专利名称：一种可溶性酵母葡聚糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及葡聚糖技术领域，尤其是涉及一种制备可溶性酵母葡聚糖的方法。
背景技术：
酵母β -D-葡聚糖(简称酵母β -葡聚糖或酵母葡聚糖)是一种拥有良好生理功能的免疫调节剂(非特异性免疫增强剂)，具有增强免疫力、抗肿瘤、抗菌消炎、抗氧化、促进伤口愈合、抗辐射、降低血脂等生理功效，但是它不溶于水和绝大多数其它溶剂，仅微溶于二甲亚砜，这严重限制了酵母葡聚糖的应用。为了提高酵母葡聚糖的溶解度，国内外学者对其进行了修饰和改性研究，包括化 学方法和物理方法。主要的化学修饰法有磷酸化、羧甲基化、硫酸酯化和磺基化修饰,通过在葡聚糖上连接这些极性基团来增加其溶解度。但是这类反应通常都要在液态均相或非均相体系中进行，需要消耗大量的溶剂，甚至是不安全有机溶剂以及酸、碱等，不仅成本高、污染严重，还可能造成安全隐患。主要的物理方法为超声解聚和氧化降解法，通过降低葡聚糖的分子量来增加其溶解度。但是超声解聚只能降低葡聚糖的分子量到一个极限恒定值，而氧化降解则会在葡聚糖中引入氧化剂等杂质。

发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种可溶性酵母葡聚糖的制备方法。采用本方法制备的酵母葡聚糖可以有效溶于水中，并具有优良的免疫活性，同时本方法具有简便、快速、高效、不使用有机溶剂和强酸、强碱试剂的特点。本发明的技术方案如下
一种可溶性酵母葡聚糖的制备方法，采用机械化学方法，在固相体系中，通过固态化学反应对酵母葡聚糖进行化学修饰和改性。具体过程如下
(1)将粉末状酵母葡聚糖原料与固态小分子修饰试剂按质量比I:f10混合好后，采用机械化学方法处理4飞Omin ；
(2)将步骤(I)处理后得到的葡聚糖混合物溶于水中得到溶解液，葡聚糖混合物与水的质量比为1:5 20 ;如果产生沉淀，则通过离心除去不溶物，从而得到溶解液；
(3)对步骤(2)得到的溶解液进行透析或超滤，除去多余的修饰试剂，得到酵母葡聚糖溶液。将步骤(3)所得酵母葡聚糖溶液进行浓缩后，可以得到酵母葡聚糖浓缩液；将步骤(3)所得酵母葡聚糖溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥后，可以得到酵母葡聚糖干粉。所述机械化学方法为行星式球磨。所述固态小分子修饰试剂包括硫酸盐、磷酸化合物或氯乙酸盐。制得的酵母葡聚糖的化学修饰度，即磷酸基团、硫酸基团或羧甲基基团的取代度为O. 4 60%。所述硫酸盐包括且不限于硫酸铵、硫酸铜、硫酸钙、硫酸钾、硫酸钠、硫酸铝钾；磷酸化合物包括且不限于磷酸钙、次磷酸钙、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸式焦磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、焦磷酸钠、聚偏磷酸钾、多聚磷酸、多聚磷酸钠；氯乙酸盐包括且不限于一氯乙酸钠、二氯乙酸钠。本发明有益的技术效果在于
本发明制备方法属于机械化学方法，机械化学是一种不同于热化学、电化学和光化学的第四种化学活化形式，是指固体颗粒物质在摩擦、碰撞、冲击、剪切等机械力作用下，使晶体结构及物化性能发生改变，把机械能高效转化成固体物质内能，提高固体物质化学活性，反应过程只需低反应温度和较低的能量消耗，并且可以实现清洁生产。本发明采用行星式球磨(简称为行星磨)，在固态体系中对酵母葡聚糖进行修饰和改性，从而达到快速、高效的酵母β-葡聚糖增溶效果，提高它们的生物活性。本发明不使用有机溶剂和强酸、强碱试剂，几乎没有污染，制得的酵母β -葡聚糖能够完全溶于水，且具有优良的免疫活性，因此有望有效地应用于食品、保健品、医药、饲料等行业中，提升酵母
葡聚糖作为生物免疫调节剂的应用价值。
具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。以下实施例中所用酵母葡聚糖原料为上海杰康诺生物科技有限公司生产的酵母β _匍聚糖GNP-80。实施例I :机械化学法制备磷酸化酵母葡聚糖方案I
酵母葡聚糖与磷酸钙以质量比1:1混合均匀后，采用行星磨进行机械化学处理，功率为900 W，处理时间为4 min;处理后的酵母葡聚糖混合物以质量比1:5溶解于水后，使用离心机在4000 rpm转速下离心20 min，其中42%的酵母葡聚糖溶于水，58%的酵母葡聚糖不溶于水；将溶于水的溶解液用水进行多次透析，以除去多余的磷酸化合物。透析后的酵母葡聚糖浓度为12. I mg/ml，磷酸基团取代度为O. 4%。实施例2 :机械化学法制备硫酸化酵母葡聚糖方案I
酵母葡聚糖与硫酸钠以质量比1:6混合均匀后，采用行星磨进行机械化学处理，功率为900 W，处理时间为12 min ;处理后的酵母葡聚糖混合物以质量比1:5溶解于水后，使用离心机在4000 rpm转速下离心20 min，其中36%的酵母葡聚糖溶于水，64%的酵母葡聚糖不溶于水；将溶于水的溶解液用水进行多次透析，以除去多余的硫酸盐。透析后的酵母葡聚糖浓度为8. 8 mg/ml，硫酸基团取代度为I. 9%。实施例3 :机械化学法制备硫酸化酵母葡聚糖方案2
酵母葡聚糖与硫酸铵以质量比1:6混合均匀后，采用行星磨进行机械化学处理，功率为1200 W，处理时间为16 min ;处理后的酵母葡聚糖混合物以质量比1:20溶解于水中，使用离心机在4000 rpm转速下离心20 min后没有沉淀；将溶解液用水进行多次透析，以除去多余的硫酸盐。透析后的酵母葡聚糖浓度为6. O mg/ml,硫酸基团取代度为6. 6%。将透析后的酵母葡聚糖经O. 22 μ m滤膜过滤除菌，再稀释至合适浓度后进行小鼠脾淋巴细胞增殖实验。结果显示，浓度为50 g/ml时对小鼠脾淋巴细胞的增殖率为117. 7%，浓度为200 g/ml时增殖率为196. 6%，说明硫酸化酵母葡聚糖对小鼠脾淋巴细胞具有刺激增殖作用。实施例4 :机械化学法制备磷酸化酵母葡聚糖方案2酵母葡聚糖与焦磷酸钠以质量比1:6混合均匀后，采用行星磨进行机械化学处理，功率为1200 W，处理时间为20 min ;处理后的酵母葡聚糖混合物以质量比1:20溶解于水中，使用离心机在4000 rpm转速下离心20 min后没有沉淀；将溶解液用水进行多次透析，以除去多余的磷酸盐。透析后的酵母葡聚糖浓度为20. 6 mg/ml，磷酸基团取代度为1.4%。将透析后的酵母葡聚糖经O. 22 μ m滤膜过滤除菌，再稀释至合适浓度后进行小鼠脾淋巴细胞增殖实验。结果显示，浓度为50 g/ml时对小鼠脾淋巴细胞的增殖率为121. 8%，浓度为200 g/ml时增殖率为123. 8%，说明磷酸化酵母葡聚糖对小鼠脾淋巴细胞具有刺激增殖作用。实施例5 :机械化学法制备羧甲基化酵母葡聚糖方案I
酵母葡聚糖与一氯乙酸钠试剂以质量比1:4混合均匀后，采用行星磨进行机械化学处理，功率为1200 W，处理时间为16 min ;活化后的酵母葡聚糖混合物以质量比1:20溶解于水中，使用离心机在4000 rpm转速下离心20 min后没有沉淀；将溶解液用水进行多次透 析，以除去多余的小分子盐类。透析后的酵母葡聚糖浓度为24. 8 mg/ml，羧甲基取代度为2. 0%。将透析后的酵母葡聚糖经O. 22 μ m滤膜过滤除菌，再稀释至合适浓度后进行小鼠脾淋巴细胞增殖实验。结果显示，浓度为50 g/ml时对小鼠脾淋巴细胞的增殖率为120. 4%，浓度为200 g/ml时增殖率为215. 0%，说明羧甲基化酵母葡聚糖对小鼠脾淋巴细胞具有刺激增殖作用。实施例6 :机械化学法制备羧甲基化酵母葡聚糖方案2
酵母葡聚糖与二氯乙酸钠试剂以质量比1:10混合均匀后，采用行星磨进行机械化学处理，功率为1200 W，处理时间为60 min ;活化后的酵母葡聚糖混合物以质量比1:10溶解于水中，使用离心机在4000 rpm转速下离心20 min后没有沉淀；将溶解液用水进行多次透析，以除去多余的小分子盐类。透析后的酵母葡聚糖浓度为7. 6 mg/ml，羧甲基取代度为59. 8%。上述实施例中，磷酸基团取代度、硫酸基团取代度、羧甲基基团取代度统称为化学修饰度。酵母葡聚糖浓度的测定采用测定植物糖浓度的蒽酮法。磷酸基团取代度的测定采用定磷法测定磷酸化酵母葡聚糖中磷酸基团的摩尔浓度，磷酸化酵母葡聚糖的磷酸基团摩尔浓度与它的葡萄糖基团摩尔浓度之比即为磷酸基团取代度。硫酸基团取代度的测定采用浊度法测定硫酸化酵母葡聚糖中硫酸基团的当量浓度，硫酸化酵母葡聚糖的硫酸基团当量浓度与它的葡萄糖基团摩尔浓度之比即为硫酸基团取代度。硫酸基团的当量浓度测定用3%三氯乙酸将硫酸化酵母葡聚糖中的硫酸基释放出来，与钡离子在明胶中形成浑浊，于波长500nm下测定浊度，以硫酸钾作标准曲线后，计算硫酸化酵母葡聚糖中的硫酸基团含量。羧甲基取代度的测定化学络合滴定法。取I mL羧甲基化酵母葡聚糖溶液，力口50 mL 水，20 mL NH4Cl 缓冲溶液，再用 O. I mol/L HCl 或 O. I mol/L NaOH 将溶液 pH 调至7. 5 8. O。转移至250 mL容量瓶中，加入50 mL CuSO4溶液，摇匀，放置15 min。稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液100 mL，用紫脲酸铵作指示剂，用EDTA标准溶液滴定至终点。相同条件下测硫酸铜溶液空白。羧甲基取代度为162A/(8100-80A)，其中A=C(Ki) X2X0. 162+W，C为EDTA标准溶液的浓度，K为CuSO4空白用去EDTA的体积，K为样品用去EDTA的体积，W为样品中葡聚糖的质量。小鼠脾淋巴细胞增殖率的检测(1)小鼠淋巴细胞的制备将小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗:Γ4次。将脾脏磨碎后过100目筛，过筛后的混悬液以400 rpm离心6min。吸去上清液,沉淀中按每只小鼠I. 5 mL的量加入氯化铵红细胞裂解液,反复冲打,静置10 min后,加PBS至50 mL,然后以400 rpm离心6 min,吸去上清液,加PBS缓冲液冲洗并离心2遍后，吸去上清，加入RPMI1640培养基混匀，用细胞计数仪计数并稀释成2 X IO6个/mL细胞液备用。(2)细胞培养将2X IO6个/mL淋巴细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加180 μ L，同时加入20 μ L样品液，以20 μ L PBS和20 μ L 60 μ g/mL的PHA溶液分别作阴、阳性对照。于37°C、含5%的CO2条件下培养3d。(3)淋巴细胞增殖率的测定在上述细胞培养的96孔板中，每孔分别加入20 μ I 5mg/ml的MTT溶液，继续培养4 h，终止培养，将96孔板于2000 rpm离心6 min,小心吸去孔内培养液,每孔加入150 μ I 二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD57tlnm处测量各孔的吸光值。 同时设置调零孔和对照孔。增殖率(％) = (0D570sample/0D570_tMl) X 100%。以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.ー种可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于采用机械化学方法，在固相体系中，通过固态化学反应对酵母葡聚糖进行化学修饰和改性。
2.根据权利要求I所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于具体过程如下 (1)将粉末状酵母葡聚糖原料与固态小分子修饰试剂按质量比I:f 10混合好后，采用机械化学方法处理4飞Omin ； (2)将步骤(I)处理后得到的葡聚糖混合物溶于水中得到溶解液，葡聚糖混合物与水的质量比为1:5 20 ;如果产生沉淀，则通过离心除去不溶物，从而得到溶解液； (3)对步骤(2)得到的溶解液进行透析或超滤，除去多余的修饰试剂，得到酵母葡聚糖溶液。
3.根据权利要求2所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于将步骤(3)所得酵母葡聚糖溶液进行浓缩后，可以得到酵母葡聚糖浓缩液；将步骤(3)所得酵母葡聚糖溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥后，可以得到酵母葡聚糖干粉。
4.根据权利要求I或2所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于所述机械化学方法为行星式球磨。
5.根据权利要求2所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于所述固态小分子修饰试剂包括硫酸盐、磷酸化合物或氯こ酸盐。
6.根据权利要求I或2所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于制得的酵母葡聚糖的化学修饰度，即磷酸基团、硫酸基团或羧甲基基团的取代度为O. 4飞0%。
7.根据权利要求5所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于所述硫酸盐包括且不限于硫酸铵、硫酸铜、硫酸钙、硫酸钾、硫酸钠、硫酸铝钾； 磷酸化合物包括且不限干磷酸钙、次磷酸钙、磷酸氢ニ铵、磷酸ニ氢铵、磷酸氢钙、焦磷酸钙、磷酸ニ氢钾、磷酸氢ニ钾、酸式焦磷酸钠、磷酸ニ氢钠、磷酸氢ニ钠、磷酸钠、焦磷酸钠、聚偏磷酸钾、多聚磷酸、多聚磷酸钠； 氯こ酸盐包括且不限于ー氯こ酸钠、ニ氯こ酸钠。
全文摘要
一种可溶性酵母葡聚糖的制备方法，采用机械化学方法，在固相体系中，通过固态化学反应对酵母葡聚糖进行化学修饰和改性，具体过程(1)将粉末状酵母葡聚糖原料与固态小分子修饰试剂按质量比1:1~10混合好后，采用机械化学方法处理4~60min；(2)将步骤(1)处理后得到的葡聚糖混合物溶于水中得到溶解液，葡聚糖混合物与水的质量比为1:5~20；如果产生沉淀，则通过离心除去不溶物，从而得到溶解液；(3)对步骤(2)得到的溶解液进行透析或超滤，除去多余的修饰试剂即可。采用本方法制备的酵母葡聚糖可以有效溶于水中，具有优良的免疫活性，本方法具有简便、快速、高效、不使用有机溶剂和强酸、强碱试剂的特点。
文档编号A61P37/02GK102838688SQ201210336178
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者史锋, 李永富, 石纪奎 申请人:江南大学