专利名称：牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗的制备方法。
背景技术：
淋巴囊肿病(Lymphocystis disease，LCD)是困扰水产养殖业多年无法解决的难题之一。其病原体，淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus LCDV)可感染包括牙鲆在内的100余种海淡水鱼类。就牙鲆而言，感染LCDV的病鱼在体表产生大量的瘤状物，严重影响其经济价值，同时该病还可导致养殖牙鲆高达60-70％的死亡率。由于牙鲆是我国海水养殖的主要经济品种，而淋巴囊肿病又具有高流行性的特点，对养殖业造成的经济损失十分巨大。因此，迫切需要有效的药物或疫苗加以防治。
疫苗已被证明是最有效的疾病防治手段之一。经过不断的发展，第三代的亚单位(多肽)疫苗和第四代的核酸疫苗正在逐步替代传统的灭活和减毒疫苗成为疫苗研发的重点。亚单位疫苗目前已在人类的卫生健康体系中得到应用，包括乙肝、流感等病毒性疾病的防治。亚单位疫苗的特点在于安全性好，能有效地诱导机体CD4+T细胞通过Th1途径激活浆细胞的分化与增殖，从而提高体液免疫应答水平。
亚单位疫苗研制的核心在于抗原蛋白的亚单位结构必须保持原有的免疫原性和免疫反应性。已知结构与功能的抗原蛋白数量微乎其微，占据绝大多数的未知抗原蛋白严重制约了亚单位疫苗的研究与开发进度，这是因为蛋白质的分离、纯化和结构功能分析在生命科学已取得巨大突破的今天仍然是一个技术难题，需要耗费大量的时间和人力物力才能解决。相反地，基因/基因组克隆、测序技术的飞速发展为反向的蛋白质功能、结构分析提供了有力的辅助手段。随着海量的核酸数据库以几何级数形式不断地增长，生物信息学作为挖掘序列蕴含信息强有力的工具也应运而生，并正处于高速发展过程中。
本发明利用生物信息学技术推定产生的模拟表位，依据它们的氨基酸序列合成相应模拟表位的多肽，经过与载体的偶联制备出特异性针对牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗。

发明内容
本发明的目的是凭借已有的LCDV-cn保护性抗原核衣壳蛋白和囊膜蛋白的三个模拟表位，构建特异性针对牙鲆淋巴囊肿病的模拟表位多肽疫苗。
本发明的牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗的制备方法是，利用对已知的淋巴囊肿病毒欧洲分离株(LCDV-1)基因组序列所进行的生物信息学分析而得到牙鲆LCDV-cn(淋巴囊肿病毒中国分离株)核衣壳蛋白和囊膜蛋白的3个模拟表位，然后依据模拟表位的氨基酸序列，合成得到相应的3种多肽，经过与蛋白质载体的偶联与纯化，即制备了牙鲆淋巴囊肿病的模拟表位多肽疫苗。进而通过养殖牙鲆的动物实验，验证了多肽疫苗的特异性和保护性。
上述的3个模拟表位序列分别为(文中的氨基酸简称均采用IUPAC标准)29ATKNNMSRTSETDNN，即NH2-Thr-Lys-Asn-Asn-Met-Ser-Arg-Thr-Ser-Glu-Thr-Asp-Asn-Asn-COOH29BCKKNSDSTDC，即NH2-Cys-Lys-Lys-Asn-Ser-Asp-Ser-Thr-Asp-Cys-COOHTK3TNEERRLMGT，即NH2-Thr-Asn-Glu-Glu-Arg-Arg-Leu-Met-Gly-Thr-COOH采用的蛋白质载体为钥孔槭血蓝蛋白(简称为KLH)，也可采用血红蛋白、小牛血清白蛋白等。
本发明所依据的原理如下其一，LCDV-1与LCDV-cn同属虹彩病毒科、淋巴囊肿病毒属，在亲缘关系上具有较高的同源性(已知两种病毒的核衣壳蛋白基因MCP在核酸序列上的同源性为77％)，因此适于进行核酸序列的比较、分析。同时，由于两种病毒侵染的宿主与组织、细胞类似、引起的病理反应和症状也完全相同，两种病毒产生的受体反应与血清免疫反应也是相似的，据此可以推定，两种病毒间存在一致的保护性抗原。鉴于LCDV-1的基因组序列已被测定，利用LCDV-1的基因组序列推断LCDV-cn的保护性抗原及其抗原决定簇因此成为可能。
其二，抗原决定簇(或称表位)是保护性抗原诱导机体产生适应性免疫应答的关键。MHC I、II分子与表位形成的复合体分别为TC和TH所识别，引起细胞因子的分泌、B、T细胞的活化、增殖与分化，最终产生相应的体液和细胞免疫应答。因此，利用表位直接构建多肽疫苗能够诱导机体产生特异性免疫反应。
具体实施例方式
本方法利用经生物信息学分析得到的牙鲆LCDV-cn保护性抗原模拟表位，合成得到与模拟表位序列相一致的多肽，经过与载体蛋白质的偶联和纯化，制备出牙鲆淋巴囊肿病的模拟表位多肽疫苗。具体方法如下
首先选择出牙鲆LCDV-cn保护性抗原模拟表位通过对已知基因组序列的LCDV-1所进行的生物信息学分析，筛选得到LCDV-cn两种保护性抗原核衣壳蛋白和囊膜蛋白的3条模拟表位，即TK3、29A和29B。同时，为了识别不同抗原提呈途径对多肽疫苗可能产生的影响，以及模拟表位多肽疫苗的特异性，分别选取了上述两种保护性抗原模拟表位的参照序列(TK1)和对照序列(TK2、29C)共三条。选取的的模拟表位与参照和对照序列的说明列于下表

然后制备模拟表位多肽疫苗依据上表中所列的全部模拟表位序列和对照与参照序列，通过固相合成法制得了相应的合成多肽6条，即TK1、TK2、TK3与29A、29B和29C，用质谱分析鉴定了合成多肽序列的一致性。
合成多肽通过与载体连接制备得到模拟表位的多肽疫苗，具体方法如下合成多肽与KLH(钥孔槭血蓝蛋白)用PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.2)溶解，浓度均为2mg/ml，等体积混合，逐滴加入等体积的戊二醛(0.25％)，在室温下混匀至少6hr，再用含50mM甘氨酸的PBS对连接产物透析纯化过夜，所得纯化产物即为模拟表位多肽疫苗。
以下，对本发明获得的3种模拟表位多肽疫苗的诱导牙鲆产生细胞和体液免疫应答的效应进行了检测，实验验证如下对纯化的牙鲆LCDV-cn模拟表位多肽疫苗进行了动物实验，以鉴定疫苗的特异性和免疫效应。实验随机选取养殖牙鲆共56条，体重约为250-300g。分为8组，实验组共6组，6种待测多肽疫苗(含参照和对照疫苗，如上表所示)各为8条牙鲆一组。对照设2组，分为每组4条，分别用PBS和等量KLH取代多肽疫苗进行注射。
偶联的多肽疫苗以2mg/ml的浓度每条鱼背部肌肉注射200μl，10天后同样剂量注射进行二次免疫。26天后用纯化的20mg/ml LCDV-cn 200μl/条攻毒28条牙鲆(每组牙鲆取半数，实验组每组4条，对照组每组2条)。56、76天后分别取部分牙鲆轻度麻醉，解剖取鳃、心、头肾、脾四种组织分别用Davidson固定液固定或于RPMI 1640细胞培养液中保存备用。
采血方式为尾部静脉采血，每条鱼0.5ml/次，4℃保存过夜，10000g离心10分钟，收集上清作为牙鲆抗血清。采血时间(初次免疫日期计为d0，即第0天)分别为d-2，d3，d8，d18，d27，d38，d56，d76。
免疫效应评价方法为了检测牙鲆LCDV-cn模拟表位多肽疫苗的免疫效应，分别采用了ELISA(酶联免疫吸附分析法)用于牙鲆抗LCDV-cn IgM的表达水平变化及其特异性检测，MTT法检测细胞因子的表达及淋巴细胞的增殖，免疫组化和免疫印迹用于病毒感染状况与相对保护率的检测。
免疫组化和免疫印迹分析结果表明，攻毒的对照组(KLH、PBS)在鳃、肾组织均产生阳性反应(一抗为兔抗LCDV-cn多抗，效价1∶4000)，而实验组的29B、29A为阴性，TK1/2/3、29C则显示为弱阳性，按照阴性至阳性的递增次序，6种疫苗和对照的结果为29B＜29A＜TK3＜TK1＜TK2＜29C＜KLH＜PBS，相对保护率(四个区域着色点的平均值)依次为96.4％、91.2％、83％、44％、11％、8％、3％，0％。这一结果说明，本发明的模拟表位多肽疫苗(29A、29B和TK3)具有明显的免疫保护作用，同时也说明它们是特异性针对LCDV-cn的疫苗，而非模拟表位序列的对照疫苗基本不具备保护作用。
细胞因子的检测结果表明，攻毒后牙鲆分离出的脾、头肾淋巴细胞经MTT检验，细胞因子的表达水平与淋巴细胞的增殖在实验组的29B、A中最高，分别为0.445±0.067和0.395±0.059(均为OD570-OD630所得值，下同)，甚至高于PHA刺激的阳性对照(0.267±0.081)，其余依次为TK3(0.227±0.051)、TK1(0.098±0.043)、TK2(0.046±0.038)和29C(0.024±0.030)，对照组分别为KLH(0.040+0.037)、PBS(0.018±0.017)。概括起来，依照阳性递减的次序，其结果为29B＞29A＞PHA＞TK3＞TK1＞KLH＞29C＞PBS。由此结果可以看出，经过多肽的刺激，免疫后的牙鲆淋巴细胞能够特异性地识别抗原并产生强烈的细胞增殖反应并提高细胞因子的表达水平，而淋巴细胞基本不能将对照疫苗作为特异性抗原加以识别，其增殖与表达水平仅与非特异性的KLH相当。
抗体水平的检测结果如下(下述均为OD495光密度值)，免疫前的牙鲆体内检测不到抗LCDV-cn的抗体存在，抗体水平也较低，各组的平均值分别为0.053±0.037(病毒包被，二抗采用兔抗牙鲆IgM的多抗，效价1∶2000)和0.107±0.087(牙鲆抗血清包被，总蛋白50μg/ml，二抗为兔抗牙鲆IgM的多抗，效价1∶2000)。免疫后第8天的抗体水平(除PBS对照组外0.062±0.044)具有提高，平均为0.207±0.112。但是，其中仅有29A、29B免疫牙鲆所产生的抗体具有中和LCDV-cn活性，其特异性抗体表达水平分别为0.097+0.043和0.112±0.047(病毒包被)，其余实验组(包括KLH对照组)均产生各自免疫原的抗体，各组平均为0.107±0.085(实验组多肽包被，对照组KLH包被)。
第18天(二次免疫后8天)和第38天(攻毒后3天)出现两次高峰，两次的抗体水平分别为0.479±0.102(实验组+KLH对照组平均值)和0.761±0.243(攻毒组平均值)。其中，只有29A和29B产生特异性抗体，分别为0.385±0.079/0.789±0.153与0.482±0.094/0.906±0.183(29A、29B的第18/38天抗体检测值)。此后，29A、29B攻毒组的抗体水平急剧下降，至d76降至0.142±0.056，其余各组则基本维持在较稳定的水平，约为0.351±0.120，并且在攻毒组中(除29A、29B外)，在d56、d76均能检测到牙鲆抗LCDV-cn的抗体，其均值为0.122±0.063。
上述抗体检测结果表明，模拟表位多肽疫苗29A和29B能够诱导B细胞的增殖、分化，产生特异性的体液免疫应答，并引起免疫记忆效应，从而有效提高牙鲆对LCDV-cn的免疫预防能力。
因此，本发明制得的3种模拟表位多肽疫苗的免疫效应检测结果呈现出高度的一致，说明本发明采用的生物信息学设计的模拟表位具有强免疫原性和免疫反应性，并据此构建出的多肽疫苗能够诱导牙鲆产生特异性的体液和细胞免疫应答，同时也可提供较高的相对保护率。此外，模拟表位多肽疫苗与对照疫苗免疫效应的对比结果还证明，本发明的模拟表位与LCDV-cn保护性抗原核衣壳蛋白和囊膜蛋白的抗原决定簇是一致的。基于上述，本发明中的三种模拟表位多肽疫苗(29A、29B和TK3)能够起到有效的免疫预防与保护作用。
本方法制备简便。与灭活疫苗不完善的免疫作用不同，模拟表位多肽疫苗能够有效诱导机体产生全面的细胞和体液免疫应答；而与减毒疫苗相比，多肽疫苗又具有很高的安全性，因此，本方法制备的疫苗能够作为综合了传统减毒、灭活疫苗的优势而产生的替代品。
权利要求
1.牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗的制备方法，首先对已知的淋巴囊肿病毒欧洲分离株基因组序列所进行的生物信息学分析而得到牙鲆淋巴囊肿病毒中国分离株核衣壳蛋白和囊膜蛋白的3个模拟表位，然后依据模拟表位的氨基酸序列，合成得到相应的3种多肽，经过与蛋白质载体的偶联与纯化，即制备了牙鲆淋巴囊肿病的模拟表位多肽疫苗。
2.如权利要求1所述的牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗的制备方法，其特征在于上述的3个模拟表位序列分别为29ANH2-Thr-Lys-Asn-Asn-Met-Ser-Arg-Thr-Ser-Glu-Thr-Asp-Asn-Asn-COOH29BNH2-Cys-Lys-Lys-Asn-Ser-Asp-Ser-Thr-Asp-Cys-COOHTK3NH2-Thr-Asn-Glu-Glu-Arg-Arg-Leu-Met-Gly-Thr-COOH。
3.如权利要求1所述的牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗的制备方法，其特征在于所述的蛋白质载体为钥孔槭血蓝蛋白。
4.如权利要求1所述的牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗的制备方法，其特征在于所述的蛋白质载体为血红蛋白、小牛血清白蛋白。
全文摘要
一种牙鲆淋巴囊肿病的多肽疫苗的制备方法，首先对已知的淋巴囊肿病毒欧洲分离株基因组序列所进行的生物信息学分析而得到牙鲆淋巴囊肿病毒中国分离株核衣壳蛋白和囊膜蛋白的3个模拟表位，然后依据模拟表位的氨基酸序列，合成得到相应的3种多肽，经过与蛋白质载体的偶联与纯化，即制备了牙鲆淋巴囊肿病的模拟表位多肽疫苗。本方法制备简便、疫苗能够有效诱导产生全面的细胞和体液免疫应答，还具有很高的安全性。上述的3个模拟表位序列分别为TKNNMSRTSETDN、CKKNSDSTD和TNEERRLMGT。采用的蛋白质载体为钥孔槭血蓝蛋白，也可采用血红蛋白、小牛血清白蛋白等。
文档编号A61P31/12GK1785425SQ20051010431
公开日2006年6月14日 申请日期2005年10月18日 优先权日2005年10月18日
发明者吴谡琦, 孙修勤, 张进兴, 郑凤荣, 洪旭光, 曲凌云 申请人:国家海洋局第一海洋研究所