纳米药物，包括并不仅包括脂质体、白蛋白、环糊精、PEG-PCL等。所负载的药物为pKa >7.4的具有抗肿瘤活性的药物，包括并不仅包括阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春新碱、拓扑替康、生物碱类中药单体等。纳米粒子的构建方法包括并不仅包括纳米沉淀法、乳化法、等电点法、各商品化的纳米粒子所采用的特定负载方法等。高分子纳米材料负载碱性药物后构成纳米粒子。纳米粒子进入细胞的方式与小分子药物不同后者一般通过扩散进入细胞(图2下部，点状图形示小分子药物)，而纳米粒子则多经过细胞摄取(endocytosis)进入细胞内(图2下部，同心圆状图形示纳米粒子)。因此，将弱碱性化疗药物负载于高分子纳米粒子，在细胞外的低PH环境下，药物与外界酸性环境不直接接触，不会发生解离。纳米粒子进入细胞后，其内的药物在细胞质中缓慢释放(图2下部，肿瘤细胞中，点状的药物从同心圆，即納米粒子中释放)。由于肿瘤细胞的pHi为中性偏碱(PH7. 4)，则药物可以保持其非电离(活性)形式，发挥抗肿瘤作用(见图2，载药纳米粒子进入肿瘤细胞的数量明显多于小分子药物)。因此，由于弱碱性药物在肿瘤细胞外发生质子化而导致的PH依赖性生理性耐药现象(图I所示)可得到逆转。本发明中所涉及的负载碱性药物的高分子纳米粒子，是ー种复合物。指高分子 纳米粒子通过一定的负载方式，将碱性药物负载于纳米粒子中而形成的复合物。在纳米粒子的构成上，通常为先合成构成纳米粒子的高分子载体，然后通过一定的负载方式，将碱性药物负载入载体，构成纳米粒子。故涉及到三个部分1、高分子纳米粒子；2、所负载的药物；3、负载方法。高分子纳米粒子系指粒子直径(粒径)在I-IOOOnm范围内的高分子粒子，其构成材料为具有生物相容性的高分子材料，可在水溶液中构成稳定的，粒径IOOOnm以下的粒子、可负载小分子药物。包括并不仅包括脂质体(liposome)、聚乳酸(Poly (lacticacid), P LA)纳米粒子、聚乳酸-轻基こ酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid),PLGA)纳米粒子、聚己内酯(Polycaprolactone, PCL)纳米粒子、壳聚糖(chitosan)纳米粒子、环糊精(Cyclodextrin)纳米粒子等，以及上述高分子经其他高分子修饰后形成的复合高分子，修饰的高分子包括并不仅包括聚こニ醇(Polyethylene glycol, PEG)、单甲氧基聚こニ醇(Methoxy polyethylene glycol, mPEG)、聚N-异丙基丙烯酰胺，poly (N-isopropylacrylamide)、聚こ烯基卩比咯烧酮(Polyvinylpyrrolidone, PVP)等。就目前已经投入临床使用/临床试验的高分子纳米粒子而言，指所有FDA已批准适用于临床的抗肿瘤纳米药物，包括并不仅包括脂质体阿霉素(Doxil)、白蛋白-結合型紫杉醇(Abraxane)、环糊精纳米粒子(Cyclosert)等。所负载的药物指碱性抗肿瘤药物药物所谓碱性抗肿瘤药物，指主要是Pka > 7. 4的弱碱性小分子药物，包括并不仅包括化疗药物中的阿霉素类、紫杉类、长春碱类以及具有抗肿瘤作用的生物碱类中药单体(pKa > 7. 4)。负载方法指构成纳米粒子并将药物负载其中的方法，包括并不仅包括纳米沉淀法、乳化法、等电点法、各商品化高分子纳米粒子所采用的药物负载方法等。负载碱性药物的高分子纳米粒子可明显提高碱性抗肿瘤药物的效果。申请人采用自行合成的，具有高度生物相容性的单甲氧基聚こニ醇-聚己内酯(mPEG-PCL)，以乳化法负载生物碱类抗肿瘤中药单体汉防己甲素(Tetradrine, Tet),构成具有稳定性质,粒径286nm左右的纳米粒子(后文中，作Tet-ΝΡ)。如图3所示,通过体外实验发现,当肿瘤细胞的细胞外PH值从7. 4降低到6. 8吋，Tet裸药的抗肿瘤活性明显降低(图3_a)，但对Tet-NP而言，随细胞外PH值的变化，其抗肿瘤活性并不受到明显影响(图3-b)。申请人:还进ー步考察了 Tet-NP的体内抗肿瘤效果(图4)。以荷H22的小鼠作为研究对象，比较了 Tet裸药及Tet-ΝΡ的抗肿瘤效果。同吋，将逆转pH依赖性生理性耐药的方法之一碳酸氢钠(NaHCO3)作为阳性对照。从图4中可以看出，当应用NaHCO3时，Tet的抗肿瘤效果不仅未提高，反而有所降低。分析原因，可能与NaHCO3导致小鼠体内pH值广泛 变化，干扰内环境稳定，导致副作用有夫。而Tet-ΝΡ的应用，由于对小鼠内环境无影响，故而明显逆转PH依赖性生理性耐药，抗肿瘤效果优于Tet裸药。本发明涉及目前可应用的所有负载碱性抗肿瘤药物的纳米粒子，主要应用于体内具有肿瘤负荷的病人(指非辅助性化疗病人，包括新辅助化疗)，特别是对于肿瘤负荷较大的病人、广泛转移的晩期病人，以纳米药物代替普通药物剂型使用。
权利要求
1.负载碱性抗肿瘤药物的高分子纳米粒子，其特征在于构成纳米粒子的高分子材料具有生物可相容性及生物可降解性，高分子材料负载碱性抗肿瘤药物；所述高分子材料包括脂质体、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、壳聚糖、白蛋白、环糊精；所述碱性抗肿瘤药物是为PKa > 7. 4的小分子抗肿瘤药物，包括阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春新碱、拓扑替康、生物碱类中药单体。
2.根据权利要求I所述的负载碱性抗肿瘤药物的高分子纳米粒子，其特征在于高分子材料还包括所述高分子材料经其他高分子修饰后形成的复合高分子；所述作为修饰分子的高分子包括聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮等。
3.根据权利要求I所述的负载碱性抗肿瘤药物的高分子纳米粒子，其特征在于构成纳米粒子的高分子材料的纳米粒子经纳米沉淀法、乳化法、等电点法、各商品化的纳米粒子所采用的特定负载方法得到。
4.根据权利要求I所述的负载碱性抗肿瘤药物的高分子纳米粒子，其特征在于经高分子材料制备的纳米粒子为粒径IOOOnm以下。
全文摘要
本发明涉及负载碱性抗肿瘤药物的高分子纳米粒子。本发明构成纳米粒子的高分子材料具有生物可相容性及生物可降解性，高分子材料负载碱性抗肿瘤药物；所述高分子材料包括脂质体、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、壳聚糖、白蛋白、环糊精；所述碱性抗肿瘤药物是为pKa＞7.4的小分子抗肿瘤药物，包括阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱、长春新碱、拓扑替康、生物碱类中药单体。本发明解决了过去难以逆转pH依赖性生理性耐药的缺陷。本发明不引入附加药物，对生物体内环境的影响小，通过高分子纳米粒子逆转pH依赖性生理性耐药，不仅有效，而且由于对生物体的内环境不造成影响，因此，使用安全，副作用小，应用范围广。
文档编号A61K9/14GK102697735SQ20121020433
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者刘宝瑞, 刘芹, 李茹恬 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院